El objetivo de este estudio fue detectar la frecuencia de los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) CYP2C8*2 y CYP2C8*3 en genes CYP2C8 de pacientes con cáncer de mama que recibieron quimioterapia neoadyuvante con paclitaxel en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas (INEN). Además, se asoció la presencia de estos SNP con la respuesta terapéutica y la toxicidad. Se incluyó en el estudio 39 mujeres con diagnóstico reciente de cáncer de mama localmente avanzado que acudieron al consultorio de oncología médica del INEN entre marzo y diciembre del 2013, quienes firmaron el consentimiento informado previo a la ejecución del estudio. Se tomaron muestras de sangre venosa para extraer el ADN genómico y se amplificaron regiones específicas del gen CYP2C8 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores diseñados para detectar el SNP CYP2C8*2 en el exón 5 y el SNP CYP2C8*3 en el exón 8. Los productos amplificados fueron cortados con las enzimas de restricción BClI y PdmI (XmnI) para CYP2C8*2 y CYP2C8*3 respectivamente. La información clínica y patológica de las pacientes se obtuvo de las historias almacenadas en el archivo de historias clínicas del INEN mediante una ficha de recolección de datos. El SNP CYP2C8*2 no fue detectado en la población estudiada. El SNP CYP2C8*3 fue encontrado en 3 pacientes (7,7 %), dos homocigotos y un heterocigoto, con una frecuencia alélica de 6,4 %. Así mismo, se encontró que 56,5 % de las pacientes presentó neuropatía; 10,3 % leucopenia; 20,5 % anemia; 2,6 % trombocitopenia; 66,7 % incremento de los niveles de TGP y 46,2 % incremento de los niveles de TGO. No se encontró asociación entre el genotipo CYP2C8*3 y el riesgo de neuropatía inducida por paclitaxel (p>0,05). Las pacientes que presentaron el genotipo AA para el SNP CYP2C8*3 (1196 A>G) mostraron diferencias significativas en la reducción del tamaño clínico del tumor y del compromiso ganglionar después de la quimioterapia con paclitaxel (p<0,05). Sin embargo, las pacientes con los genotipos AG y GG para este SNP, no mostraron diferencias significativas. / --- The aim of this study was to detect the frequency of CYP2C8*2 and CYP2C8*3 single nucleotide polymorphisms (SNP) in CYP2C8 genes of patients with breast cancer who received neoadjuvant chemotherapy with paclitaxel at the National Institute of Neoplastic Diseases (INEN). Furthermore, the presence of these SNP with therapeutic response and toxicity were associated. In the study were included 39 women with newly diagnosed of locally advanced breast cancer who attended the oncology doctor’s office of the INEN between March and December 2013. All the patients signed informed consent before study entry. Venous blood samples were taken to extract the genomic DNA and specific regions of the CYP2C8 gene were amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) with primers designed to detect the CYP2C8*2 SNP in exon 5 and CYP2C8*3 SNP in exon 8. The amplified products were cut with restriction enzymes BclI and PdmI (XmnI) for CYP2C8*2 and CYP2C8*3, respectively. Clinical and pathological information of the patients was obtained from the medical records stored at the INEN. The CYP2C8*2 SNP was not detected in the study population. The CYP2C8*3 SNP was found in 3 patients (7.7%), two homozygotes and one heterozygote, with an allele frequency of 6.4%. Also, it was found that 56.5% of patients had neuropathy; 10.3% leukopenia; 20.5% anemia; 2.6% thrombocytopenia; 66.7% increase in ALT levels and 46.2% increase in AST levels. No association between CYP2C8*3 genotype and risk of paclitaxel induced neuropathy (p> 0.05) was found. The patients who had the AA genotype for CYP2C8*3 (1196 A>G) showed significant differences in the reduction of clinical tumor size and nodal involvement after chemotherapy with paclitaxel (p <0.05). However, patients with AG and GG genotypes for this SNP showed no significant differences. Keywords: Breast cancer, CYP2C8 gene, SNP, PCR-RFLP.

El conocimiento de la estructura de las proteínas constituye una de las principales aproximaciones hacia el entendimiento de las bases moleculares de las enfermedades humanas; en particular, puede ser usada para racionalizar los efectos de muchas mutaciones causantes de enfermedades, que a menudo son asociadas con cambios en la estabilidad de las proteínas. En este trabajo, se estudia el Dominio BRCT, módulo evolutivo de aproximadamente 95 aminoácidos, con plegamiento autónomo, conservado a través de la mayoría de taxas y encontrado en muchas proteínas relacionadas a la reparación del DNA, recombinación y control del ciclo celular. Una de las características conservadas del plegamiento del dominio BRCT es la estructura formada por dos alfa hélices en una región de la molécula, haciendo frente a la hoja plegada ß central, que contiene dos de las mas conocidas mutaciones relacionadas a cáncer de mama, y que resultan en la introducción de un residuo cargado que desestabiliza la interfase del complejo BRCT-BRCT en la proteína BRCA1. Para este trabajo, elegimos probar la estabilidad del BRCT presente en la enzima DNLJ ligasa de una bacteria termófila mediante la remoción de la carga de superficie, “R21”, de esta estructura. Este es un primer paso para evaluar si la carga de superficie contribuye significativamente a la estabilidad de este dominio termofílico, para profundizar en el posible rol de la estabilidad del BRCT en el desarrollo del cáncer de mama, y por encima de todo, para determinar las bases de la estabilidad de este dominio que dada su frecuencia, se constituye en un hecho biológicamente relevante. Los resultados preliminares sugieren que la estabilidad del dominio BRCT de la DNLJ ligasa de Thermus thermophilus, es tolerante a la remoción de cargas en su superficie, pero es afectado por las variaciones en la hidrofobicidad. Aunque estas mutaciones no muestran variaciones significativas en la estructura y la estabilidad del dominio, si podrían estar afectando la habilidad de interactuar con otras proteínas. / The knowledge of protein structure constitutes one of the main approaches towards understanding the molecular basis of human disease, in particular, protein structure can be used to rationalize the effects of many disease-causing mutations, which often are associated with changes of protein stability. In this work, the BRCT domain is studied, an evolutionary protein module with autonomous folding, of approximately 95 aminoacids, found in numerous proteins involved in DNA repair, recombination and cell cycle control. One of the conserved features of the BRCT fold is a two helical bundle located against one side of the central four-stranded ß sheet, which features two of the best known mutations in breast cancer resulting from introducing a distabilizing charge within the interface of the BRCT-BRCT complex in BRCA1. We have chosen to probe the stability of the BRCT of DNLJ ligase in a thermophilic bacteria by removing the surface charge "R21" from this bundle. This is a first step to test whether this surface charge contributes significantly to the stability of this thermophilic domain, to gain insight about the possible role of BRCT stability on the breast cancer disease, and most of all, to determine the basis for the stability of this frequently found and biologically relevant structural domain. Our preliminar results suggest that the stability of the BRCT of the DNLJ ligasa of Thermus thermophilus BRCT domain is tolerant to the surface charge removal, but is affected by hydrophobicity. Although these mutations do not show significant variations in the structure and stability of the domain itself, they may affect their ability to interact with other protein modules.

El conocimiento de la estructura de las proteínas constituye una de las principales aproximaciones hacia el entendimiento de las bases moleculares de las enfermedades humanas; en particular, puede ser usada para racionalizar los efectos de muchas mutaciones causantes de enfermedades, que a menudo son asociadas con cambios en la estabilidad de las proteínas. En este trabajo, se estudia el Dominio BRCT, módulo evolutivo de aproximadamente 95 aminoácidos, con plegamiento autónomo, conservado a través de la mayoría de taxas y encontrado en muchas proteínas relacionadas a la reparación del DNA, recombinación y control del ciclo celular. Una de las características conservadas del plegamiento del dominio BRCT es la estructura formada por dos alfa hélices en una región de la molécula, haciendo frente a la hoja plegada ß central, que contiene dos de las mas conocidas mutaciones relacionadas a cáncer de mama, y que resultan en la introducción de un residuo cargado que desestabiliza la interfase del complejo BRCT-BRCT en la proteína BRCA1. Para este trabajo, elegimos probar la estabilidad del BRCT presente en la enzima DNLJ ligasa de una bacteria termófila mediante la remoción de la carga de superficie, “R21”, de esta estructura. Este es un primer paso para evaluar si la carga de superficie contribuye significativamente a la estabilidad de este dominio termofílico, para profundizar en el posible rol de la estabilidad del BRCT en el desarrollo del cáncer de mama, y por encima de todo, para determinar las bases de la estabilidad de este dominio que dada su frecuencia, se constituye en un hecho biológicamente relevante. Los resultados preliminares sugieren que la estabilidad del dominio BRCT de la DNLJ ligasa de Thermus thermophilus, es tolerante a la remoción de cargas en su superficie, pero es afectado por las variaciones en la hidrofobicidad. Aunque estas mutaciones no muestran variaciones significativas en la estructura y la estabilidad del dominio, si podrían estar afectando la habilidad de interactuar con otras proteínas. / The knowledge of protein structure constitutes one of the main approaches towards understanding the molecular basis of human disease, in particular, protein structure can be used to rationalize the effects of many disease-causing mutations, which often are associated with changes of protein stability. In this work, the BRCT domain is studied, an evolutionary protein module with autonomous folding, of approximately 95 aminoacids, found in numerous proteins involved in DNA repair, recombination and cell cycle control. One of the conserved features of the BRCT fold is a two helical bundle located against one side of the central four-stranded ß sheet, which features two of the best known mutations in breast cancer resulting from introducing a distabilizing charge within the interface of the BRCT-BRCT complex in BRCA1. We have chosen to probe the stability of the BRCT of DNLJ ligase in a thermophilic bacteria by removing the surface charge "R21" from this bundle. This is a first step to test whether this surface charge contributes significantly to the stability of this thermophilic domain, to gain insight about the possible role of BRCT stability on the breast cancer disease, and most of all, to determine the basis for the stability of this frequently found and biologically relevant structural domain. Our preliminar results suggest that the stability of the BRCT of the DNLJ ligasa of Thermus thermophilus BRCT domain is tolerant to the surface charge removal, but is affected by hydrophobicity. Although these mutations do not show significant variations in the structure and stability of the domain itself, they may affect their ability to interact with other protein modules.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina las diferencias estructurales y ultraestructurales, entre las células madre de cáncer de mama triple negativo (CMTN) y las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. La separación de células con el fenotipo CD44+/CD24-, se realiza para las líneas celulares MDA-MB 436 y MDA-MB 231 mediante la técnica de separación inmunomagnética que emplea perlas magnéticas marcadas con monoclonales específicos para este fenotipo (Miltenyi), para lo cual utiliza el separador magnético MACS (Miltenyi) y las columnas MS (Miltenyi). Se encuentran diferencias morfológicas mediante microscopia electrónica de transmisión y microscopia electrónica de barrido entre las CMC y los otros inmunofenotipos seleccionados CD44+/CD24+ y CD44-/CD24-. Entre estas diferencias están la forma esférica y menor tamaño (13µm) de las CMC de la línea celular MDA-MB 436 en comparación a los otros inmunofenotipos. Se encuentran entre las células de la línea MDA-MB 436 que experimentan, transición de células mesenquimales a células epitelial (TME), y las células madre mesenquimales derivadas. Recomienda estudios a nivel de expresión e inmunomarcaje para corroborar la TME. / Tesis