Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Universidade Federal de Goiás, Universidade Federal do Mato Grosso, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Universidade Federal da Grande Dourados— Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-16T16:47:20Z No. of bitstreams: 1 2017_NatáliaLimadeSousa.pdf: 4533724 bytes, checksum: f1543f615e181c2847084a1bdbff8c2a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-08T19:50:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_NatáliaLimadeSousa.pdf: 4533724 bytes, checksum: f1543f615e181c2847084a1bdbff8c2a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-08T19:50:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_NatáliaLimadeSousa.pdf: 4533724 bytes, checksum: f1543f615e181c2847084a1bdbff8c2a (MD5) Previous issue date: 2018-05-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / A mamona é uma oleaginosa pertencente à Família Euphorbiaceae com distribuição mundial, porém mais cultivada em regiões tropicais e subtropicais. Tem grande importância na indústria principalmente devido ao seu óleo de grande aplicabilidade em medicamentos, cosméticos e lubrificantes. Seu subproduto de maior importância é a torta empregada na recuperação de solos devido ao alto teor de nitrogênio, e por conter alto teor de proteínas poderia ser empregada na alimentação animal. Porém seu uso como ração é inadequado devido à presença da ricina, uma proteína tóxica e de difícil eliminação. Para gerar plantas de mamona biodetoxificadas por meio da engenharia genética foi utilizada a técnica de RNA interferente para silenciar o gene da ricina nas sementes (com a intenção de silenciar também a RCA120, uma aglutinina muito similar a ricina), por Agrobacterium tumefaciens ou biobalística. Utilizando transformação via A. tumefaciens não foi possível obter plantas transgênicas, provavelmente por causa do baixo número de embriões transformados. Por outro lado, foram obtidos sete explantes transgênicos por meio de biobalística, sendo a maioria do tipo mosaico com apenas a epiderme transgênica. Porém, a linhagem TB14S-5D, apresentou todos os tecidos transgênicos e transferiu os transgenes para a progênie. Essa linhagem apresentou níveis indetectáveis de ricina no ensaio ELISA, em ensaio de hemaglutinação de hemácias não apresentou reação de aglutinação demostrando que a RCA120 também foi silenciada. O ensaio realizado com nematoides não ocorreu como esperado, pois o extrato de proteína da planta não transgênica não causou a morte da cultura como deveria, talvez por um mecanismo de defesa do próprio animal. Em ensaio com células IEC-6 e camundongos os extratos da planta transgênica não apresentaram toxidez. Os resultados mostram que a planta gerada tem potencial para que sua torta seja usada como alimento animal, gerando uma fonte renda maior para o produtor e um manejo mais seguro. / Castor bean is an oilseed plant that belongs to Euphorbiaceae family with worldwide distribution, but mainly cultivated in tropical and sub-tropical regions. It has great importance in industry due to its oil content of great applicability in medicines, cosmetics and lubricants. Castor bean cake is the most important sub-product mainly used in soil recovery due to the high nitrogen content. Besides, it contains high protein content that could be used in animal feed. However, its use as animal feed is inadequate due to the presence of ricin, an extremely toxic and difficult to eliminate protein. To generate biodetoxified castor bean plants by genetic engineering, the RNAi technique was used to silence the ricin gene in castor bean seeds (also intending to silence the RCA120, that is a strong agglutinin very similar to ricin) by Agrobacterium tumefaciens or biolistic. It wasn’t possible to generate transgenic plants through genetic transformation by A. tumefaciens probably because of the low number of transformed embryos. Still it was possible to generate seven transgenic explants by genetic transformation via biolistic, however most explants were mosaic with only the epidermis being transgenic. The transgenic line TB14S-5D presented all tissue being transgenic and transferred the transgenes to progeny. This line had undetectable levels of ricin by ELISA, in a red blood cell hemagglutination test it did not present agglutination reaction showing that RCA120 was also silenced. The nematode assay did not occur as expected because the protein extract from the non-transgenic plant did not cause the death of the culture as it was expected, perhaps by a defense mechanism of the animal itself. Furthermore the transgenic plant extracts showed no toxicity to IEC-6 cells and mice. The results show that the cake of the plant generated can be used as animal feed, generating a higher source income for the producer and safer handling.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2013. / Submitted by Marina Lima (marinalm34@gmail.com) on 2014-09-12T14:18:16Z No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLimadeSousa.pdf: 3031304 bytes, checksum: 04e83c6b880e77c6b74afc2aa6d85b3f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-09-12T14:38:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLimadeSousa.pdf: 3031304 bytes, checksum: 04e83c6b880e77c6b74afc2aa6d85b3f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-12T14:38:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLimadeSousa.pdf: 3031304 bytes, checksum: 04e83c6b880e77c6b74afc2aa6d85b3f (MD5) / A mamona (Ricinus communis L.) é uma oleaginosa de grande importância na indústria por seu óleo apresentar características únicas como alta viscosidade, densidade e estabilidade. A torta de mamona é o subproduto de maior importância da cultura usada principalmente como adubo, com grande potencial de uso como ração animal. No entanto, a presença de ricina (proteína tóxica) no endosperma das sementes da mamona, inviabiliza a utilização em larga escala do seu principal subproduto, sendo necessário um processo de destoxificação da torta. Porém os vários métodos que têm sido desenvolvidos não são viáveis ao nível industrial por serem caros ou ineficientes. Uma alternativa para a redução do teor de ricina nas sementes de mamona é o silenciamento do gene da ricina por RNA interferente, mas os trabalhos de transformação genética de mamona na literatura são escassos e a cultura de tecidos da mamona precisa ser aperfeiçoada. O objetivo deste trabalho foi desenvolver sistemas de transformação genética de mamona e otimizar a cultura de tecidos para produzir plantas transgênicas. Embriões zigóticos maduros da cultivar EBDA-MPA-34 foram cultivados em meio MS suplementado com diferentes citocininas, BAP (0,5 mg.L-1; 2,5 mg.L-1 ou 5,0 mg.L-1) ou TDZ (0,5 mg.L-1; 1,0 mg.L-1 ou 2,5 mg.L-1) e controle (sem fitorregulador). Três explantes por tratamento foram analisados por microscopia eletrônica de varredura após diferentes períodos de cultivo para avaliar a indução de gemas. As cultivares BRS Nordestina, BRS Paraguaçu e EBDA-MPA-34 foram utilizadas para transformação genética usando genes marcadores que conferem tolerância ao IMZ ou higromicina em vetores para bombardeamento ou transformação via agrobactéria, respectivamente. Ambos os vetores contêm uma construção de RNAi onde a região mais conservada do gene da ricina foi clonada de forma repetida e invertida para formar a estrutura de grampo, e está sob domínio do promotor 35SCaMV. Os sistemas de biobalística e A. tumefaciens foram utilizados para transformar embriões zigóticos maduros de mamona previamente induzidos na presença de diferentes citocininas. Foram obtidos seis brotos transformados via biobalística, um da variedade BRS Nordestina confirmado por PCR e os outros cinco da variedade EBDA-MPA-34 expressando gus. Para promover superbrotamento em mamona o melhor fitorregulador foi TDZ e dentre as cultivares testadas a EBDA-MPA-34 foi a melhor opção para transformação genética nas condições testadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Castor bean (Ricinus communis L.) is an oilseed crop of great importance in the industry because of the oil unique features like the high viscosity, density and stability. The castor meal is the most important byproduct of the culture, being used mainly as a fertilizer, with great potential for use as animal feed. However, the presence of ricin (a toxic protein) in the endosperm of the seeds of castor bean, prevents the large scale use of its main by-product, requiring detoxification process of the meal. However the various methods that have been developed are not viable at industrial level because they are expensive or inefficient. An alternative to reducing the amount of ricin in the seeds of castor beans is the ricin gene silencing by RNA interference, but the genetic transformation of castor literature is scarce and the tissue culture of castor needs to be improved. The aim of this study was to develop genetic transformation systems for castor and optimize tissue culture to produce transgenic plants. Mature zygotic embryos of cultivar EBDA-MPA-34 were cultured on MS medium supplemented with different cytokinins, BAP (0.5 mg L-1, 2.5 mg L-1 or 5.0 mg L-1) or TDZ (0.5 mg L-1, 1.0 mg L-1 or 2.5 mg L-1) and control (without plant regulator). Three explants per treatment were analyzed by scanning electron microscopy after different periods of cultivation to assess bud induction. Cultivars BRS Nordestina, BRS Paraguaçu and EBDA-MPA-34 were used for genetic transformation using marker genes that confer resistance to hygromycin or imazapyr in vectors for transformation via Agrobacterium or biolistic, respectively. Both vectors contain a RNAi construct where the most conserved region of the ricin gene has been cloned and inverted repeatedly to form the clamp structure and is under the control of the promoter 35SCaMV. Biolistic and A. tumefaciens systems were used to transform mature zygotic embryos of castor previously induced in the presence of different cytokinins. Six transgenic plants were obtained via biolistic one of the variety BRS Nordestina was positive by PCR and another five of the variety EBDA-MPA-34 expressing gus. To promote the best shoots in castor plant regulator TDZ and is among the cultivars tested EBDA-MPA-34 was the best option for genetic transformation in the conditions tested.