Orientadores: Goran Neshich, João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T21:50:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_JoseGeraldodeCarvalho_M.pdf: 10985777 bytes, checksum: 2610df8bda1ef229c4bcdc8c6c5d8325 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A propriedade das proteínas de se ligarem umas as outras de forma altamente específica, formando complexos estáveis, é uma característica fundamental para todos os processos biológicos. Uma melhor compreensão da formação do complexo abre perspectivas para muitas aplicações práticas, entre elas o design racional de novos fármacos. Trabalhos anteriores demonstraram, através de experimentos de varredura por alaninas, que um pequeno número de resíduos das interfaces protéicas contribui com a maior parte da energia de ligação e por isso foram chamados de hot spots. Devido à importância desses resíduos para as interações proteína-proteína, diversos métodos computacionais têm sido propostos para predizer os hot spots complementando assim o procedimento experimental. Entre esses, estão métodos physics-based como dinâmica molecular, e também métodos knowledge-based, onde dados experimentais são utilizados para treinar métodos computacionais que aprendem as regras para classificar corretamente os hot spots e usados posteriormente para classificar novos casos em estruturas de complexos protéicos. Entre os algoritmos de aprendizado computacionais mais utilizados estão árvores de decisão, redes neurais, máquinas de vetor de suporte. Nesse trabalho, desenvolvemos métodos de predição de hot spots utilizando máquinas de vetor de suporte, que foram abastecidas na entrada com um conjunto de 186 descritores estruturais extraídos do banco de dados STING_DB e também com 112 novos descritores propostos neste trabalho. Os métodos propostos nesse trabalho apresentaram desempenho superior aos métodos de predição de hot spots mais conhecidos da literatura, como KFC, Minerva, Rosetta e FOLDEF. Além disso, a análise estatística dos descritores e também a seleção dos descritores mais eficientes na tarefa de classificar hot spots permitiu que observássemos diversas características que são distintas entre resíduos que são hot spots e os que não são. Entre estas características, a entalpia de hidratação ao redor do resíduo sugere que essa região é mais hidrofílica em hot spots. Essa região, que para hot spots é denominada de anel-O, tem a função de impedir o contato do solvente com o hot spot e por isso, alguns autores acreditavam tratar-se de uma região hidrofóbica, algo que os resultados deste trabalho não confirmaram. Futuramente, os novos descritores propostos neste trabalho serão agregados ao STING_DB e o método de predição de hot spots será integrado ao STING permitindo a predição de hot spots de todos os complexos protéicos depositados no Protein Data Bank (PDB) assim como de complexos protéicos fornecidos pelo usuário / Abstract: The property of the proteins to bind each other in a highly specific way, forming stable complexes, is a key feature for all biological processes. A better understanding of the formation of protein complexes provides many practical applications, including the rational design of new drugs. Through experiments of alanine scanning, it was shown that a small number of residues belonging to protein interfaces contribute decisively to the binding energy and so were called hot spots. Because of the importance of these residues for protein-protein interactions many computational methods have been proposed to predict the hot spots and thus complement the experimental procedure. These include physics-based methods such as molecular dynamics and also knowledge-based methods where experimental data are used to train computational methods that learn the rules for correctly classifying the hot spots and are then used to classify new cases in structures of protein complexes. Among the computational learning algorithms most frequently used are decision trees, neural networks, support vector machines, among others. In this work, we developed methods to predict hot spots using support vector machines, using at the input 186 structural descriptors extracted from the STING_DB and 112 new descriptors proposed in this work. The methods proposed here showed superior performance to methods of predicting hot spots best known from the literature, such as KFC, Minerva, Rosetta and FOLDEF. In addition, statistical analysis of the descriptors and also the selection of the descriptors more efficient in the task of classifying hot spots allowed us to observe several characteristics that are distinct for residues that are hot spots. Among these features, the enthalpy of hydration suggests that the region around hot spots is more hydrophilic. This region, which for hot spots is called O-ring, serves to prevent the contact of the solvent with the hot spot and therefore some authors believe that this was a hydrophobic region whereas results presented here show otherwise. In future, the new descriptors described in this work will be added to the STING_DB and the method of prediction of hot spots will be integrated with STING allowing the prediction of hot spots of all protein complexes deposited in the Protein Data Bank (PDB) as well as protein complexes supplied by the user / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Ana Carolina de Mattos Zeri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T00:57:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_MariaLuizaCaldas_M.pdf: 8261820 bytes, checksum: 7c9ed2193fd77623b3a8beea794eb743 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A mTOR é uma via de sinalização muito conservada que controla o crescimento celular em resposta à presença de nutrientes e fatores de crescimento. A desregulação dessa via em humanos está relacionada a doenças como câncer e diabetes. A quinase TOR é ativada na presença de aminoácidos e recentemente descobriu-se que as pequenas GTPases da família Rag são mediadoras da sinalização por Leucina. Essas GTPases são ancoradas na superfície do lisossomo por meio da interação com um complexo de três proteínas denominado Ragulator. Esse complexo também ancora um braço da via das MAPKs (MEK-ERK) aos lisossomos. O entendimento deste complexo pode nos ajudar a elucidar doenças em que a via da mTOR se encontra desregulada. Neste trabalho obtivemos o complexo Ragulator, através da expressão da proteína p18 em corpos de inclusão e sua renaturação através da adição de suas parceiras Mp1/p14 à diálise. Foram realizados estudos biofísicos com a intenção de caracterização do complexo, entretanto o alto grau de dissociação do mesmo resultou em certa dificuldade para caracterizá-lo completamente. Neste trabalho caracterizamos os agregados formados pela p18 e conseguimos reduzir sua formação através de diálise contendo agente redutor e suas proteínas parceiras. A renaturação da p18 na presença de MP1/p14 favoreceu seu rendimento, indicando a interação entre estas proteínas, porém não foi possível estabilizar o complexo Ragulator O estudo da divisão bacteriana é centralmente dependente de FtsZ, um homólogo procariótico das tubulinas. FtsZ desencadeia a divisão ao formar o "anel Z", uma estrutura supramolecular constituída por polímeros de FtsZ que circunda o interior da célula e funciona como arcabouço do aparato de divisão. A formação do anel Z é regulada por moduladores, proteínas que afetam tanto negativamente como positivamente a capacidade de FtsZ polimerizar-se. A proteína MinC é um inibidor da polimerização de FtsZ, recrutada por MinD para a face interna da membrana plasmática, onde o complexo MinCD exerce sua função. MinCD representa um inibidor sítio-específico da polimerização da FtsZ, previnindo a formação do anel Z nos pólos das células mas permitindo que isto aconteça na região central. A elucidação deste processo seria de grande valia para o desenho racional de inibidores da divisão bacteriana. Neste trabalho, comprovamos a interação entre MinC e FtsZ por Ressonância Magnética Nuclear. Estes proteínas não se encontravam em sua forma monomérica e o alto peso molecular do complexo impossibilitou a identificação dos aminoácidos envolvidos nesta interação, devido a limites da técnica 15NHSQC. No momento, a proteína MinC está sendo expressa em presença de deutério, o que aumenta significativamente o limite da técnica de 15NHSQC. Foram realizados ainda estudos biofísicos com intuito de caracterização da interação / Abstract: The mTOR signaling pathway is a very well conserved pathway that controls cell growth in response to the presence of nutrients and growth factors. Deregulation of this pathway in humans is related to diseases like cancer and diabetes. The TOR kinase is activated in the presence of amino acids and it was recently discovered that the Rag small GTPases family are mediators of signaling by Leucine. These GTPases are anchored on the surface of the lysosome through interactions with a complex of three proteins called Ragulator. This complex also anchors an arm of the pathway of MAPKs (MEK-ERK) to lysosomes. Understanding this can help us to elucidate complex diseases in which the mTOR pathway is upregulated. In this work, the Ragulator complex was obtained through the expression of p18 protein in inclusion bodies and their refolding by adding their partners MP1/p14 to dialysis. Biophysical studies were conducted with the intention of characterizing the complex, however its high degree of dissociation resulted in some difficulty to characterize it completely. In this work we characterized the aggregates formed by p18 and managed reduce its formation by dialysis containing reducing agent and its partner proteins. The p18 renatuation with MP1/p14 improve its yield, indicating interaction among these proteins, however the Ragulator complex wasn't stabilized. The study of bacterial division is centrally dependent on FtsZ, a prokaryotic homologue of tubulin. FtsZ triggers the division to form the "Z ring", a supramolecular structure consisting in FtsZ polymers that surrounds the cell and acts as a frame of the division apparatus. The formation of the Z ring is regulated by modulators, proteins that affect both negatively and positively the ability of FtsZ to polymerize. The MinC protein is an inhibitor of FtsZ polymerization, recruits MinD to the inner surface of the plasma membrane, where the complex MinCD exerts its function. MinCD is an inhibitor of site-specific polymerization of FtsZ, preventing the formation of the Z ring at the poles of the cells but allowing this to happen in the central region. The elucidation of this process would be invaluable for the rational design of bacterial division inhibitors. In this work, we confirmed the interaction between MinC and FtsZ by Nuclear Magnetic Resonance. These proteins were not in their monomeric form and the high molecular weight of the complex prevented the identification of the amino acids involved in this interaction, due to limitations of the 15NHSQC technology. At present, the MinC protein is being expressed in the presence of deuterium, which significantly increases the limit of this technique 15NHSQC. Biophysical studies were also performed with the aim of characterizing the interaction / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-09T18:04:23Z No. of bitstreams: 1 andre_b_veloso_ioc_bp_0047_2011.pdf: 4592043 bytes, checksum: a2b54a8751c7c9a32fe93ed74e1392a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-09T18:04:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andre_b_veloso_ioc_bp_0047_2011.pdf: 4592043 bytes, checksum: a2b54a8751c7c9a32fe93ed74e1392a6 (MD5) Previous issue date: 2011 / FAPERJ / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / No presente trabalho, as atividades proteolíticas de extratos totais das fases pré-imaginais (ovos, larvas e pupa) e de imagos (machos e fêmeas), de Cx. quinquefasciatus foram caracterizadas por enzimografia em uma dimensão. Adicionalmente, o perfil proteolítico dos órgãos internos dos adultos (intestino e gônadas) foi analisado. Ao se comparar o perfil proteolítico das distintas fases evolutivas, observou-se que esses perfis apresentam diferenças qualitativas e quantitativas na expressão de peptidases. As atividades proteolíticas de todos os estágios do inseto são devidas, principalmente, a serinopeptidases do tipo tripsina, com atividades ótimas na faixa de pH alcalino. As tripsinas ativas dos quatro estádios larvais apresentam ampla estabilidade térmica, sendo ativas entre 25 °C – 65 °C, com atividade ótima entre 37 °C – 50 °C.. O perfil proteolítico dos imagos revelou que a expressão de algumas peptidases do tipo tripsina é sexo-específica e órgão-específica, sendo o perfil proteolítico das fêmeas mais complexo em número e intensidade quando ao perfil dos machos. Finalmente, o primeiro mapa proteômico parcial do intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus foi obtido por eletroforese bidimensional e as proteínas foram identificadas por espectrometria de massas. / In this work, the proteolytic activities from total extracts of pre-imaginal stages (eggs, larvae and pupa) and adults (male and female) of peptidases of Cx. quinquefasciatus were characterized by one-dimensional zymography. In addition, the proteolytic profile from specific tissues such as gut and gonads was analyzed. Comparison of the proteolytic profiles from all life cycle stages revealed several quali- and quantitative differences in the peptidase expression. The proteolytic activities from both pre-imaginal and imaginal stages are mostly due to trypsin-like serine peptidases which display optimal activities at alkaline pH. The proteolytic enzymes of the four larval stages exhibited a broad thermal stability, showing activities in a range of 25 °C – 65 °C, with optimal activity between 37 °C – 50 °C. The proteolytic profile from imaginal stages revealed that the expression of some peptidase isoforms is sex-specific and tissue-specific. In addition, it was observed that the proteolytic profile from females is more complex, both in number of activities and in intensity levels, than that observed in males. Finally, it is reported here the first proteomic map of Cx. quinquefasciatus female gut obtained by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry analysis.