Les mammites sont des inflammations de la mamelle provoquées principalement par des bactéries. Elles représentent un problème majeur en élevage laitier. Elles sont caractérisées par de fortes augmentations de la concentration des cellules somatiques (CCS) dans le lait. Le score des CCS (SCS) est fortement corrélé à la présence d'infections mammaires, ainsi il est utilisé en sélection pour améliorer la résistance aux mammites. Pour comprendre les mécanismes mis en place lors d'une sélection sur les SCS, deux lignées divergentes de brebis ont été produites à partir de géniteurs ayant des valeurs extrêmes de cet index. Le principal objectif de ce travail est d'identifier et de comprendre les mécanismes qui confèrent une plus grande résistance ou sensibilité aux mammites provoquées par des staphylocoques. Nos travaux ont porté principalement sur des analyses transcriptomiques de trois types cellulaires majeurs, après contact avec des staphylocoques : les cellules inflammatoires du lait recueillies après infection, principalement composées de neutrophiles, les cellules dendritiques, comme cellules présentatrices d'antigènes et les cellules épithéliales mammaires, première barrière de défense contre l'infection. Nous avons montré que la migration des cellules immunitaires et les processus inflammatoires se traduisent par des activations de voies différentes chez les brebis des deux lignées divergentes. Nous avons aussi identifié des gènes fonctionnels candidats pour expliquer la différence de sensibilité aux mammites. En parallèle, nous avons étudié l'association entre le polymorphisme de l'ADN et la présence d'abcès mammaires liés aux mammites dans un dispositif cas-contrôle visant à détecter des gènes à effet majeur. Les études ont permis de mettre en évidence une zone chromosomique d'intérêt située sur le chromosome OAR5. Les deux approches de génétique moléculaire (analyses du transcriptome et du polymorphisme du génome) ont permis d'identifier des gènes fonctionnels et positionnels candidats pour comprendre les mécanismes associés à la résistance aux mammites / Mastitis is udder inflammation. It is one of the major health issues in dairy cattle and sheep as they produce economic losses for the dairy industry. Mastitis is characterized by an increase in milk inflammatory somatic cells. The somatic cell score (SCS) is well correlated to clinical and subclinical mastitis. To enhance insights into the genetic mechanisms involved in such a selection on SCS, two divergent lines of sheep were generated based on extreme breeding values for SCS. The main objective of this work was to identify and improve the understanding of mechanisms that are responsible for a better resistance to Staphylococcus mastitis. Our study was based on transcriptomic analysis of three cell types after Staphylococcus contact: milk inflammatory cells, mainly composed of neutrophils, dendritic cells and mammary epithelial cells. We showed that immune cell migration and inflammatory processes were activated by different pathways in the two divergent lines. We also identified functional candidate genes that may partly explain the differences of mastitis susceptibility. In parallel, we analysed the association of DNA polymorphism with the presence of mammary abscesses caused by mastitis. The study highlighted a chromosomal region on OAR5 that is associated to the presence of mammary abscesses. Both approaches of molecular genetics as transcriptomics and genomics analyses enabled identification of candidate functional and positional genes for the better understanding of the mechanisms associated to mastitis resistance

Streptococcus agalactiae (streptocoque du groupe B, SGB) est un commensal fréquent des voies intestinale et génito-urinaire dans la population humaine mais constitue une des causes principales d'infections néonatales. Dans le même temps, SGB est connu comme pathogène vétérinaire, responsable de mastites bovines à l'origine de pertes économiques importantes dans plusieurs pays comme le Portugal. L'objectif de ma thèse était d'analyser au niveau génomique les bases de l'adaptation spécifique de SGB à ses hôtes humains et bovins et de l'établissement des lignées plus pathogènes. La comparaison des profils génomiques des souches isolées de nouveau-nés infectés et de leurs mères nous a permis de montrer que la transmission de SGB de mère à enfant est accompagnée dans certains cas par l'acquisition de mutations pathoadaptives. Par ailleurs, l'analyse des séquences génomiques de plus de 600 souches appartenant au complexe clonal (CC) 17, hypervirulent et spécifique à l'hôté humain, nous a permis de caractériser les forces évolutives agissant sur ce complexe. Finalement, l'étude de la colonisation des fermes laitières portugaises par un seul clone CC61 depuis plus de 20 ans a mis en évidence que la régulation spécifique de l'import du fer/manganèse est une stratégie d'adaptation récurrente dans l’environnement bovin. En conclusion, les résultats que nous présentons améliorent notre compréhension de l'adaptation chez les espèces hôte-généralistes, en apportant des idées utiles qui pourront spécifiquement aider à améliorer le contrôle et le traitement des infections de SGB mondialement. / Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS) is a commensal of the intestinal and genitourinary tracts in the human population, while also a leading cause of neonatal infections. Likewise, GBS remains a serious concern in many countries as frequently responsible for bovine mastitis. Therefore, the purpose of my PhD project was to use state-of-the-art whole-genome approaches to decipher the host-specific adaptation and pathogenesis of GBS in both humans and bovines. By comparing the genomic profile of strains from infected newborns and their mothers we showed that the transmission of GBS from mother to child is accompanied in particular instances by the acquisition of specific pathoadaptive mutations. Moreover, from the study of the evolutionary forces acting on the human-specific and hypervirulent clonal complex (CC) 17, we reveal that various systems can evolve to improve the ability of GBS to survive in the human host. Functions related to metabolism, cell adhesion, regulation and immune evasion were among the most preferentially affected in GBS strains from human origin. Conversely, colonization of Portuguese dairy farms by one single CC61 clone for over 20 years highlighted that the specific regulation of iron/manganese uptake is a recurrent adaptive strategy in the bovine environment.

Les infections intra-mammaires (IMI) responsables de mammites, sont une cause importante de maladie, de mortalité et de pertes de production chez les ruminants laitiers. Le péri-partum est une période où la fréquence des mammites est significativement plus élevée. Parmi les facteurs de risques, le déficit énergétique, fréquent au début de la lactation, est souvent évoqué. Cependant, les bases mécanistiques de l’éventuelle relation entre IMIs et déficit énergétique sont encore peu comprises. L’objectif de ma thèse était ainsi d’évaluer la relation éventuelle entre le déficit énergétique et la prédisposition aux mammites en utilisant la brebis laitière comme modèle. Mes travaux ont montré que les brebis génétiquement prédisposées aux mammites ont également une sensibilité accrue au déficit énergétique et à la cétose. / Intramammary infections and mastitis are a leading cause of diseases, death and production losses in dairy ruminants. Increased susceptibility to mastitis during the peripartal period has been yet widely documented. Negative energy balance is frequent in early lactation and considered as a known risk factor for mastitis. The relationship between energy balance and mastitis susceptibility however remained unclear and poorly described. The aim of my thesis was to examine the relation between a negative energy balance and susceptibility to mastitis in dairy ewes. In particular, my research works showed an enhanced susceptibility to energy restriction in mastitis-susceptible ewes.

La mammite est une inflammation de la mamelle, le plus souvent, en réponse à une invasion d’origine bactérienne. L’utilisation d’antibiotiques pour le traitement de cette pathologie n’est pas la solution idéale. Outre les problèmes engendrés pour la qualité du lait, l’apparition de résistance et l’inefficacité des traitements nécessitent de développer des méthodes alternatives. L’objectif de ces travaux de thèse était de vérifier si l’utilisation d’huile de tournesol ozonée comme moyen de lutte alternatif contre les mammites est envisageable. Dans un premier temps, l’effet des conditions d’ozonation sur la composition et sur l’activité antibactérienne de l’huile ozonée a été étudié pour déterminer les conditions optimales de synthèse d’un agent antibactérien. Les résultats ont montré que l’ajout d’eau et l’augmentation de la durée de la réaction permettaient l’obtention de valeurs d’indice de peroxyde plus élevées et d’une meilleure activité antibactérienne mettant en évidence la relation existant entre ces deux paramètres. Par la suite, l’activité antibactérienne d’huile de tournesol ozonée a été évaluée in vitro sur 59 espèces bactériennes isolées de cas déclarés de mammites chez des brebis. Le produit testé a prouvé son efficacité contre toutes les souches étudiées avec des concentrations minimales inhibitrices de croissance comprises entre 0,625 et 20 mg/mL. L’homologation de l’huile de tournesol ozonée comme préparation vétérinaire requiert d’avoir des données sur sa stabilité thermique et d’identifier les molécules actives. Les travaux menés ont montré que la composition de l’huile de tournesol ozonée stockée à −20 °C ou à +4 °C n’évoluait pas pendant une durée d’un an. Au contraire, des températures de stockage plus élevées entrainaient rapidement une diminution de l’indice de peroxyde et une augmentation de l’acidité. Cependant, ces modifications n’ont pas eu d’effet sur l’activité antibactérienne qui a gardé une valeur constante. Ces observations ont permis d’émettre des hypothèses sur l’identité des molécules actives. L’activité antibactérienne des huiles ozonées serait due à la présence d’ozonides, d’hydroperoxydes et d’acides nonanoïque et azélaïque. L’étude de la réaction d’ozonolyse sur un composé modèle, l’oléate de méthyle, a permis d’affiner ces hypothèses. En effet, l’activité antibactérienne spécifique de différentes fractions obtenues après purification d’oléate de méthyle ozoné a été évaluée. Toutefois, les ozonides purifiés et caractérisés par RMN n’ont pas montré d’activité dans la gamme de concentration testée. L’activité antibactérienne de l’huile de tournesol ozonée peut donc être attribuée aux hydroperoxydes, aux aldéhydes et aux acides carboxyliques à chaines courtes.

Staphylococcus aureus est un des pathogènes majeurs impliqué dans les mammites chez les ruminants. Il engendre des tableaux cliniques très variable, allant des mammites subcliniques aux mammites gangréneuses, mais les mécanismes de cette variabilité restent encore mal connu. La volonté de réduire l'utilisation d'antibiotiques en médecine vétérinaire ainsi que leurs faibles efficacités contre les mammites staphylococciques soulignent la nécessité de développer de nouvelles stratégies alternatives. L'une des particularités des infections intramammaires à S. aureus est leur pouvoir chronique et persistent dont l'une des principales causes est la capacité de S. aureus à adhérer et internaliser dans les tissus de l'Hote. L'un des concepts ayant fait ses preuves chez l'Homme et l'animal se base sur le concept de la lutte biologique en utilisant les propriétés inhibitrices des bactéries dites « probiotique » d'un écosystème pour réduire, prévenir ou traiter les infections. Cette étude vise à mieux caractériser le microbiote mammaire et notamment la composante lactique qui par analogie avec les autres écosystèmes jouent un rôle positif sur la santé de l'Hôte et de déterminer son potentiel à moduler l'adhésion et l'internalisation de S. aureus. L'ensemble de ce travail a été réalisé avec deux souches de S. aureus très différentes au niveau des tableaux cliniques engendrés. La souche RF122, très virulente et la souche Newbould 305, induisant des infections chroniques. Deux messages clairs ressortent des analyses indépendantes du pathogène et du microbiote : d'une part, l'édute comparative in silico et in vitro révèle que l'invasion cellulaire semble être majeur pour la chronicité de la souche Newbould 305 et d'autre part que l'écosystème de la glande mammaire présente une composante lactique ayant des capacités probiotiques intéressantes. Dans notr! e modèle d'interaction tripartite, trois acteurs ont été retenus, S. aureus, Lactobacillus casei et les cellules épithéliales mammaires MAC-T. Dans ce système, L. casei affecte l'adhésion et surtout l'internalisation de S. aureus sans modifier la viabilité et la morphologie des cellules en culture. Les mécanismes identifiés dans l'inhibition semblent dépendant d'un contact direct avec des L. casei viables et permettent de poursuivre la caractérisation des bases moléculaires de ce phénomènes impliquant une modulation des gènes de virulence et cellulaire lors d'interaction avec une flore compétitrice. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans l'application de bactéries lactiques en tant que probiotique mammaire. / Staphylococcus aureus is one of the main pathogen involved in ruminant mastitis. Severity of bovine S. aureus mastitis is highly variable, from subclinical to gangrenous mastitis. Nevertheless S. aureus factors that may explain this variability still poorly documented. The need to reduce antibiotics in veterinary medicine as well as their low efficiencies against staphylococcal mastitis underline the necessity to develop new alternative strategies. One of the particularity of S. aureus infections is his ability to persist within the mammary tissue and induce chronicity of the infection. One of the main causes is the ability of S. aureus to adhere to and internalize into host cells. The concept of biological control, using natural inhibitory properties of lactic acid bacteria as probiotics, are now well etablished in human and animal ecosystem for their ability to reduce, prevent or treat bacterial infections. This study aims to better characterize the mammary microbiota in p! articular the lactic component which by analogy with the other ecosystems play a positive role in the host health and to determine his potential to modulate adhesion and internalization of S. aureus. This work was realized with two S. aureus strains with different severity degree. The virulent strain RF122 and the Newbould 305 one, involved in chronic mastitis. Two main messages came out from the independent analyses of the pathogen and the microbiota: on one hand, the in silico and in vitro comparison of the two strains reveals that the cellular invasion propress seems to be major for the chronicity of the Newbould 305 strain and on the other hand that the bovin mammary ecosystem presents a lactic biodiversity with interesting probiotic capacities. In our model of tripartite interaction, three actors were retained, S. aureus, Lactobacillus casei and the mammary epithelial cells MAC-T. In this system, L. casei affect the adhesion and internalization of S. aureus without mod! ifying the viability and the morphology of cells in culture. Mechanisms identified in the inhibition seem dependent on a direct contact with live L. casei and allow to continue the molecular basis of the virulence and cells genetic expression modulation during interaction with a competitive flora. These results open new perspectives in the application of lactic acid bacteria as mammary probiotic.

La mammite est une inflammation de la mamelle, le plus souvent, en réponse à une invasion d’origine bactérienne. L’utilisation d’antibiotiques pour le traitement de cette pathologie n’est pas la solution idéale. Outre les problèmes engendrés pour la qualité du lait, l’apparition de résistance et l’inefficacité des traitements nécessitent de développer des méthodes alternatives. L’objectif de ces travaux de thèse était de vérifier si l’utilisation d’huile de tournesol ozonée comme moyen de lutte alternatif contre les mammites est envisageable. Dans un premier temps, l’effet des conditions d’ozonation sur la composition et sur l’activité antibactérienne de l’huile ozonée a été étudié pour déterminer les conditions optimales de synthèse d’un agent antibactérien. Les résultats ont montré que l’ajout d’eau et l’augmentation de la durée de la réaction permettaient l’obtention de valeurs d’indice de peroxyde plus élevées et d’une meilleure activité antibactérienne mettant en évidence la relation existant entre ces deux paramètres. Par la suite, l’activité antibactérienne d’huile de tournesol ozonée a été évaluée in vitro sur 59 espèces bactériennes isolées de cas déclarés de mammites chez des brebis. Le produit testé a prouvé son efficacité contre toutes les souches étudiées avec des concentrations minimales inhibitrices de croissance comprises entre 0,625 et 20 mg/mL. L’homologation de l’huile de tournesol ozonée comme préparation vétérinaire requiert d’avoir des données sur sa stabilité thermique et d’identifier les molécules actives. Les travaux menés ont montré que la composition de l’huile de tournesol ozonée stockée à −20 °C ou à +4 °C n’évoluait pas pendant une durée d’un an. Au contraire, des températures de stockage plus élevées entrainaient rapidement une diminution de l’indice de peroxyde et une augmentation de l’acidité. Cependant, ces modifications n’ont pas eu d’effet sur l’activité antibactérienne qui a gardé une valeur constante. Ces observations ont permis d’émettre des hypothèses sur l’identité des molécules actives. L’activité antibactérienne des huiles ozonées serait due à la présence d’ozonides, d’hydroperoxydes et d’acides nonanoïque et azélaïque. L’étude de la réaction d’ozonolyse sur un composé modèle, l’oléate de méthyle, a permis d’affiner ces hypothèses. En effet, l’activité antibactérienne spécifique de différentes fractions obtenues après purification d’oléate de méthyle ozoné a été évaluée. Toutefois, les ozonides purifiés et caractérisés par RMN n’ont pas montré d’activité dans la gamme de concentration testée. L’activité antibactérienne de l’huile de tournesol ozonée peut donc être attribuée aux hydroperoxydes, aux aldéhydes et aux acides carboxyliques à chaines courtes. / Mastitis is an inflammation of the udder, usually in response to a bacterial invasion. The use of antibiotics for the treatment of this disease is not the ideal solution. In addition to the problems caused to the quality of milk, the development of resistance and ineffective treatments require to focus on alternative methods. The aim of this work was to verify if the use of ozonized sunflower oil as an alternative means of fight against mastitis could be possible. Firstly, the effect of the ozonation conditions on the composition and the antibacterial activity of ozonized oils was studied to determine the optimum conditions for the synthesis of an antibacterial agent. The results showed that the addition of water and increasing the duration of the reaction allowed to obtain higher peroxide index values and improved antibacterial activity highlighting the relationship between these two parameters. Afterwards, the antibacterial activity of ozonized sunflower oil was assessed in vitro against 59 bacterial species isolated from reported cases of mastitis in ewes. The tested product has proved its efficiency against all the strains studied with minimum inhibitory concentrations between 0.625 and 20 mg/mL. The registration of ozonized sunflower oil as a veterinary preparation requires to obtain data on its thermal stability and to identify the active molecules. The work carried out has shown that the composition of ozonized sunflower oil stored at −20 °C or +4 °C did not evolve for a period of one year. On the contrary, higher storage temperatures quickly led to a decrease of the peroxide index and an increase in acidity. However, these changes had no effect on the antibacterial activity that kept a constant value. These observations allowed speculating on the identity of active molecules. The antibacterial activity of ozonized oils could be due to the presence of ozonides, hydroperoxides and nonanoic acid and azelaic acid. The study of the ozonolysis reaction on a model compound, methyl oleate, helped to refine these assumptions. Indeed, specific antibacterial activity of various fractions obtained after purification of ozonized methyl oleate was evaluated. However, purified ozonides, characterized by NMR, showed no activity in the tested concentration range. The antibacterial activity of ozonized sunflower oil can therefore be attributed to hydroperoxides, aldehydes and short chain carboxylic acids

L’intensification des pratiques d’élevage s’est accompagnée de l’émergence de pathologies de production, notamment des mammites. Il s’agit d’une inflammation de la glande mammaire, d’origine bactérienne dans la majeure partie des cas. Les mammites constituent à elles seules la première source de pertes financières des cheptels bovins laitiers en France et dans le monde. Néanmoins aucun traitement prophylactique ne permet à ce jour une action préventive à long terme. Parmi les agents étiologiques majeurs des mammites, Escherichia coli (E. coli) tient son importance du fait de sa prévalence et de son impact sur les rendements et la qualité du lait. La part des facteurs de l’hôte dans la capacité à éliminer le pathogène causal est relativement avérée, tandis que le lien entre caractéristiques bactériennes et sévérité de l’infection est plus délicat à établir. Cette étude s’attache donc à déterminer si les interactions entre E. coli et la glande mammaire, en particulier les cellules épithéliales mammaires (CEM) et les neutrophiles, peuvent expliquer des degrés de sévérité variables. L’influence du lait sur ces interactions a également été investiguée. / Along with agricultural intensification of animal production, some pathologies have emerge, especially mastitis. This disease corresponds to an inflammation of the udder, and is generally provoked by bacterial infection. Mastitis on their own constitute the main source of financial impairments within dairy herds in France and worldwide. So far, there is no treatment able to prevent mastitis over time. Among major mastitis pathogens Escherichia coli (E. coli) is of great importance, because of its prevalence and its impacts on milk yield and quality. The mastitis severity has proven to be linked to host factors, but the implication of bacterial characteristics remains unknown. Thus, this study aimed at deciphering whether interactions between E. coli and the mammary gland, especially the mammary epithelial cells (MECs) and neutrophils, may explain a variability in mastitis severity. Influence of milk on these interactions was also investigated.