Os tióis são importantes para manter as funções celulares. A glutationa (GSH) é um importante peptídeo redutor que repara biomoléculas oxidadas envolvidas na sinalização celular e atua como “scavenger” de bioradicais, quando, neste último caso, forma-se o radical glutationila (GS•). Para investigar o papel dos radicais tiila (RS•) durante o “burst” respiratório de macrófagos, foi usado o nitróxido 4-9((- acridinecarbonil)-amino)-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (Ac-Tempo) o qual reage com radicais, particularmente tiila e radicais centrados no carbono, apagando o sinal de EPR, enquanto ocorre aumento de fluorescência da acridina (lex 361 nm, lem 440 nm) (Borisenko et al. JACS 126, 9221, 2004). Macrófagos de focos inflamatórios peritoneais não estimuladas mostraram um baixo sinal de fluorescência acompanhado pela manutenção do sinal de EPR característico do Ac-Tempo. Estímulo celular com PMA, na presença de Ac-Tempo, elicitou sinal de fluorescência dose-dependente, em sincronia com a redução do sinal de EPR e com consumo de O2. Mudanças na intensidade do sinal de fluorescência e de EPR foram dependentes dos níveis celulares de GSH, demonstrado pelo pré-tratamento das células com butionina sulfoximina (BSO) e N-etilmaleimida (NEM ). O tratamento celular com o nitróxdio determinou diminuição do processo de S-glutationação protéica associado à atividade do complexo NADPH oxidase. Os resultados sugerem um papel central de radicais tiila, provavelmente GS•, na manutenção do “burst” respiratório de macrófagos e apontam os nitróxidos como protótipos de antiinflamatórios. / Thiols are required to maintain cellular functions. For instance, glutathione (GSH) is an important reductant to repair oxidized biomolecules, to cycle proteins involved in cell signaling and to scavenge bioradicals, although the relatively reactive glutathionyl radical (GS•) is produced in the latter case. To investigate GS• participation in macrophage respiratory burst, we employed the nitroxide 4-9((-acridinecarbonil)-amino)- 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxil (Ac-Tempo) whose interaction with GS• and carbon centered radicals switches off Ac-Tempo EPR signal while switching on acridine moiety fluorescence (ëexc 361 nm, ëemi 440 nm) (Borisenko et al JACS 126, 9221,2004). Inflammatory macrophages unstimulated displayed low fluorescence accompanied by maintenance of Ac-Tempo EPR signal. Cells stimulated with PMA in the presence of Ac- Tempo elicited a dose-dependent fluorescence in synchrony with EPR signal decay and O2 consumption. Changes in fluorescence and EPR signal intensity were dependent on GSH levels as demonstrated by pre-treatment of cells with buthionine sulfoximine and N-ethylmaleimide. The macrophage protein S-glutathionylation process due to NADPH oxidase activation was significantly decreased under Ac-Tempo cellular treatment. These results suggest a role of thiyl radicals in the maintenance of the macrophages respiratory burst and may provide a therapeutic target for inflammation management. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-11-18T17:15:19Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao Jorge Luiz Vieira dos Anjos.pdf: 1923779 bytes, checksum: 68298e97b9af0abd00eec5540da11ee7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-11-18T17:15:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao Jorge Luiz Vieira dos Anjos.pdf: 1923779 bytes, checksum: 68298e97b9af0abd00eec5540da11ee7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-18T17:16:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao Jorge Luiz Vieira dos Anjos.pdf: 1923779 bytes, checksum: 68298e97b9af0abd00eec5540da11ee7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2008-02-18 / The interaction of the skin penetration enhancers DL-menthol, -terpineol, 1,8-cineole and (+)-limonene with membranes of the uppermost skin layer, the stratum corneum (SC) and with multilamellar vesicles from 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphaticylcholine (DPPC)is investigated by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy using spin-labeled analogs of androstanol ASL),stearic acid (5-DSA), methyl stearate (5-DMS) and a small spin label 2,2,6,6-tetramethylpiperedine-1-oxyl (TEMPO). The terpenes were added to SC samples using ethanol as a co-solvent (20% ethanol in the buffer), the effect of ethanol on the SC also was investigated. The spectra of spin labels ASL, 5-DSA and 5-DMS in the membranes of SC are characterized by the presence of two spectral components differing in mobility.Component 1 was attributed to the spin labels H-bonded to the headgroups, while component 2 was assigned to the spin labels H-bonded to water molecules or temporally non-hydrogen-bonded. EPR results showed that ethanol in the range 0-70% did not alter the fluidity in SC membranes or the relative fractions of these two components. Instead, ethanol only caused a selective extraction of spin labels, indicating that ethanol acts as extractor and not as fluidizer when facilitates molecular permeation in the skin. Addition of 1% DLmenthol to the solvent containing 20% ethanol increases both the mobility and the fraction of spin labels in the component 2 (more mobile spectral component). Similarly, with the addition of 1,8-cineole, the spin probes were gradually transferred from the motionally more restricted component 1 to the more mobile component 2. The spectrum of the spin label TEMPO in the membranes of SC allows for the determination of the actual partition coefficient and rotational diffusion rates of the spin probe in the aqueous and hydrocarbon environments. The enthalpy changes,H°,to transfer the spin probe from the aqueous to the hydrocarbon phase, as well as the activation energies associated to its rotational motion, were considerably smaller for SC when compared to DPPC, indicating less pronounced thermal reorganizations for SC samples. For DPPC,all terpenes increased both the partition coefficient and the rotational diffusion rate of the spin label in the membrane, except in the liquid-crystalline phase. These results suggest that the terpenes,effectively acting as spacers in the membrane,fluidize the lipids and cause ruptures in the hydrogen-bonded network of the membrane-water interface, with consequent displacements of spin probes towards the hydrophobic core. The EPR spectra of maleimide derivative spin label (6-MSL)covalently attached to stratum corneum proteins indicate that 1,8-cineole does not alter the dynamics of protein backbones.Instead, this terpene only increases the solvent s ability to dissolve and mobilize the nitroxide side chain, which is in agreement with its low irritation response. / A interação dos aumentadores de permeação da pele DL-mentol, -terpineol, 1,8-cineole e (+)-limoneno com as membranas da camada mais externa da pele, o estrato córneo (EC) e com vesículas multilamelares de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphaticylcholine (DPPC) foi investigado por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) utilizando marcadores de spin análogos do androstanol (ASL), acido esteárico (5-DSA) e estearato de metila (5-DMS), além de um pequeno marcador anfifílico, o 2,2,6,6-tetramethylpiperedine-1-oxyl (TEMPO), que se particiona entre as fases aquosa e hidrocarbônica. Como os terpenos foram adicionados ao EC usando soluções do etanol a 20% no tampão, foram também investigados os efeitos do etanol sobre as membranas do EC. Os espectros dos marcadores de spin ASL, 5-DSA e 5-DMS nas membranas de EC são caracterizados pela presença de duas componentes espectrais diferindo em mobilidade. A componente 1 foi atribuída aos marcadores de spin que formam ligações de hidrogênio com os grupos polares da membrana, enquanto que a componente 2 foi atribuída aos marcadores de spin que formam ligações de hidrogênio com as moléculas de água ou que, temporariamente, não estão formando ligações de hidrogênio. Os resultados de RPE mostraram que o etanol em concentrações variando de 0-70% não causa alteração de fluidez nem alteração das frações relativas das duas componentes espectrais. Ao invés disso, o etanol apenas causou uma seletiva extração dos marcadores lipídicos, indicando que os efeitos do etanol como facilitador advém de sua capacidade de extrair lipídios da membrana. Com a adição de 1% de L-mentol ao solvente contendo 20% de etanol houve um aumento tanto da mobilidade quanto da fração dos marcadores de spin da componente 2 (componente espectral mais móvel). Analogamente, com a adição de 1,8-cineole, os marcadores de spin foram gradualmente transferidos da componente 1, de mobilidade mais restrita, para a componente 2 mais móvel. O espectro do marcador de spin TEMPO nas membranas de EC permite determinar o coeficiente de partição e a taxa de difusão rotacional do marcador de spin nos ambientes aquoso e hidrofóbico. As mudanças de entalpia, H°, para transferir o marcador de spin da fase aquosa para fase hidrocarbônica, bem como as energias de ativação associadas com o movimento rotacional, foram consideravelmente menores para o EC em relação às amostras de DPPC, indicando reorganizações térmicas menos pronunciadas para as membranas do EC. Para DPPC, todos os terpenos aumentaram tanto o coeficiente de partição quanto a taxa de difusão rotacional dos marcadores de spin na membrana, exceto na fase líquido-cristalina. Estes resultados sugerem que os terpenos agem efetivamente como espaçadores dos lipídios da membrana reduzindo seu empacotamento e aumentando sua fluidez, desse modo causando rupturas da rede de ligações de hidrogênio na interface membrana-água e assim gerando deslocamentos dos marcadores de spin para o core hidrofóbico. O espectro de RPE do marcador de spin derivado do maleimido (6-MSL) covalentemente ligado às proteínas do EC indicou que o 1,8-cineole não altera a dinâmica do esqueleto protéico. Ao invés disso, este terpeno apenas aumenta a habilidade do solvente em dissolver e mobilizar a cadeia lateral do nitróxido, o que está em acordo com seu baixo potencial de irritação.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:15:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jorge Luiz Vieira dos Anjos.pdf: 4028971 bytes, checksum: 465f3f841d85c1929df7648b16aeb163 (MD5) Previous issue date: 2012-08-02 / Human plasma contains primarily large proteins, ranging in composition and concentration as the individual's physiological state. Among these proteins, albumin and low density lipoprotein (LDL) have been widely studied. The albumin (the most abundant protein in blood plasma) is responsible for important functions in the human body due to its excellent ability to bind and transport small molecules. In turn, the LDL (responsible for transporting cholesterol to the cells) in its oxidized form is directly associated with atherosclerosis, the main cause of cardiovascular disease. In the first part of this work, the interaction of bovine serum albumin (BSA) with the ionic surfactants sodium dodecylsulfate (SDS), cetyltrimethylammonium chloride (CTAC) and N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate (HPS) was studied by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy of spin label covalently bound to the single free thiol group of the protein. In the second part was studied the oxidation of human LDL by copper ions and also the antioxidant potential of polyphenols resveratrol, (+)-catechin and quercetin, using the EPR of a spin label, derived from stearic acid (5-DSA), and the method malondialdehyde content (MDA). Part I: The dynamics of the BSA and the thermodynamic parameters for transferring the nitroxide side chain from the more motionally restricted to the less restricted component were monitored through EPR spectra simulation. Whereas SDS and CTAC showed similar increases in the dynamics of the protein backbone for all concentrations used, HPS presented a smaller effect at concentrations above 1.5mM. At 10mM of surfactants and 0.15 mM BSA, the standard Gibbs free energy change was consistent with protein backbone conformations more expanded and exposed to the solvent, but with a less pronounced effect for HPS. In the presence of the surfactants, the enthalpy change, related to the energy required to dissociate the nitroxide side chain from the protein, was greater, suggesting a lower water activity. The nitroxide side chain also detected a higher viscosity environment in the vicinity of the Mal-5 induced by the addition of the surfactants. The results suggest that the surfactant-BSA interaction, at higher surfactant concentration, is affected by the affinities of the surfactant to its own micelles and micelle-like aggregates. Complementary DLS (Dynamic Light Scattering) data suggests that the temperature induced changes monitored by the Mal-5 reflects local changes in the vicinity of Cys-34 BSA residue. Part II: The oxidative process induced by copper ions results in lipid peroxidation of LDL (evidenced by high concentration of MDA) could also be monitored by the decrease in the dynamics of 5-DSA, reflected in increased spectral parameter 2A//. The oxidation of LDL resulted in increased energy barrier that the spin labels must overcome to achieve higher degrees of motion. All polyphenols studied were able to protect LDL completely against oxidation for concentrations from 30 M, whereas the protection provided by the Butylated hydroxytoluene (BHT) occurred only partially. This result, based on data from the literature, was attributed to the ability of polyphenols act as scavenger and chelating agents, while the BHT acts just like scavenger due the presence of only a single hydroxyl group in its molecule. / O plasma humano contém principalmente grandes proteínas, com variação na composição e concentração conforme o estado fisiológico do individuo. Entre essas proteínas, a albumina e a lipoproteína de baixa densidade (LDL) têm sido amplamente estudadas. A albumina (proteína mais abundante do plasma sanguíneo) é a responsável por importantes funções no organismo humano devido a sua excelente capacidade de se ligar e transportar pequenas moléculas. Por sua vez, a LDL (responsável pelo transporte de colesterol para as células) em sua forma oxidada está diretamente associada à aterosclerose, principal causa de doenças cardiovasculares. Na primeira parte deste trabalho, a interação da albumina de soro bovino (BSA) com os surfactantes iônicos dodecil sulfato de sódio (SDS), cloreto de cetiltrimetilamônio (CTAC) e N-hexadecil-N,N, dimetil-3-3amônio-1-propano sulfonato (HPS) foi estudada através da espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) do marcador de spin Mal-5 ligado covalentemente na cadeia lateral do resíduo Cys-34 da BSA. Na segunda parte foi estudada a oxidação da LDL humana por íons de cobre e também o potencial antioxidante dos polifenóis resveratrol, (+)-catequina e quercetina, usando a RPE de um marcador de spin derivado do ácido esteárico (5-DSA) e o método de formação de malondialdeído (MDA). Parte I: A dinâmica da BSA e os parâmetros termodinâmicos para transferir a cadeia lateral do nitróxido da componente de movimento mais restrito para a componente menos restrita foram monitorados através da simulação dos espectros de RPE. Enquanto o SDS e o CTAC mostraram efeitos similares na dinâmica da proteína para todas as concentrações usadas, o HPS apresentou menor efeito em concentrações acima de 1,5 mM. Em 10 mM de surfactantes e 0,15 mM de BSA, a variação da energia livre padrão de Gibbs foi consistente com a conformação da cadeia proteica mais expandida e mais exposta ao solvente, mas com um efeito menos pronunciado para o HPS. Na presença dos surfactantes, a variação de entalpia, relacionada a energia necessária para dissociar a cadeia lateral do nitróxido da proteína, foi grande, sugerindo uma menor atividade da água. A cadeia lateral do nitróxido também detectou um ambiente com maior viscosidade nas vizinhanças do Mal-5 induzida pela adição dos surfactantes. Os resultados sugerem que a interação surfactante-BSA, em altas concentrações, é afetada pela afinidade do surfactante por suas próprias micelas e agregados micelares incorporados na proteína. Complementarmente, dados obtidos com DLS (Dynamic Light Scattering) sugerem que as mudanças induzidas pela temperatura que são monitoradas pelo Mal-5 são mudanças locais na vizinhança do único resíduo Cys-34 da BSA. Parte II: O processo oxidativo induzido pelos íons de cobre resulta na peroxidação dos lipídios da LDL (evidenciado pela elevação da concentração de MDA) também pôde ser monitorado pela diminuição na dinâmica do marcador de spin 5-DSA refletida no aumento do parâmetro espectral 2A//. A oxidação da LDL acarretou no aumento da barreira da energia que os marcadores de spin precisam superar para alcançar graus superiores de movimento. Todos os polifenóis estudados foram capazes de proteger completamente a LDL contra a oxidação em concentrações a partir de 30 M, enquanto que a proteção fornecida pelo butil-hidroxi-tolueno (BHT) se deu apenas parcialmente. Este resultado, baseado em dados da literatura, foi atribuído à capacidade dos polifenóis atuarem tanto como scavenger quanto como quelantes, ao passo que o BHT é capaz de atuar apenas como scavenger devido à presença de apenas uma única hidroxila em sua molécula.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-07-25T13:32:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-26T12:05:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T12:05:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2002-12-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The main function of the most superficial layer of the epidermis, the Stratum Corneum (SC), is to provide a physical barrier that controls the transepidermal water loss as well as the permeation of another substances in both directions across the skin. The SC is formed by anabolically dead cells, the terminally differentiated corneocyte, and its function is essentially accomplished by forming a highly insoluble protein structure on the surface of the corneocytes, termed the cornified cell envelope, and by impeding water diffusion across the SC by mortaring the corneocytes together by layers of skin-specific lipids, essentially ceramide, cholesterol and fatty acid. In this work the cell envelope of the SC was spin labeled with a sulfhydryl-specific nitroxide reagent to investigate the water content effects upon the protein dynamics directly in the intact tissue. A two-state model for the nitroxide side chain described the coexistence of two spectral components in the electron paramagnetic resonance (EPR) spectra. The so-called strongly immobilized component, S, is associated with the EPR signal of a motionally restricted nitroxide fraction having its N-O group hydrogen bonded to protein (rigid structure) while the weakly immobilized component, W, corresponds to the signal provided by the spin labels with higher mobility (~10 times greater) exposed to the aqueous environment. The relative populations between these two mobility states, S and W, are in thermodynamic equilibrium. The standard Gibbs free energy, enthalpy and entropy changes for transferring the nitroxide side chain from the state contacting the solvent, W, to the one contacting protein, S, indicated that the reduction of the SC water content to below ~h 0.69, g H2O per g dry SC, stabilizes the protein interacting state, S. Upon decreasing the SC hydration level below ~h 0.69 the segmental motion of the polypeptide chains and the rotational motion of the spin-labeled side chain were also constrained. To test our methodology in a pure and very well known protein, we also studied the effects of two types of detergents on the bovine serum albumin (BSA). Both detergents, the anionic sodium dodecyl sulfate (SDS) and the zwitterionic N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonium-1-propanesulfonate (HPS) increase the mobility of the protein backbone and of the nitroxide side chain. The thermodynamic parameters indicated that these detergents destabilize the protein favoring less compact conformations. This work can also be useful to improve the spectral analysis of site-directed spin labeling, especially for a more quantitative description in terms of thermodynamic parameters. / A camada mais superficial da epiderme, o Estrato Córneo (EC), tem como função principal a formação de uma barreira física que controla a perda de água do corpo bem como a permeação de outras substâncias em ambas as direções da pele. O EC é formado por células anabolicamente mortas, os corneócitos, os quais sofreram diferenciação celular terminal, e sua função é realizada formando uma estrutura de proteínas altamente insolúveis na superfície do corneócito, chamada de envelope celular, e também uma matriz lipídica, essencialmente ceramídios, colesterol e ácidos graxos, que dificultam a difusão da água. Neste trabalho, o EC foi marcado com marcadores de spin específicos para reagir com os grupos sulfidrilas das proteínas, para investigar os efeitos do conteúdo de água na dinâmica de proteínas diretamente no tecido intacto. Um modelo de dois estados para a cadeia lateral do nitróxido descreveu a coexistência de duas componentes espectrais de ressonância paramagnética eletrônica (RPE). A componente denominada fortemente imobilizada (S), surge de uma fração de marcadores com o átomo de oxigênio do nitróxido ligado à proteína (estrutura rígida) enquanto a componente fracamente imobilizada é gerada pelos marcadores com mobilidade mais alta (~10 vezes maior) e expostos ao ambiente aquoso. As populações relativas entre estes dois estados de mobilidade, S e W, estão em equilíbrio termodinâmico. Os parâmetros da termodinâmica: energia livre padrão de Gibbs, entalpia e entropia, envolvidos na transferência da cadeia lateral do nitróxido do estado W, contatando ao solvente, para o estado S, contatando a proteína, indicaram que a redução do conteúdo de água para abaixo de ~0.69g de H2O por g de EC seco, estabiliza o estado S (cadeia lateral do nitróxido dobrada sobre a cadeia principal da proteína). Ao diminuir o nível de hidratação para abaixo de ~ h 0.69 (g H2o/g EC seco) o movimento local da cadeia polipeptídica e o movimento rotacional da cadeia lateral do marcador de spin foram ambos reduzidos. Para testar nossa metodologia em uma proteína pura e bem conhecida, estudamos os efeitos de dois tipos de detergentes sobre a albumina do soro bovino (BSA). Ambos os detergentes, o aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS) e o ziteriônico N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propanosulfonato (HPS) aumentaram a mobilidade da cadeia principal da proteína e da cadeia lateral do nitróxido. Os parâmetros termodinâmicos indicaram que estes detergentes desestabilizam a proteína favorecendo conformações menos compactas. Os resultados do presente trabalho também podem contribuir para aprimorar a