Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-06-29T12:53:56Z No. of bitstreams: 1 Tese_Renato_Silva.pdf: 1149696 bytes, checksum: 90cca601f940d32033deeaeb17255312 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-06-29T12:54:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Renato_Silva.pdf: 1149696 bytes, checksum: 90cca601f940d32033deeaeb17255312 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2015-06-29T12:54:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Renato_Silva.pdf: 1149696 bytes, checksum: 90cca601f940d32033deeaeb17255312 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-29T12:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Renato_Silva.pdf: 1149696 bytes, checksum: 90cca601f940d32033deeaeb17255312 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / S. epidermidis é o principal agente de infecções associadas a dispositivos médicos implantados, sendo sua habilidade para formar biofilme em superfícies inertes o fator determinante para a persistência desse micro-organismo. Neste estudo avaliamos 52 isolados clínicos desta espécie quanto à susceptibilidade a antimicrobianos, produção de biofilme/natureza química, presença de genes relacionados à virulência (atlE, capB,aap, embp, bhp, IS256 e IS257), e o efeito de concentrações subinibitórias (sub-CIMs) de etanol e clorexidina na produção de biofilme. Além disso, algumas das amostras biofilme-positivas foram estudadas quanto ao efeito de sub-CIMs destes antissépticos na expressão de icaA, icaR, sigB e sarA. Mais de 60% das amostras apresentaram resistência para ≥ 10 drogas e as amostras produtoras de biofilme mostraram, no geral, maior percentual de resistência a antimicrobianos. No teste em placa de microtitulação (MTP), 23 amostras foram produtoras de biofilme, sendo 14 de natureza polissacarídica, 8 proteica e 3 indeterminada. No teste em Ágar Vermelho Congo, somente amostras produtoras de biofilme polissacarídico apresentaram reação positiva. Genes do operon ica foram detectados em 23 isolados, sendo 17 destes classificados como produtores e 6 como não produtores de biofilme no MTP. A frequência dos outros genes relacionados à produção de biofilme foi: embp (69%), aap (29%) e bhp (12%), não sendo detectada correlação entre estes e a produção de biofilme do tipo PIA-independente. Os genes aap (29%) e IS256 (23%) mostraram correlações significativas com: produção de biofilme, presença de ica, perfil biofilme+/ica+, e produção de nível forte de biofilme. O gene IS256 foi ainda correlacionado significativamente com resistência a alguns antimicrobianos. Sub-CIMs de etanol (2 e/ou 4%) determinaram aumento na produção de biofilme em 15 das 17 amostras PIA-dependentes e nas 8 PIA-independentes, mas não induziram produção de biofilme em amostras originalmente não produtoras. Ao contrário do etanol, sub-CIMs de clorexidina não somente não induziram produção, como determinaram redução da produção de biofilme nas amostras biofilme-positivas. Nas amostras PIA-dependentes, o etanol (1%) acarretou aumento da expressão relativa de icaA e redução da expressão de icaR, além de aumento da expressão dos reguladores globais (sarA e sigB), enquanto a amostra PIA-independente mostrou redução na expressão destes reguladores globais. Ao contrário do etanol, a clorexidina (0,5 μg/mL) determinou aumento da expressão de icaR e redução de icaAnas amostras PIA-dependentes, além de redução na expressão de sarA e sigB na amostra PIA-independente. Os resultados indicaram que a produção de biofilme mostrou-se associada com alguns dos potenciais marcadores de virulência, sendo também evidenciada associação de alguns desses marcadores com resistência a certos antimicrobianos. As amostras PIA-dependentes foram prevalentes, destacando-se, porém, o encontro de número expressivo de amostras PIA-independentes. Os genes aap,embp e bhp não se mostraram correlacionados com a produção de biofilme proteico, indicando existência de outros mecanismos envolvidos na formação desse tipo de biofilme. Nas amostras PIA-dependentes, etanol e clorexidina mostraram efeitos opostos na expressão de icaA e icaR, corroborando dados fenotípicos previamente obtidos, e enfatizando a necessidade de ampliação do estudo da clorexidina, tendo em vista o potencial de aplicação prática deste achado. / S. epidermidis is the main agent of infections associated with implanted medical devices, being its ability to form biofilms on inert surfaces the determinant factor for the persistence of this microorganism. Fifth two clinical isolates of this species were evaluated for susceptibility to antimicrobials, biofilm production/chemical nature, presence of genes related to virulence (atlE, capB, aap, embp, bhp, IS256 andIS257), and the effect of subinibitory concentrations (sub-MICs) of ethanol and chlorhexidine in biofilm production. Moreover, some of biofilm-positive samples were studied for the effect of sub-MICs of these antiseptics in the expression of icaA, icaR, sigB and sarA. Over 60% of the samples showed resistance to ≥ 10 drugs and biofilm producers showed, in general, a higher percentage of antimicrobial resistance. In microtiter plate test (MTP), 23 strains were biofilm producers, being 4 of polysaccharide nature, 8 proteinaceous and 3 undetermined. In Congo Red Agar test, only biofilm polysaccharide producer strains showed a positive reaction. ica operon genes were detected in 23 isolates, being 17 of these classified as producers and 6 as non-biofilm producers in MTP. The frequency of other production-related biofilm genes was: embp (69%), aap (29%) and bhp (12%), no being detect a correlation between them and the production of PIA-independent biofilm. The aap (29%) and IS256 (23%) genes showed significant correlations with: biofilm production, presence of ica biofilm, biofilm+/ica+ profile, and strong level of production of biofilm. The IS256 gene was also significantly correlated with resistance to some antibiotics. Sub-MIC of ethanol (2 and / or 4%) led to an increase in biofilm production in 15 of 17 samples PIA-dependent and in the 8 PIA-independent, but did not induce biofilm production in not originally producing samples. Unlike ethanol, sub-MICs of chlorhexidine not only did not induce production as determined reduction of biofilm production in biofilm-positive samples. In PIA-dependent strains, ethanol (1%) caused an increase in the relative expression of icaAand reduced expression of icaR, in addition to increased expression of global regulators (sarA and sigB), while the PIA-independent strain showed reduction in the expression of these global regulators. Unlike ethanol, chlorhexidine (0.5 mg/mL) determined increased expression of icaR and reduction of icaA in PIA-dependent strains, besides a reduction in the expression of sarA and sigB in the PIA-independent strain. The results indicated that biofilm production was associated with some of potential virulence markers, and also evidenced some combination of these markers and resistance to certain antibiotics. The PIA-dependent strains were prevalent, highlighting, however, the encounter of significant number of PIA-independent strains. The aap, embp and bhp genes were not correlated with the production of proteinaceous biofilm, indicating the existence of other mechanisms involved in the formation of such biofilms. In PIA-dependent strains, ethanol and chlorhexidine showed opposite effects on the expression of icaA and icaR, corroborating phenotypic data previously obtained, and emphasizing the need to expand the study of chlorhexidine, in view of the potential of practical application of this finding.

Dentre as 18 espécies do gênero Yersinia, as espécies Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis foram extensivamente caracterizadas em diversos aspectos como ecologia, epidemiologia e mecanismos de patogenicidade. Sete das 15 espécies restantes (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii e Y. rohdei), usualmente conhecidas como Y. enterocolitica-like, até o momento, não tiveram seu potencial patogênico caracterizado e são, geralmente, consideradas não-patogênicas. Entretanto, dados da literatura sugerem que algumas dessas espécies possam causar doença. Esses dados estimularam o surgimento de questões sobre os mecanismos pelos quais as espécies de Y. enterocolitica-like possam interagir com as células do hospedeiros e causar doenças. Esse projeto teve como principal objetivo caracterizar o potencial patogênico de linhagens de Y. enterocolitica-like, especificamente das espécies Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. intermedia. No presente trabalho, o potencial patogênico de 118 linhagens de Y. enterocolitica-like (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia e 13 Y. kristensenii) foi avaliado pela pesquisa da presença dos genes relacionados à virulência ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB e virF por PCR. Além disso, a habilidade de algumas linhagens de Yersinia de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 após diferentes períodos de incubação, bem como, de sobreviver no interior de macrófagos humanos U937 foi testada. Aspectos morfológicos da adesão bacteriana foram visualizados por microscopia eletrônica. Finalmente, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência foi avaliada a partir do sequenciamento de RNA de uma linhagem de Y. enterocolitica-like. As linhagens estudadas apresentaram os seguintes genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) e ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) e tccC (35%); e Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) e hreP (54%). De modo geral, as linhagens de Y. enterocolitica-like tiveram a habilidade de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 inferior à da linhagem altamente patogênica Y. enterocolitica 8081. Contudo, Y. kristensenii FCF 410 e Y. frederiksenii FCF 461 apresentaram elevado potencial de invasão a células Caco-2 após cinco dias de pré-incubação, os quais foram 45 e 7,2 vezes maiores do que o controle Y. enterocolitica 8081, respectivamente, porém, o gene ail não foi detectado nessas linhagens. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 ii mostrou que as linhagens de Y. frederiksenii FCF 461 (40,0%) e Y. frederiksenii FCF 379 (24,6%) tiveram porcentagens de sobrevivência superior à de Y. enterocolitica 8081 (13,4%). Todavia, linhagens de Y. intermedia e Y. kristensenii apresentaram uma capacidade reduzida de sobreviver em macrófagos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as bactérias em contato com a filipódia celular. As bactérias foram distribuídas tanto individualmente quanto em pequenos aglomerados. Portanto, podemos concluir que a presença dos genes relacionados à virulência encontrados nas Y. enterocolitica-like estudadas indicou o possível potencial patogênico de algumas dessas linhagens. Os ensaios de adesão e invasão a células de mamíferos sugerem que a patogenicidade de Y. kristensenii e Y. frederiksenii possa ser linhagem-dependente. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 evidenciou o potencial patogênico de algumas linhagens de Y. frederiksenii. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem a existência de mecanismos de virulência alternativos aos mecanismos clássicos descritos para Y. enterocolitica patogênica. Contudo, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência não pode ser verificada, uma vez que a plataforma 454 GS Junior (Roche) não se mostrou adequada para a realização de sequenciamento de RNA de amostras provenientes de interações com células devido à baixa cobertura obtida. / Among the 18 species of the Yersinia genus, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were extensively characterized in different subjects as ecology, epidemiology and pathogenicity mechanisms. Seven among the remaining 15 species (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii and Y. rohdei), often called Y. enterocolitica-like have not their pathogenic potential characterized and are usually considered to be nonpathogenic. However, literature data suggest that some of these species can cause diseases. These data stimulate the upsurge of questions about the mechanisms of which Y. enterocolitica-like species may interact with host cells and cause diseases. The main objective of this preject was to characterize the pathogenic potential of Y. enterocolitica-like strains, specifically of the species Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. intermedia. This work evaluated the pathogenic potential of 118 Y. enterocolitica-like strains (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia and 13 Y. kristensenii) searching for the presence of the virulence-related genes ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB and virF by PCR. Besides, Yersinia strains ability of adhesion and invasion to Caco-2 and HEp-2 cells after different pre-incubation periods, and its survival within human macrophages U937 were tested. Morphologic aspects of bacterial adhesion were observed by scanning electronic microscopy. Finally, the presence of new possible virulence mechanisms was evaluated through RNA sequencing of one Y. enterocolitica-like strain. The studied strains showed the following genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) and ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) and tccC (35%); and Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) and hreP (54%). Usually Y. enterocolitica-like strains presented less ability of adhere and invade Caco-2 and HEp-2 cells than the highly pathogenic strain Y. enterocolitica 8081. On the other hand, Y. kristensenii FCF 410 and Y. frederiksenii FCF 461 showed high potential of invasion in Caco-2 cells after 5 days of pre-incubation, which were 45 and 7.2 times higher than the control Y. enterocolitica 8081 respectively, but ail gene was not found in these strains. Survival assay in human macrophages U937 showed that Y. frederiksenii FCF 461 (40.0%) and Y. frederiksenii FCF 379 (24.6%) strains presented survival percentages higher than Y. enterocolitica 8081 (13.4%). However, Y. intermedia and Y. iv kristensenii strains showed a reduced capability of surviving in macrophages. Scanning electron microscopy showed bacteria at the surface in contact with the cellular filopodia. The bacteria were distributed either individually or in small clumps. Therefore, it may be concluded that the presence of virulence-related genes in some of the Y. enterocolitica-like strains indicated their possible pathogenic potential. Mammal cells adhesion and invasion assays suggest that the pathogenicity of Y. kristensenii and Y. frederiksenii may be strain-dependent. Human macrophages U937 surviving assay highlighted the pathogenic potential of some Y. frederiksenii strains. Together, the results suggest the existence of alternative virulence mechanisms other than the classical mechanisms described for pathogenic Y. enterocolitica. However, we could not verify the presence of possible new virulence mechanisms because 454 GS Junior (Roche) platform was not suitable for RNA sequencing of strains from cells interaction due its low coverage obtained.

Dentre as 18 espécies do gênero Yersinia, as espécies Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis foram extensivamente caracterizadas em diversos aspectos como ecologia, epidemiologia e mecanismos de patogenicidade. Sete das 15 espécies restantes (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii e Y. rohdei), usualmente conhecidas como Y. enterocolitica-like, até o momento, não tiveram seu potencial patogênico caracterizado e são, geralmente, consideradas não-patogênicas. Entretanto, dados da literatura sugerem que algumas dessas espécies possam causar doença. Esses dados estimularam o surgimento de questões sobre os mecanismos pelos quais as espécies de Y. enterocolitica-like possam interagir com as células do hospedeiros e causar doenças. Esse projeto teve como principal objetivo caracterizar o potencial patogênico de linhagens de Y. enterocolitica-like, especificamente das espécies Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. intermedia. No presente trabalho, o potencial patogênico de 118 linhagens de Y. enterocolitica-like (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia e 13 Y. kristensenii) foi avaliado pela pesquisa da presença dos genes relacionados à virulência ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB e virF por PCR. Além disso, a habilidade de algumas linhagens de Yersinia de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 após diferentes períodos de incubação, bem como, de sobreviver no interior de macrófagos humanos U937 foi testada. Aspectos morfológicos da adesão bacteriana foram visualizados por microscopia eletrônica. Finalmente, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência foi avaliada a partir do sequenciamento de RNA de uma linhagem de Y. enterocolitica-like. As linhagens estudadas apresentaram os seguintes genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) e ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) e tccC (35%); e Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) e hreP (54%). De modo geral, as linhagens de Y. enterocolitica-like tiveram a habilidade de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 inferior à da linhagem altamente patogênica Y. enterocolitica 8081. Contudo, Y. kristensenii FCF 410 e Y. frederiksenii FCF 461 apresentaram elevado potencial de invasão a células Caco-2 após cinco dias de pré-incubação, os quais foram 45 e 7,2 vezes maiores do que o controle Y. enterocolitica 8081, respectivamente, porém, o gene ail não foi detectado nessas linhagens. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 ii mostrou que as linhagens de Y. frederiksenii FCF 461 (40,0%) e Y. frederiksenii FCF 379 (24,6%) tiveram porcentagens de sobrevivência superior à de Y. enterocolitica 8081 (13,4%). Todavia, linhagens de Y. intermedia e Y. kristensenii apresentaram uma capacidade reduzida de sobreviver em macrófagos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as bactérias em contato com a filipódia celular. As bactérias foram distribuídas tanto individualmente quanto em pequenos aglomerados. Portanto, podemos concluir que a presença dos genes relacionados à virulência encontrados nas Y. enterocolitica-like estudadas indicou o possível potencial patogênico de algumas dessas linhagens. Os ensaios de adesão e invasão a células de mamíferos sugerem que a patogenicidade de Y. kristensenii e Y. frederiksenii possa ser linhagem-dependente. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 evidenciou o potencial patogênico de algumas linhagens de Y. frederiksenii. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem a existência de mecanismos de virulência alternativos aos mecanismos clássicos descritos para Y. enterocolitica patogênica. Contudo, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência não pode ser verificada, uma vez que a plataforma 454 GS Junior (Roche) não se mostrou adequada para a realização de sequenciamento de RNA de amostras provenientes de interações com células devido à baixa cobertura obtida. / Among the 18 species of the Yersinia genus, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were extensively characterized in different subjects as ecology, epidemiology and pathogenicity mechanisms. Seven among the remaining 15 species (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii and Y. rohdei), often called Y. enterocolitica-like have not their pathogenic potential characterized and are usually considered to be nonpathogenic. However, literature data suggest that some of these species can cause diseases. These data stimulate the upsurge of questions about the mechanisms of which Y. enterocolitica-like species may interact with host cells and cause diseases. The main objective of this preject was to characterize the pathogenic potential of Y. enterocolitica-like strains, specifically of the species Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. intermedia. This work evaluated the pathogenic potential of 118 Y. enterocolitica-like strains (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia and 13 Y. kristensenii) searching for the presence of the virulence-related genes ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB and virF by PCR. Besides, Yersinia strains ability of adhesion and invasion to Caco-2 and HEp-2 cells after different pre-incubation periods, and its survival within human macrophages U937 were tested. Morphologic aspects of bacterial adhesion were observed by scanning electronic microscopy. Finally, the presence of new possible virulence mechanisms was evaluated through RNA sequencing of one Y. enterocolitica-like strain. The studied strains showed the following genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) and ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) and tccC (35%); and Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) and hreP (54%). Usually Y. enterocolitica-like strains presented less ability of adhere and invade Caco-2 and HEp-2 cells than the highly pathogenic strain Y. enterocolitica 8081. On the other hand, Y. kristensenii FCF 410 and Y. frederiksenii FCF 461 showed high potential of invasion in Caco-2 cells after 5 days of pre-incubation, which were 45 and 7.2 times higher than the control Y. enterocolitica 8081 respectively, but ail gene was not found in these strains. Survival assay in human macrophages U937 showed that Y. frederiksenii FCF 461 (40.0%) and Y. frederiksenii FCF 379 (24.6%) strains presented survival percentages higher than Y. enterocolitica 8081 (13.4%). However, Y. intermedia and Y. iv kristensenii strains showed a reduced capability of surviving in macrophages. Scanning electron microscopy showed bacteria at the surface in contact with the cellular filopodia. The bacteria were distributed either individually or in small clumps. Therefore, it may be concluded that the presence of virulence-related genes in some of the Y. enterocolitica-like strains indicated their possible pathogenic potential. Mammal cells adhesion and invasion assays suggest that the pathogenicity of Y. kristensenii and Y. frederiksenii may be strain-dependent. Human macrophages U937 surviving assay highlighted the pathogenic potential of some Y. frederiksenii strains. Together, the results suggest the existence of alternative virulence mechanisms other than the classical mechanisms described for pathogenic Y. enterocolitica. However, we could not verify the presence of possible new virulence mechanisms because 454 GS Junior (Roche) platform was not suitable for RNA sequencing of strains from cells interaction due its low coverage obtained.