Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T13:16:58Z No. of bitstreams: 1 allan_j_guimaraes_ioc_bcm_0029_2006.pdf: 1714817 bytes, checksum: d2edc214a8508b65add7f8db0b664ce0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T13:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 allan_j_guimaraes_ioc_bcm_0029_2006.pdf: 1714817 bytes, checksum: d2edc214a8508b65add7f8db0b664ce0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. A infecção por este organismo é freqüentemente diagnosticada pela determinação da presence de anticorpos para a proteína M, imunodominante, mas o papel deste antígeno na patogênese da histoplasmose permanence obscuro. A função do antígeno M não é conhecida, mas geneticamente esta proteína é homologa catalases fúngicas. Em nosso estudo, nós procuramos determinar regiões imunodominantes do antígeno M, produzir um painel de anticorpos monoclonais contra esta proteína, caracterizá-los, usá-los para o mapeamento de epítopos, mostrar a localização do antígeno M na levedura do H. capsulatum, demonstrar a atividade de catalase desta proteína e desenvolver imunoensaios para a detecção de anticorpos contra esta proteína e entígeno M circulante nos fluidos corporais. Foi possível determinar peptídeos com maior atividade antigênica e suas localizações na molécula e caracterizá-los de acordo com as suas propriedades bioquímicas. Nós geramos três fragmentos que continham estes peptídeos e os utilizamos para avaliar a ligação dos anticorpos monoclonais e reconhecimento a cada fragmento separadamente. Um dos fragmentos, F3, mostrou maior ligação aos anticorpos monoclonais que os outros avaliados, entretanto estudos adicionais devem ser avaliados para um complete mapeamento. Para avaliar o papel do antígeno M na patogênese da histoplasmose, usando análise por imunoblot de um extrato de parede celular e membrana (CW/M) obtido de levedura, provamos que os mAbs gerados contra o antígeno M recombinante puderam reconhecer este antígeno no extrato utilizado. Estudos de imunofluorescencia também revelaram que os mAbs reconheciam proteínas na superfície da levedura. Adicionalmente, avaliamos a atividade de catalase usando diferentes frações celulares para sugerir a localização da enzima e confirmamos que a maior atividade de catalase estava presente nos extratos incluindo antígenos de superfície. A capacidade do antígeno M em funcionar como catalase sugere que esta enzima está provavelmente envolvida na proteção pelas leveduras contra o stress oxidativo na interior do fagolisossomo e escape dos mecanismos fungicidas nos macrófagos. A localização do antígeno M na superfície do Hc tem importantes implicações na antigenicidade da proteína já que está acessível ao sistema imunológico do hospedeiro e interações com os anticorpos. Adicionalmente, a ELISA para a detecção de anticorpos utilizando histoplasmina purificada e tratada (ptHMIN) mostrou uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de 96%, enquanto a ELISA para a detecção de antígenos mostrou uma sensibilidade de 80% e uma especificidade de 91%, provando que estas duas metodologias poderiam ser utilizadas no diagnóstico da histoplasmose. / Histoplasmosis is caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. Infection with this organism is often diagnosed by determining the presence of antibody to the immunodominant M antigen, but the role of the M antigen in the pathogenesis of histoplasmosis has previously not been elucidated. The function of the M protein is not known, but genetically it is homologous to fungal catalases. In our work, we sought to determine immunodominant regions of the M antigen, create a monoclonal antibodies panel, characterize them, use them for epitope mapping, show that the M antigen was located on the cell surface of H. capsulatum yeasts, demonstrate the catalase activity of the protein and developed an immunoassay to detect antibodies against this protein and another one to detect the circulating M antigen in body fluids. We could determine the peptides that have the most antigenic activity and their localization on the molecule, and characterize according to biochemical properties. We generated three fragments containing these peptides and used to evaluate the monoclonal antibodies binding and recognition to each fragment. We could see that one fragment, the F3, showed more binding to the mAbs than the other two, but additional studies have to be done to complete the epitope mapping. To evaluate the role of the M antigen on the pathognesis of histoplasmosis, using Western blot analysis of a detergent extract of cell walls and cell membranes (CW/M) from yeast cells, we found that mAbs generated to recombinant M antigen reacted with the CW/M preparations. Immunofluorescence studies also revealed that the mAbs to the M antigen labeled the yeast cell surface. Also, we assayed the catalase activity using different cell extract fractions for the localization of the enzyme and confirmed that the major activity was present in extracts including fungal surface antigens. The ability of the M antigen to function as a catalase suggests that this enzyme is probably involved in protecting the yeast cells against the oxidative stress within the phagolisossome and escaping of the fungicidal mechanisms in the macrophages. Localization of the M antigen to the cell surface of Hc has important implications for the antigenicity of the protein since it demonstrates that it is accessible to host immune cells and for antibody interactions. Also, the ELISA for antibody detection using purified and treated histoplasmin (ptHMIN) showed a sensitivity of 92% and a specificity of 96%, while the ELISA for antigen detection showed a sensitivity of 80% and a specificity of 91%, proving that these two methodologies could be used in the diagnosis of histoplasmosis.

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 11.pdf: 2987494 bytes, checksum: 91278cbfb140a22e4c4ae00434713079 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Nesse trabalho, analisou-se a pureza de soros antiofídicos utilizados no Programa Nacional de Imunizações. Fez-se a avaliação com base no teor e composição de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida, de soro antibotrópico. O principal componente identificado foi o fragmento F(ab)´2 – fração relevante para o efeito protetor do soro. Também se verificou a presença de proteínas contaminantes. Estas proteínas foram caracterizadas por western blot e espectrometria de massas, após a separação por eletroforese bidimensional. Os contaminantes identificados foram a IgG, albuminas eqüina e de asno, fragmentos da região variável da cadeia pesada e fragmentos de albumina. A concentração desses contaminantes varia bastante de um produtor para o outro, sendo que um dos produtores apresentou uma pureza substancialmente melhor que os demais. Desenvolveu-se um anticorpo para um método que visa a avaliação do conteúdo de imunoglobulina eqüina íntegra nos soros. Iniciou-se o desenvolvimento pela predição de epítopos na cadeia pesada da imunoglobulina eqüina, utilizando modelagem molecular. Nove prováveis epítopos foram identificados. O mapeamento dos epítopos utilizando a técnica de spot síntese confirmou a maioria das predições e possibilitou a identificação dos três mais reativos frente ao soro de coelho imunizado com IgG eqüina. Com base nesses resultados preparou-se um conjugado do peptídeo correspondente ao epítopo mais reativo com o toxóide tetânico. A imunização de coelhos com esse conjugado levou à obtenção de soro que apresentou reatividade frente à imunoglobulina eqüina, confirmando a possibilidade de seu uso como reativo para esse fim. Nenhum lote avaliado foi considerado insatisfatório frente à legislação vigente para soros antiofídicos. Da comparação da legislação em vigor com o estado da arte das indústrias de biotecnologia inferiu-se a necessidade de adequação desta lei, de maneira a considerar especificações que garantam uma melhor qualidade dos soros nacionais. Em função das diferenças nos resultados da avaliação de pureza das amostras de diferentes produtores, sugere-se a adoção de um programa de investimento para a nivelação tecnológica dos fabricantes. / A purity evaluation of antivenoms used in the Brazilian National Immunization Program was performed in this work. The main parameters used were total amount of protein and protein composition by SDS PAGE. The most important identified component was F(ab´)2 fragment, the relevant molecule for antivenom effect. Contaminant proteins were also present. These contaminants were characterized by western blot and mass spectrometry, after two dimensional electrophoresis separation. Identified contaminants were IgG, albumin horse and donkey, fragments from antibodies chains and albumin fragments. The amount of contaminants had a great variation from one producer to the other, and one manufacture had a better purification process than the others. A reagent for IgG identification in antivenoms was also developed. First, epitopes in horse IgG heavy chain were predicted using different molecular modeling methods. Eleven epitope candidates were identified. Epitope mapping confirmed most of the predicted sequences and the three most reactive epitopes were identified. With theses results, a conjugate between tetanus toxoid and a synthetic peptide was prepared. Rabbits were immunized with this conjugate, and after a second buster a high titer of antibodies against horse immunoglobulin was obtained. This serum has the potential applicalility to detect IgG in antivenoms. None of the batches was unsatisfactory to Brazilian guidelines for antivenom production. This guideline must be up dated, because it is old and the biotechnology industry had a lot of advances in last years. New regulatory specifications are the first step for better quality products. An investment program for the manufactures is also necessary, to adequate the purification process to most rigorous specifications.

Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LimaNeto_DanielFerreira_D.pdf: 8189026 bytes, checksum: 64631e8e2ed546b6da6a944505049080 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular