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Plasmodium vivax: Caracterização Molecular de Recaídas Utilizando um Segmento Polimórfico do Gene MSP1 como Marcador Genético. / "Plasmodium vivax: molecular characterization of relapses using a polymorphic segment of MSP1 gene as genetic marker"Kirchgatter, Karin 09 May 1997 (has links)
Plasmodium vivax é a espécie de malária humana de maior distribuição geográfica, com 35 milhões de casos por ano. No Brasil, é a espécie mais prevalente, sendo responsável por cerca de 70% dos casos de malária. Diferentemente do P. falciparum, o P. vivax apresenta hipnozoítas, formas que se mantêm em estágio dormente no fígado e que, após um período de tempo variável, por mecanismos ainda desconhecidos, causam novo ataque malárico denominado recaída. Para contribuir para um melhor conhecimento acerca das recaídas causadas por P. vivax, neste trabalho foram analisadas amostras pareadas referentes ao ataque primário e à recaída de 10 pacientes que se infectaram na Amazônia Brasileira. Através da amplificação de um segmento polimórfico do gene que codifica a Proteína de Superfície do Merozoíta 1 (PvMSP1), foi encontrado um índice de 40% de infecções mistas, presentes inclusive durante a recaída, indicando que a ativação de hipnozoítas não é clonal. Em análise mais detalhada deste segmento polimórfico, utilizando técnicas de clonagem e sequenciamento, foi possível verificar que a população de parasitas obtida durante o ataque primário é idêntica àquela que surge nas recaídas. O estudo da resposta IgG específica naturalmente adquirida contra a região C-terminal da PvMSP1, a mais imunogênica da molécula, demonstrou, durante a recaída, um aumento nos títulos acompanhado por uma maturação na afinidade destes anticorpos além de um predomínio de IgG1. / Plasmodium vivax is the most widely distributed human malarial parasite causing an estimated 35 million cases annually. In some parts of the world, including Brazil where it reaches almost 70% of malaria cases, this is the most prevalent species. Unlike P. falciparum, P. vivax has hypnozoites, hepatocyte dormant stages that cause clinical and parasitological relapses. Unfortunately, the molecular basis of relapses remain poorly understood. This work compared paired primary attack and relapse samples obtained from 10 infected patients from the brazilian Amazon Region using a polymorphic segment of the gene encoding the Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP1) as a genetic marker. PCR, Southern blot and DNA sequence analysis demonstrated that the parasite population from the primary attack is identical to the one arising during relapses and that the activation of hypnozoites is not clonal; moreover, a large percentage (40%) of mixed infections, were detected. Studies on the naturally acquired human specific IgG response of these patients against the C-terminal region of the PvMSP1 molecule, the most immunogenic region, demonstrated an increase in the titers, affinity maturation and a predominance of the IgG1 subclass during the relapse.
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Plasmodium vivax: Caracterização Molecular de Recaídas Utilizando um Segmento Polimórfico do Gene MSP1 como Marcador Genético. / "Plasmodium vivax: molecular characterization of relapses using a polymorphic segment of MSP1 gene as genetic marker"Karin Kirchgatter 09 May 1997 (has links)
Plasmodium vivax é a espécie de malária humana de maior distribuição geográfica, com 35 milhões de casos por ano. No Brasil, é a espécie mais prevalente, sendo responsável por cerca de 70% dos casos de malária. Diferentemente do P. falciparum, o P. vivax apresenta hipnozoítas, formas que se mantêm em estágio dormente no fígado e que, após um período de tempo variável, por mecanismos ainda desconhecidos, causam novo ataque malárico denominado recaída. Para contribuir para um melhor conhecimento acerca das recaídas causadas por P. vivax, neste trabalho foram analisadas amostras pareadas referentes ao ataque primário e à recaída de 10 pacientes que se infectaram na Amazônia Brasileira. Através da amplificação de um segmento polimórfico do gene que codifica a Proteína de Superfície do Merozoíta 1 (PvMSP1), foi encontrado um índice de 40% de infecções mistas, presentes inclusive durante a recaída, indicando que a ativação de hipnozoítas não é clonal. Em análise mais detalhada deste segmento polimórfico, utilizando técnicas de clonagem e sequenciamento, foi possível verificar que a população de parasitas obtida durante o ataque primário é idêntica àquela que surge nas recaídas. O estudo da resposta IgG específica naturalmente adquirida contra a região C-terminal da PvMSP1, a mais imunogênica da molécula, demonstrou, durante a recaída, um aumento nos títulos acompanhado por uma maturação na afinidade destes anticorpos além de um predomínio de IgG1. / Plasmodium vivax is the most widely distributed human malarial parasite causing an estimated 35 million cases annually. In some parts of the world, including Brazil where it reaches almost 70% of malaria cases, this is the most prevalent species. Unlike P. falciparum, P. vivax has hypnozoites, hepatocyte dormant stages that cause clinical and parasitological relapses. Unfortunately, the molecular basis of relapses remain poorly understood. This work compared paired primary attack and relapse samples obtained from 10 infected patients from the brazilian Amazon Region using a polymorphic segment of the gene encoding the Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP1) as a genetic marker. PCR, Southern blot and DNA sequence analysis demonstrated that the parasite population from the primary attack is identical to the one arising during relapses and that the activation of hypnozoites is not clonal; moreover, a large percentage (40%) of mixed infections, were detected. Studies on the naturally acquired human specific IgG response of these patients against the C-terminal region of the PvMSP1 molecule, the most immunogenic region, demonstrated an increase in the titers, affinity maturation and a predominance of the IgG1 subclass during the relapse.
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Mutações sinônimas e não sinônimas como um dos mecanismos de geração de polimorfismo do antígeno msp1 de plasmodium vivaxEvangelista, Janaína de Araújo 06 May 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011-05-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / subtropical regions of the planet. In North America, Plasmodium vivax is responsible
for the most part of the infections. In 2011, 250,498 cases of malaria fever were
studied; 80% of these cases were caused by Plasmodium vivax.
The purpose of this study was to investigate the diversity generation of the
gene MSP1 from Plasmodium vivax through the analisys of a specific mutation in the
region from the block 2 genetic precombination events.
In order to identify the existing mutations in multiclonal infections and
generation of diversity in PvMSP1 a series of experiments were done, respectively,
the extraction of genomic DNA of the parasite, PCR (polymerase chain reaction)
using specific primers for the block 2, ligation of the fragment to cloning vector (top),
processing using Escherichia coli competent cells, selection of colonies belonging to
the same sample, DNA sequencing and analysis of synonymous and nonsynonymous
mutations as their location in the prediction of B and T cell epitopes (not
synonymous).
The calculation of genetic distance between recombinant clones of the same
sample by the MEGA 4.0 program confirmed the multiclonality of samples. The
alignment of amino acid sequences showed the presence of genetic recombination
events using DNASP program. DNA sequences obtained showed another interesting
result: several synonymous and non-synonymous mutations in a relatively small
stretch of DNA. Genetic diversity showed most mutations are not synonymous, and
that most of them were located in regions referred to as B and T cell epitopes by
BcPred and ProPred.
So, as expected, the genetic diversity based on synonymous mutations and
not synonymous possible sustains the phenomenon of escape on the immunity of the
host. The characterization of these polymorphisms may contribute to immunological
studies aiming at the development of a vaccine against malaria on stages caused by
p. vivax. / A malária é um problema da saúde pública amplamente distribuída nas
regiões tropicais e subtropicais do globo. No continente americano, o Plasmodium
vivax é responsável por maior parte das infecções. No ano de 2011, 250.498 casos
de malária foram observados no estado do Amazonas; 80% destes casos foram
causados por Plasmodium vivax.
O objetivo desse trabalho foi Investigar a geração de diversidade do gene
MSP1 de Plasmodium vivax através da análise de mutações pontuais na região do
bloco 2, eventos de precombinação genética.
Para identificar as mutações existentes nas infecções multiclonais e geração
de diversidade em PvMSP1 realizou-se uma série de experimentos,
respectivamente, a extração de DNA genômico do parasita, PCR (Reação da
Polimerase em Cadeia) utilizando primers específicos para o bloco 2, ligação do
fragmento ao vetor de clonagem ( TOPO), transformação utilizando células de E.coli
competentes , seleção de colônias pertencentes a uma mesma amostra,
seqüenciamento de DNA e análise das mutações não sinônimas e sinônimas
quanto sua localização em regiões de predição de epítopos de células B e T (não
sinônimas).
O cálculo da distância genética entre clones recombinantes de uma mesma
amostra pelo programa MEGA 4.0 confirmou a multiclonalidade das amostras. O
alinhamento das sequências de aminoácidos mostrou a presenção de eventos de
recombinação genética utilizando o programa DNASP. As sequências de DNA
obtidas demonstrou outro resultado interessante: várias mutações sinônimas e não
sinônimas num trecho relativamente pequeno de DNA. A diversidade genética
mostrou mais mutações não sinônimas, sendo que maior parte delas estavam
localizadas em regiões previstas como epítopos das células B e T pelo programa
BcPred e ProPred.
Assim, como esperado, a diversidade genética baseado nas mutações
sinônimas e não sinônimas sustenta o fenômeno de escape sobre a imunidade do
hospedeiro. A caracterização desses polimorfismos poderá contribuir para estudos
imunológicos visando o desenvolvimento de uma vacina contra os estágios
eritrocitários da malária causada por P.vivax.
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Evaluation of the hepatitis B virus particle as a malaria vaccine carrierAdomavicius, Tomas January 2015 (has links)
Malaria is a major health problem and an effective vaccine is essential for the eradication of the disease. Despite extensive efforts, a malaria vaccine remains elusive due to the parasite's complex life cycle, diverse morphology, and immune system evasion mechanisms. Antibodies against C terminal domain of merozoite surface protein 1 (MSP1-19), a highly conserved protein and the main vaccine candidate for blood-stage malaria, can inhibit erythrocyte invasion by the parasite and alleviate the disease symptoms. However, MSP1-19 is poorly immunogenic and classic protein-in-adjuvant MSP1-19-based vaccine formulations failed to induce strong immune responses due to low immunogenicity and generation of ineffective antibodies. The aim of this study was to use hepatitis B virus core (HBc) particles to increase the immunogenicity of MSP1-19. HBc forms particles with protruding spikes and induces a strong and specific immune response against foreign epitopes inserted at the tips of the spikes. In addition, positioning of MSP1-19 on the particle can influence the accessibility of certain antibody binding sites, possibly altering elicited antibody fine specificity and vaccine efficiency. MSP1-19 domain was inserted into the middle of the HBc sequence so that it is displayed at the tips of the HBc particle. Two HBc-MSP1-19 constructs, having different insert flanking linkers, displayed soluble particle formation after bacterial expression and lysis optimization. The particles were purified and the suitability of these two constructs as malaria vaccine candidates was assessed. Firstly, binding of the conformational anti-MSP1-19 antibodies indicated that MSP1-19 domain in the chimeric proteins has the correct disulphide bond pattern which is crucial for the protective properties of an MSP1-19-based vaccine. Furthermore, electron microscopy imaging and determination of initial 3D structures confirmed that both HBc MSP1-19 constructs form particles resembling the wild-type HBc particles, meaning the insertion of MSP1-19 did not heavily distort the overall HBc particle structure. In addition, it was shown that MSP1-19 domains are displayed at the tips of the particle spikes. Particle formation and foreign epitope display are important for the epitope's immunogenicity improvement. The immunogenicity of the chimeric particles was then assessed in mice. Both constructs elicited similar high antibody titres without the use of additional adjuvants, but no difference was observed between the particulate constructs and a non-particulate control (an MSP1-19-based protein). Interestingly, although both HBc-MSP1-19 and non-particulate MSP1-19-elicited antibodies recognized native malarial parasite, only the particulate construct antibodies demonstrated a moderate parasite growth inhibition while the antibodies from the control group did not show parasite inhibition above the background levels. In conclusion, it was shown that MSP1-19 can be expressed in bacteria as a soluble correctly folded protein fused to HBc. More importantly, the fusion protein is capable of forming immunogenic particles which generate antibodies that recognize native MSP1 and inhibit parasite growth more effectively than the protein without the HBc. Therefore, this work lays grounds and supports further chimeric HBc-MSP1-19 research and development.
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Seleção e caracterização de peptídeos recombinantes ligantes a anticorpos monoclonais reativos a proteínas de Anaplasma marginaleCunha, Vanessa Rodrigues Borges da 30 June 2008 (has links)
Bovine anaplasmosis is caused by Anaplasma marginale and A.
centrale. The most pathogenic and important species for cattle production is A.
marginale, and is widely distributed in tropical, subtropical and temperate
regions of the world. A. marginale is an intra-erythrocyte rickettsia of susceptible
ruminants, biological and mechanically transmitted by ticks and hematophagous
insects. The tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of A.
marginale in Brazil. The congenital form of transmission in cattle may occur,
causing the neonatal anaplasmosis. The outer membrane of A. marginale
includes six well characterized major surface proteins, MSP1a, MSP1b, MSP2,
MSP3, MSP4 and MSP5, which play important role in the development of the
immune response of infected animals. In this study, we have used the Phage
Display technology to identify specific peptides that were immunoreactive to
monoclonal antibodies anti-A. marginale proteins. Peptide selection was
performed using a subtractive selection of a peptide library with 12 random
amino acids, Ph.D.-12, expressed on the surface of the M13 filamentous phage
concurrently against the anti-MSP1a and anti-MSP2. After four rounds of
selection and validation by ELISA, the selected peptides have recognized only
the anti-MSP1. Analysis of bioinformatics identified 45 peptides, which showed
the protein consensus sequence STxS that was represented in 78% of selected
phages. Due to the multiple motif repeats found in MSP1 protein, the STSSxL
motif may become an important biological target, with potential use in diagnostic
tests and vaccine for the control of Anaplasma marginale. / Anaplasmose bovina é uma infecção causada por Anaplasma marginale
e A. centrale. A espécie mais patogênica e de maior importância para bovinos é
a A. marginale e está amplamente distribuída nas regiões tropicais,
subtropicais e temperada do mundo. A. marginale é uma rickettsia intraeritrocitária
de ruminantes susceptíveis, transmitido biológica e mecanicamente
por carrapatos e insetos hematófagos. O carrapato Rhipicephalus (Boophilus)
microplus é o principal transmissor de A. marginale no Brasil. A forma
congênita de transmissão em bovinos pode ocorrer, ocasionando a
anaplasmose neonatal. A membrana externa do A. marginale inclui seis
proteínas principais de superfície (MSPs) bem caracterizadas, designadas de
MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4 e MSP5 e desempenham papel
importante no desenvolvimento da resposta imune de animais infectados. Para
o desenvolvimento deste estudo, foi utilizada a técnica de Phage Display para
identificar peptídeos ligantes a anticorpos monoclonais reativos a proteínas de
Anaplasma marginale a partir de bibliotecas de peptídeos recombinantes por
meio da tecnologia Phage Display. Para seleção dos peptídeos foi realizado
uma seleção subtrativa utilizando uma biblioteca de peptídeos com 12
aminoácidos randômicos, Ph.D.-12, expressa na superfície do fago filamentoso
M13 concomitantemente contra os anticorpos anti-MSP1a e anti-MSP2. Após
quatro ciclos de seleção e validação por ELISA, o conjunto de peptídeos
selecionados apresentou ser unicamente reconhecido pelo anticorpo anti-
MSP1. Análises de bioinformática identificaram 45 peptídeos, que
apresentaram o motivo proteico consenso STxS, representado em 78% dos
fagos seqüenciados. Devido aos múltiplos sítios repetidos encontrados na
proteína MSP1, o motivo proteíco STSSxL pode ser um importante alvo
biológico, com potencial utilização em ensaios diagnósticos e vacinais para o
controle de Anaplasma marginale. / Mestre em Genética e Bioquímica
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