Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O objetivo deste trabalho foi examinar o impacto da movimentação dentária de dentes periodontalmente comprometidos no volume do fluido gengival crevicular (FGC) e nos níveis de expressão das metaloproteinases de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -12 e -13 no FGC. Dez pacientes periodontalmente controlados (8 do sexo feminino e 2 do sexo masculino, média de idade de 46,2 10,4 anos) com incisivos projetados labialmente foram submetidos a tratamento ortodôntico. Uma arcada dentária foi submetida a movimentação ortodôntica e a arcada oposta foi usada como controle. Amostras de FGC foram coletadas da face lingual de dois incisivos do lado movimento e dois do lado controle uma semana antes da ativação ortodôntica (-7d), imediatamente após a ativação ortodôntica, e após 1 h, 24 h, e 7, 14 e 21 dias. A coleta do FGC foi feita utilizando-se tiras de papel absorvente e o volume foi calculado através do uso do Periotron. Todos os pacientes receberam orientações de higiene bucal e um kit contendo escova de dente, pasta de dente e bochecho de Chlorexidina 0,12% para ser usado durante todo o experimento. A técnica da multianálise imunoenzimática com microesferas foi usada para medir as MMPs no FGC. Os dados foram analisados utilizando-se os testes estatísticos Friedman e Mann-Whitney. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas no volume do FGC. Em relação aos níveis de MMPs, a única diferença estatisticamente significativa encontrada no decorrer do tempo foi nos níveis de MMP-1 no grupo movimento (p<0,05). Quando os dois grupos foram comparados após a ativação, a única diferença estatisticamente significativa encontrada foi nos níveis de MMP-12 24 horas após a ativação (p<0,05). Estes achados sugerem que o volume de FGC não sofre alteração relacionada ao movimento dentário ortodôntico e que o movimento ortodôntico de dentes periodontalmente comprometidos não resultou em mudanças significativas nos níveis de MMPs no FGC. / The aim of this study was to evaluate whether orthodontic tooth movement of periodontally compromised teeth would result in detectable changes in gingival crevicular fluid (GCF) volume and in the levels of matrix metalloproteinases (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -12 and -13 in the GCF. Ten controlled periodontitis subjects (8 females and 2 males, mean age of 46.2 10.4 years) with flared incisors were submitted to orthodontic treatment. One dental arch was subjected to orthodontic movement, and teeth in the opposite arch were used as controls. GCF samples were collected from the lingual sites of two test and two control incisors one week before orthodontic activation (-7d), immediately after orthodontic activation, and after 1 h, 24 h, and 7, 14 and 21 days. Filter paper strips were used in combination with a Periotron for GCF volume measurements. All patients received hygiene instructions and a kit containing toothbrush, fluoride dentifrice and gluconate chlorexidine 0.12% mouthwash to be used during all experiment. Multiplexed bead immunoassay was used to measure MMPs in GCF. Data were analyzed using Friedman and Mann-Whitney statistical tests. There were no statistically significant differences over time in the GCF volume for any of the two groups. Regarding the MMPs levels, the only significant change found over time was in the levels of MMP-1 in the movement group (p<0.05). When the two groups were compared after activation, the only statistically significant difference found was in levels of MMP-12 24 h after activation (p<0.05). This findings suggested that the GCF volume could not be associated to orthodontic movement and that the orthodontic movement of periodontally compromised teeth did not result in significant changes in the GCF levels of MMPs.

abstract: Cancer is a disease that affects millions of people worldwide each year. The metastatic progression of cancer is the number one reason for cancer related deaths. Cancer preventions rely on the early identification of tumor cells as well as a detailed understanding of cancer as a whole. Identifying proteins specific to tumor cells provide an opportunity to develop noninvasive clinical tests and further our understanding of tumor biology. Using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) a short peptide was identified in pancreatic cancer patient plasma that was not found in normal samples, and mapped back to QSOX1 protein. Immunohistochemistry was performed probing for QSOX1 in tumor tissue and discovered that QSOX1 is highly over-expressed in pancreatic and breast tumors. QSOX1 is a FAD-dependent sulfhydryl oxidase that is extremely efficient at forming disulfide bonds in nascent proteins. While the enzymology of QSOX1 has been well studied, the tumor biology of QSOX1 has not been studied. To begin to determine the advantage that QSOX1 over-expression provides to tumors, short hairpin RNA (shRNA) were used to reduce the expression of QSOX1 in human tumor cell lines. Following the loss of QSOX1 growth rate, apoptosis, cell cycle and invasive potential were compared between tumor cells transduced with shQSOX1 and control tumor cells. Knock-down of QSOX1 protein suppressed tumor cell growth but had no effect on apoptosis and cell cycle regulation. However, shQSOX1 dramatically inhibited the abilities of both pancreatic and breast tumor cells to invade through Matrigel in a modified Boyden chamber assay. Mechanistically, shQSOX1-transduced tumor cells secreted MMP-2 and -9 that were less active than MMP-2 and -9 from control cells. Taken together, these results suggest that the mechanism of QSOX1-mediated tumor cell invasion is through the post-translational activation of MMPs. This dissertation represents the first in depth study of the role that QSOX1 plays in tumor cell biology. / Dissertation/Thesis / Ph.D. Molecular and Cellular Biology 2012

Introdução O papel das alterações hemodinâmicas sobre o remodelamento do ventrículo esquerdo tem sido pouco estudado, especialmente na hipertrofia cardíaca por sobrecarga de volume. A queda da pressão arterial sistêmica e o aumento da pressão de enchimento do ventrículo esquerdo afetam negativamente a pressão de perfusão miocárdica e podem, assim, prejudicar a perfusão subendocárdica, preferencialmente. As conseqüências para o remodelamento do ventrículo esquerdo ainda não foram determinadas. Objetivos Os objetivos do presente estudo foram investigar o papel da pressão de perfusão coronariana (PPC) no remodelamento subendocárdico e os possíveis efeitos sobre a função cardíaca em um modelo de fístula aorto-cava. Métodos Ratos machos Wistar, pesando 330-350 g, foram submetidos ao modelo de fístula aorto-cava (grupo FAC) ou à cirurgia fictícia - sham (grupo SH). Duas avaliações hemodinâmicas foram realizadas: hemodinâmica inicial, com uma semana de cirurgia e hemodinâmica final, com oito semanas de cirurgia. Duas regiões do ventrículo esquerdo foram examinadas: a região subendocárdica (SE) e a região não subendocárdica (não SE). O fluxo miocárdico foi determinado com microesferas coloridas na semana 1. A expressão e a atividade de metaloproteinase (MMP), o estresse oxidativo, os níveis de citocinas, a atividade de mieloperoxidase e a fração de volume do colágeno foram determinados na semana 8. A estrutura e a função cardíacas foram avaliadas com ecocardiografia realizada na semana 8. Resultados Comparado ao grupo SH, FAC apresentou PPC inicial (86+ - 3 mmHg vs. 52 + - 5 mmHg; P <0,0001) e PPC final (86+ - 2 mmHg vs. 54 + - 4 mmHg, P <0,0001) menores e +dP/dt (5917+ - 266 mmHg/s vs. 4511 + - 285 mmHg/s; P = 0,0021) e - dP/dt (5639 + - 396 mmHg/s vs. 4343 + - 274 mmHg/s; P = 0,0121) finais menores. Também, a fração de encurtamento (55,8 + - 1,2% vs. 45,1 + - 2,1%; P = 0,0014) e a espessura relativa de parede do ventrículo esquerdo (0,72 + - 0,02 vs. 0,58 + - 0,03; P = 0,0058) foram menores. Ainda em FAC, o fluxo miocárdico foi menor em SE (2,7 + - 0,5 mL/min/g) comparado a não SE (4,8 + - 0,8 mL/min/g) e também menor comparado a SE (6,7 + - 0,4 mL/min/g) e não SE (7,5 + - 0,5 mL/min/g) de SH. A expressão e a atividade da MMP-2 predominaram em SE de FAC, particularmente nos animais com PPC <60 mmHg. Aumento dos níveis de IL-1beta e IL-6 foram também predominantes em SE de FAC. Já a atividade da mieloperoxidase e os níveis de TNF-alfa e IL-10 foram comparáveis entre os grupos. Comparado a SH, FAC apresentou maior fração de volume do colágeno tanto em SE (1,1+ - 0,1% vs. 7,7 + - 0,4%; P <0,0001) quanto em não SE (1,0 + - 0,1% vs. 4,9 + - 0,3%, P <0,0001). Das variáveis hemodinâmicas, a análise multivariada demonstrou que a PPC inicial foi a única associada de forma independente com a fibrose SE (R2 = 0,76; P <0,0001), com a +dP/dt (R2= 0,55; P = 0,0004) e com a -dP/dt (R2= 0,91; P <0,0001). Houve correlação da PPC final com a expressão (R2 = 0,55; P <0,0001) e a atividade da MMP-2 (R2 = 0,88; P <0,0001) e da fibrose SE com a +dP/dt (R2 = 0,55; P = 0,0004) e com a -dP/dt (R2 = 0,85; P <0,0001). Conclusão Na fístula, a diminuição da PPC está associada a dano em SE, representado por isquemia, estresse oxidativo, aumento de citocinas e de MMP-2, com desenvolvimento de fibrose. O remodelamento de SE interfere negativamente na função do ventrículo esquerdo. / Introdution The role of hemodynamic changes in left ventricular remodeling has been poorly investigated, especially in the context of volume overload cardiac hypertrophy. Low diastolic blood pressure and high left ventricular filling pressure are expected to negatively affect coronary driving pressure and thereby put in jeopardy subendocardial perfusion, in particular. The consequences to global left ventricular remodeling remain undetermined. Objectives The aim of this study was to investigate the role of coronary driving pressure (CDP) in the development of subendocardial remodeling and the conceivable effects on cardiac function, using a rat model of aortocaval fistula. Methods Wistar rats weighting 330-350 g were submitted to aortocaval fistula (ACF group) or sham (SH group) operations. Two hemodynamic measurements were determined following surgery: initial, at week 1; and final, at week 8. Two distinct myocardial layers were examined: the subendocardium (SE) and the non-subendocardium (non SE). Myocardial blood flow was determined at week 1. Metalloproteinase expression and activity, oxidative stress, cytokine levels, myeloperoxidase activity, and fibrosis deposition were assessed at week 8. Cardiac structure and function were determined by means of echocardiography at week 8. Results Compared with SH, ACF showed lower initial (86 + - 3 mmHg vs. 52 + - 5 mmHg; P <0.0001) and final (86+ - 2 mmHg vs. 54 + - 4 mmHg, P <0.0001) CDP and lower final +dP/dt (5917 + - 266 mmHg/s vs. 4511+ - 285 mmHg/s; P = 0.0021) and -dP/dt (5639?396 mmHg/s vs. 4343 + - 274 mmHg/s; P = 0.0121). Left ventricular fractional shortening (55.8 + - 1.2% vs. 45.1+ - 2.1%; P = 0.0014) and relative wall thickness were also lower (0.72 + - 0.02 vs. 0.58 + - 0.03; P = 0.0058). ACF showed lower myocardial blood flow in SE (2.7 + - 0.5 mL/min/g) as compared with non SE (4.8 + - 0.8 mL/min/g) and as compared with both SE (6.7 + - 0.4 mL/min/g) and non SE (7.5 + - 0.5 mL/min/g) regions in SH. Metalloproteinase-2 expression and activity predominated in SE of ACF animals, particularly in those with CDP <60 mmHg. Increased levels of IL-6 and IL-1beta also predominated in SE of ACF. Otherwise, myeloperoxidase activity, and TNF-alfa and IL-10 levels were similar in both groups. Compared with SH, ACF showed higher collagen volume fraction in SE (1.1 + - 0.1% vs. 7.7 + - 0.4%; P <0.0001) and non SE (1.0 + - 0.1% vs. 4.9 + - 0.3%, P <0.0001) regions. Multivariate analyses disclosed initial CDP as the only hemodynamic parameter independently associated with SE fibrosis (R2 = 0.76; P <0.0001) and with +dP/dt (R2= 0.55; P = 0.0004) and -dP/dt (R2= 0.91; P <0.0001). Final CDP correlated with both the expression (R2 = 0.55; P <0.0001) and the activity of metalloproteinase-2 (R2 = 0.88; P <0.0001) and SE fibrosis correlated with both +dP/dt (R2 = 0.55; P = 0.0004) and -dP/dt (R2 = 0.85; P <0.0001). Conclusion Low coronary driving pressure early in the course of ACF is associated with SE damage characterized by ischemia, oxidative stress, increase in cytokines and MMP-2, the development of fibrosis and by this mechanism interferes negatively in left ventricular function.

A degradação da dentina pelas metaloproteinases da matriz (MMPs) pode facilitar a progressão de lesões erosivas. Objetivos: Avaliar, por meio de uma série de 5 subprojetos: 1) A atividade de MMPs em dentina bovina e humana; 2) O efeito do chá verde contra erosão/abrasão de dentina; 3 e 4) Géis contendo inibidores de MMPs (epigallocatechin-3-galatte-EGCG, clorexidina-CHX e sulfato ferroso-FeSO4) sobre a prevenção de erosão de dentina sozinha ou associada à abrasão, respectivamente, e 5) Sobre a degradação de colágeno e desgaste. Material e Métodos: 1) Extração proteica de dentina de coroa e raiz bovina e humana foi realizada (ácido cítrico a 0,87 M, pH 2,3) e testada por zimografia e atividades gelatinolíticas; 2) Voluntários (n=10) bochecharam chá verde ou água (1 min, 10 mL) entre os desafios erosivos (Coca-Cola, pH 2,6, 4x/dia/5 min, extraoralmente) e abrasivos. A abrasão (escova elétrica + dentifrício não fluoretado) foi realizada imediatamente ou 30 min depois da erosão por 30 s. O desgaste da dentina foi analisado por perfilometria (µm); 3 e 4) Voluntários (n=10-13) utilizaram dispositivos palatinos contendo 12 blocos de dentina e distribuídos aleatoriamente para 6 grupos, de acordo com o tipo de gel aplicado ou não (não tratado-NT). Os géis tinham composição idêntica, exceto pela presença de EGCG (400 µM), CHX (0,012%), FeSO4 (1 mM), flúor (NaF-1,23%) ou sem ativo (Placebo-P). Os géis foram ou não aplicados sobre os espécimes em fina camada e removidos depois de 1 min. A erosão (Coca-Cola, pH 2,6, 4x5min/dia, extraoralmente) foi realizada por 5 ou 10 dias, respectivamente. A cada dia, depois do primeiro e último desafios erosivos, os blocos eram (ERO) ou não escovados (ERO+ABR) por 15 s (escova elétrica + solução de dentifrício não fluoretado). O desgaste da dentina foi avaliado por perfilometria (µm) depois de 5 e 10 dias. 5) Dentina (n=45/grupo) foi desmineralizada com ácido cítrico (0,87 M, pH 2,3) por 36 h. Na sequência, foi ou não tratada (NT) com os mesmos géis descritos acima e estocada em saliva artificial (5 dias, 37ºC), contendo inibidores de protease EDTA-free e colagenase (Clostridium histolyticum, 238 U/mL). A degradação de colágeno foi analisada pelo conteúdo de hidroxiprolina (µg/mL) e o desgaste dentinário avaliado por perfilometria (µm, n=12/grupo,). Os dados foram analisados por ANOVA (p<0,05). Resultados: A dentina bovina mostrou ser um substrato confiável para estudos envolvendo atividades de MMPs. O chá verde reduziu o desgaste dentinário para todas as condições. A média de desgaste e de degradação de colágeno foi significativamente reduzida para os géis experimentais quando comparados aos géis NaF e P ou NT, em todos os protocolos testados. Para ERO, o desgaste não aumentou significativamente com tempo, enquanto que para ERO+ABR, foi observado um aumento significativo com o tempo para os gel de NaF e NT. Conclusão: O uso de bochecho com chá verde, bem como de um gel como veículo de aplicação de inibidores de MMP demonstrou reduzir consistentemente a degradação de colágeno e o desgaste e promoveu prevenção duradoura contra erosão e erosão mais abrasão em dentina. / The dentin degradation by matrix metalloproteinases (MMPs) can increase the progression of erosive lesions. Objectives: Five studies were conducted to evaluate: 1) The activity of MMPs in bovine and human dentin; 2) The effect of green tea rinse against dentin erosion/abrasion; 3 and 4) Gels containing MMP inhibitors (epigallocatechin-3-galatte-EGCG, chlorexidine-CHX and ferrous sulphate-FeSO4) to prevent dentin erosion alone or associated with abrasion, respectively, and 5) On collagen degradation and wear. Material and Methods: 1) Protein extraction from crown and root of bovine and human dentin was performed (0.87 M citric acid, pH 2.3) and tested by zymography and gelatinolytic activities; 2) Volunteers (n=10) rinsed with green tea or water (1 min, 10 mL) between the erosive (Coke, pH 2.6, 4x5min/day, extraorally) and abrasive challenges. The abrasion (electric toothbrush + fluoride-free toothpaste) was performed immediately or 30 min after erosion for 30 s. Dentin wear was analyzed by profilometry (µm); 3 and 4) Volunteers (n=10-13) wore palatal devices containing 12 bovine dentin blocks randomly allocated to 6 groups, according to the type of gels applied or not (not treated-NT). The gels had identical composition, except for the presence of EGCG (400 µM), CHX (0.012%), FeSO4 (1 mM), fluoride (NaF-1.23%) or not (Placebo-P). Gels were applied or not on specimens once in a thin layer and removed after 1 min. Erosion (Coke, pH 2.6, 4x5 min/day, extraorally) was performed for 5 or 10 days, respectively. Each day, after first and last erosive challenges, blocks were (ERO) or not brushed (ERO+ABR) for 15 s (electric toothbrush + fluoride-free toothpaste slurry). Dentin wear was evaluated by profilometry (µm) after days 5 and 10. 5) Demineralization of dentin (n=45/group) was performed with 0.87 M citric acid, pH 2.3, for 36 h. In sequence, dentin was or not (NT) treated with the same gels described above. Specimens were stored in artificial saliva (5 days, 37ºC), containing EDTA-free protease inhibitors and collagenase (Clostridium histolyticum, 238 U/mL). Collagen degradation was analyzed by hydroxyproline content (µg/mL) and dentin wear was evaluated by profilometry (µm, n=12/group). Data were analyzed by ANOVA (p<0.05). Results: Bovine dentin showed to be a reliable substrate for studies involving the activity of MMPs. Green tea significantly reduced the dentin wear for all conditions. The mean wear and collagen degradation was significantly reduced for the experimental gels when compared to NaF and P gels or NT in all protocols tested. For ERO, wear did not significantly increase with time, while for ERO+ABR, significant increase along time was observed for NaF, P and NT. Association between ERO and ABR was only able to significantly increase the wear at 10 days for NaF and NT. Conclusion: The use of green tea rinse and a gel as a vehicle to deliver MMP inhibitors to dentin was shown to consistently reduce collagen degradation and provide long-lasting prevention against dentin erosion and erosion plus abrasion.

Na dentina, a matriz orgânica desmineralizada tem um papel protetor contra desafios erosivos subsequentes. Porém, essa camada pode ser degradada por proteases, como as metaloproteinases da matriz (MMPs) e cisteína catepsinas (CCs). Recentemente, o uso de inibidores de proteases da matriz surgiu como uma importante ferramenta preventiva contra a erosão dentinária. Entretanto, o(s) mecanismo(s) exato(s) pelo(s) qual(is) os inibidores de proteases podem prevenir a erosão dentinária, bem como os tipos de proteases mais envolvidas neste processo ainda não são completamente conhecidos. O projeto foi desenvolvido em 2 subprojetos, com os seguintes objetivos: A)Subprojeto 1:Avaliar o papel das proteases na progressão da erosão dentária; B)subprojeto 2: Testar o potencial inibitório do NaF em CCs dentinárias. Para cumprir esses objetivos, foram utilizadas dentina de terceiros molares humanos para a preparação dos espécimes. A)Subprojeto1:Blocos de dentina (4 X 4 x 2 mm) (n=119) foram obtidos de raízes. Os espécimes foram divididos em 7 grupos de acordo com o seu tratamento (E-64, inibidor especifico II de catepsinas B, clorexidina, galardina NaF, placebo) ou sem tratamento, géis foram aplicados uma única vez sobre a superfície e feito o desafio erosivo (90s, 4x por dia por 5 dias) e feita analise perfilométrica. Os espécimes foram incubadas em solução contendo colagenase de Clostridium histolyticum tipo VII por 96hrs e então feita uma segunda analise perfilometrica para se determinar a espessura da MOD. Dois espécimes foram separados para análise de microscopia eletrônica de varredura. B)Subprojeto 2: Palitos de dentina (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) foram cortados da porção médio coronária dos dentes e completamente desmineralizados por imersão em EDTA 0,5 M (pH7,4) por 30 dias e lavados em água deionizada sob constante agitação a 4ºC por 72 h. Os espécimes foram divididos em 6 grupos (E-64, NaF e controle negativo, pH 5,5 ou 7,2) e incubados em saliva artificial contendo seus respectivos inibidores por 24 h 7 dias e 21 dias; ao termino de cada período, os espécimes eram pesados para avaliar a perda de massa e analisada a presença de CTX. A)Subprojeto 1: a perda de tecido desmineralizado (m, média± SD) foi: CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. A perda de tecido mineralizado foi: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. Os inibidores de MMP reduziu significativamente a perda de matriz orgânica e tecido mineralizado em comparação com os outros grupos (p<0,05). Não foi achada diferença significante entre a espessura da matriz orgânica desmineralizada remanescente (p=0,845). B)Subprojeto 2: Na perda de massa houve diferença significante em relação ao inibidor (F=20,047, p<0,0001) e tempo de incubação (F=222,462, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, nos período de menor tempo de incubação, a perda foi similar para todos os grupos testados, no período de maior tempo de incubação, o grupo contendo NaF demostrou os melhores resultados. Na analise de CTX, houve diferença significante em relação aos inibidores (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) e tempo de incubação (F=161,438, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, como ocorrido na perda de massa, não houve diferença estatística nos períodos de menor incubação. No período de maior tempo de incubação, mais uma vez o grupo NaF mostrou os melhores resultados. No valor acumulado de CTX, os grupos E64 e controle negativo tiveram os maiores valores de CTX acumulado, o grupo NaF, independente do pH mostrou redução significante em relação aos demais grupos. Após analise dos resultados dos dois subprojetos, podemos indicar que as MMPs são as proteases de maior importância na progressão da erosão dentinária, assim, sua inibição é de maior importância para a redução desta patologia. Mesmo as CCs não exercendo papel direto para a progressão da erosão, elas são efetivas na cascata da ativação de outras proteases, como as próprias MMPs. Com isso, sua inibição também pode ser importante para a redução indireta da progressão da erosão. Neste presente estudo, pudemos comprovar que o NaF tem potencial inibitório sobre as CCs dentinárias, assim, sugerindo um novo inbidor de CCs. Com os resultados deste estudo, podemos afirmar que as MMPs são as principais proteases na progressão da erosão dentinária e que o NaF tem potencial inibitório nas CCs dentinárias. / In the dentine, the demineralized organic matrix has a protector part against the following erosive challenges. Nevertheless, this layer can be degraded by proteases, like the matrix metalloproteinases (MMPS) and cystein cathepsins (CCs). Recently, the use of proteases of the matrix´s inhibitors, emerged as an important preventive tool against the dentinária erosion. However, the exact mechanisms from which the inhibitors of the proteases may prevent the dentin erosion, as much as the kinds of proteases more involved in this process are not completely known yet. Therefore, the general objective of this project was to investigate the part of the two main proteases of the matrix (MMPs and CCs) in the dental erosion. The project was developed in 2 subprojects, with the following objectives: A)Subproject 1: Evaluate the part of the proteases in the progression of the dental erosion; B)subproject 2: To test the NaF inhibitory potencial in the dentin CCs. To accomplish these objectives, human third molar dentin were used for the preparation of the specimens, obtained in the surgery and urgency clinics of FOB-USP (subproject 1) or granted by the University of Oulu (subproject 2). A) Subproject 1: Dentine blocks 4 X 4 X 2 mm) (n=119) were obtained from the roots of the obtained teeth. The specimens were divided in 7 groups according with their treatment. Gels containing inhibitors (E-64, specific cathepsin B inhibitor II, chlorhexidine, galardin NaF, placebo), or without treatment, were produced, applied only one time over the surface and made the erosive challenge (90s, 4x a day for 5 days) and made profilometric analysis. The specimens were incubated in a solution containing collagenase of Clostridium histolyticum type VII for 96 hours and then a second profilometric analysis was made to determine the thickness of the MOD. Two specimens were separated for the electronic microscopy scan analysis. B) Subproject 2: Dentine sticks (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) were cut from the medium coronary portion of the teeth and completely demineralized by immersion in EDTA 0,5 M (pH7,4) ifor 30 days and washed in deionized water under constant agitation in 4º C for 72 hours. The specimens were divided in 6 groups (divided by inhibitors: E-64, NaF and negative control, pH 5,5 or 7,2) and incubated in artificial saliva containing their respective inhibitors for 24 hours, 7 days and 21 days; by the end of each period, the specimens were weighted to evaluate the loss of mass and analised the presence of CTX. A)Subproject 1: the loss of demineralized tissue (m, média± SD) was : CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. The loss of demineralized tissue was: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. The MMP inhibitors reduced significantly the loss of organic matrix and demineralized tissue in comparison with other groups (p<0,05). There was no significant difference found between the thickness of the remaining demineralized organic matrix.(p=0,845). B)Subproject: In the loss of mass, there was a significant difference in relation to the inhibitor (F=20,047, p<0,0001) and incubation time (F=222,462, p<0,0001) with significant interaction between these criteria, in the periods of lesser time of incubation, the loss was similar for all the tested groups, in the period of higher time of incubation, the group containing NaF demonstrated the best results. In the analysis of CTX, there was significant difference in relation the inhibitors (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) and time of incubation (F=161,438, p<0,0001)with significant interaction between these criteria, as occurred in the mass loss, there was no statistic difference in the period of lesser incubation. In the period of higher time of incubation, once again, the NaF group demonstrated the best results. The CTX accumulated value, the E64 groups and negative control had the greater accumulated values of CTX, the NaF group, regardlessof the pH, demonstrated significant reduction in relation to the other groups. After the analysisof the results of both subprojects, we can indicate that the MMPs are the proteases of greater importance in the progression of the dentin erosion, thus, its inhibition is of graeter importance for the reduction of this pathology. Even the CCs don´t playing the part directly for the progression of erosion, they are effective in the cascade of the activation of other proteases, like the MMPs themselves. In this manner, its inhibition can also be important for the indirect reduction of the progression of the erosion. In this present study, we can prove that the NaF has inhibiting potential over the dentin CCs, thus, suggesting a new inhibitor of CCs. With the results of this study, we can affirm that the MMPs are the main proteases in the progression of the dentin erosion and that the NaF has inhibiting potential in the dentin CCs.

Orientador: Pedro Duarte Novaes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T09:33:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Omar_NadiaFayez_M.pdf: 1647075 bytes, checksum: fea79bf37f4e22a4c5de5085d51981f1 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de endopeptidases capazes de degradar muitos dos componentes estruturais da matriz extracelular, entre eles o colágeno. A presença de MMPs no folículo dentário estaria relacionada com a remodelação que ocorre neste tecido durante o processo de erupção dentária. A matriz metaloproteinase de membrana tipo 1 (MT1-MMP ou MMP-14) tem sido considerada uma importante metaloproteinase de superfície celular envolvida no desenvolvimento do dente e suas raízes, na formação do osso alveolar e no processo de erupção dentária. Este estudo teve por objetivo verificar a distribuição de MT1-MMP, por meio da técnica de imunohistoquímica, no folículo dentário da região odontogênica de incisivos inferiores de ratos, em condições de erupção normal e alterada experimentalmente. Foram utilizados ratos Lewis machos adultos, divididos em 3 grupos: normofuncional - em condição de erupção normal; grupo hiper e hipofuncional - onde o incisivo inferior esquerdo foi seccionado a cada dois dias, mantendo o dente em desoclusão (hipofuncional), o incisivo contralateral direito permaneceu em oclusão e em sobrecarga, sendo considerado em hiperfunção; grupo contido - onde o incisivo inferior esquerdo recebeu uma contenção a fim de impedir o processo eruptivo. Após o período experimental de 14 dias, os animais foram anestesiados e sacrificados por perfusão intracardíaca, as hemimandíbulas foram removidas e fixadas, e os fragmentos correspondentes à região destinada ao estudo (região odontogênica) foram retirados. Após a descalcificação em EDTA 10%, os fragmentos foram incluídos em parafina. Os cortes obtidos foram submetidos à técnica de imunohistoquímica. A MT1-MMP foi localizada na região de folículo dentário em todos os grupos estudados. No grupo normofuncional a intensidade de marcação foi moderada, apresentando uma distribuição mais intensa nas células próximas ao osso alveolar. O grupo hiperfuncional apresentou intensidade de marcação e distribuição semelhante ao grupo normofuncional. O grupo hipofuncional apresentou intensidade de marcação forte com extensão para as células próximas à papila dentária. O grupo contido apresentou intensidade de marcação fraca com distribuição difusa por toda área do folículo dentário. Os resultados sugerem que a condição funcional de erupção alterada (hipo, hiperfuncional e contido) pode modificar a expressão da proteína MT1-MMP na região odontogênica de incisivos de ratos, demonstrando que esta molécula pode ter um importante papel no mecanismo de erupção dental / Abstract: Matrix metalloproteinases (MMPs) are a growing family of endopeptidases that are capable of degrading many structural components of the extracellular matrix, including collagen. MMPs on the dental follicle may be related with remodelation that occurs in this tissue during dental eruption. MT1-MMP has been considered an important membrane-type matrix metalloproteinase involved in tooth and root development, in alveolar bone formation, and in the dental eruption process. The aim of this investigation was to verify the distribution of MT1-MMP, using immunohistochemical technique, in the dental follicle of odontogenic region of lower incisors of rats, with normal and altered eruption conditions. Male adult Lewis rats were used. They were separated in 3 groups: Normalfunctional teeth group - teeth with normal eruption condition; hyper- and hypofunctional teeth group - the left lower incisors were cut at the level of the interdental papilla each two days, keeping the teeth out of occlusion (hypofunctional teeth) and the contralateral right incisors remained with overload (hyperfunctional teeth); Restrain teeth group, the left lower incisors received a restrain to impede the eruption process. After fourteen days the animals were anesthetized and sacrified by perfusion through the heart, the hemimandibles were removed and fixed, the fragments corresponding to the odontogenic region were removed. After descalcification in 10% EDTA they were embedded in paraffin. The sections were submitted to the immunohistochemical technique. MT1-MMP was distributed on the dental follicle area in all groups. In the normalfunctional teeth group the staining intensity was moderated, presenting a more concentrated distribution near the alveolar bone. The hyperfunctional teeth group showed staining intensity and distribution similar to the normalfunctional teeth group. The hypofunctional teeth group presented strong staining intensity with distribution extended to dental papilla. In the restrain teeth group the staining intensity was weak with diffuse distribution to all dental follicle area. The results suggest that the altered function condition eruption (hypo-, hyper-, and restrain tooth) may modify the MT1-MMP expression in rat incisor odontogenic region, demonstrating that this metalloproteinase may have an important role in the process of dental eruption / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

As metaloproteinases da matriz (MMPs) são enzimas proteolíticas dependentes de zinco que degradam componentes da matriz extracelular, facilitando a remodelação tecidual e a migração celular. MMPs secretadas por osteoclastos exercem papel central na absorção óssea fisiológica e estão também associadas a processos de degradação patológica do osso. No entanto, o papel essencialmente degradador de osso das MMPs, particularmente da MMP-2, vem sendo questionado em anos recentes por estudos que evidenciam sua importância na diferenciação de células da linhagem osteoblástica e na formação de tecido ósseo em cultura. Neste sentido, é possível que a MMP-2 exerça um papel importante na formação de tecido ósseo em processo de reparação. O objetivo do presente trabalho foi investigar a pretensa ação osteo-estimulatória da rhMMP-2 ligada à monoleína (usada como carreador) implantada em defeito confeccionado na calvária de ratos. Foram confeccionados defeitos ósseos unilaterais de 4 mm de diâmetro na calvária de ratos adultos; nos animais controles o defeito ósseo foi mantido com o preenchimento natural de coágulo sanguíneo e nos animais implantados o defeito foi preenchido com monoleína ou com rhMMP-2 ligada à monoleína. Os animais foram eutanasiados após 2 e 4 semanas e a taxa de neoformação óssea foi estimada em cortes histológicos por um método histométrico de contagem diferencial de pontos. A taxa de neoformação óssea foi semelhante nos animais dos grupos controle e monoleína e significativamente maior nos animais do grupo MMP-2, em ambos os períodos analisados. Os resultados permitem concluir que a monoleína não interferiu com o processo reparacional e pareceu eficaz como carreador da rhMMP-2, e adicionam evidências á hipótese da importância da atividade da MMP-2 para a formação óssea, em um modelo experimental in vivo de reparo ósseo. / Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-dependent proteolytic enzymes that degrade extracellular matrix components, facilitating cell migration and tissue remodeling. MMPs secreted by osteclasts are important in the physiological bone resorption as in pathological bone degradation. However, the essentially bone absorbing hole of MMPs, particularly of the MMP-2, has been questioned in recent years by studies that show its importance in osteoblastic cells differentiation and in vitro bone formation. Therefore, the MMP-2 may have also an important hole in reparational bone formation. The purpose of the present study was to investigate the pretense osteostimulatory effect of the rhMMP-2 linked to monoolein (used as a carrier) implanted into rat calvarial defects. Bone defects of 4mm in diameter were created unilaterally in rats calvaria and filled with natural blood clot (control), monoolein or rhMMP-2 linked to monoolein. The animals were killed 2 and 4 weeks postoperatively and the rate of new bone formation was estimated in histological sections by a histometric differential point-counting method. The rate of reparational bone formation was similar in the animals from control and monoolein groups and was significantly greater in the MMP-2 group, in both periods. From the results it may be concluded that monoolein did not interfere with the reparacional process and seemed effective as a rhMMP-2 carrier. In addition, the results add evidence to the importance of MMP-2 activity for bone formation, in an in vivo bone healing experimental model.

Orientador: Sergio Luis Felisbino / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T04:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JustulinJunior_LuisAntonio_D.pdf: 17091914 bytes, checksum: 15d52dabcde65a4f842895fd71f92ccd (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Finasterida (Fin), um inibidor da enzima 5a-redutase do tipo II e a Doxazosina (Dox), um inibidor do receptor a1-adrenérgico, tem sido amplamente utilizados no tratamento dos sintomas da Hiperplasia Prostática Benigna (HPB). Recentemente, dados clínicos demonstraram que a combinação destas drogas foi mais efetiva em prevenir o desenvolvimento de retenção urinária aguda. Além disso, tem sido demonstrado que tanto as drogas isoladas, como em associação também podem ser utilizadas na prevenção e tratamento do câncer de próstata, devido ao seu potencial de induzir apoptose em células epiteliais normais e tumorais. Apesar disso, pouco se conhece sobre os efeitos da Fin e da Dox administradas isoladas ou em associação sobre a morfofisiologia prostática, incluindo proliferação, morte celular, e indução de remodelação da matriz extracelular pelas metaloproteinases de matriz. Ratos wistar machos adultos (13 semanas) foram tratados com Dox (25mg/kg/dia) ou com a combinação de Fin+Dox (25mg/kg/dia). Após a eutanásia, os lobos prostáticos (ventral, dorsolateral e anterior) foram retirados, pesados e imersos em fixador para análises morfológicas ou congelados em nitrogênio líquido para posterior análises bioquímicas. Os resultados morfológicos e estereológicos demonstraram que o tratamento com a Dox isoladamente por 3 dias resultou em aumento do peso da próstata ventral, com acúmulo de secreção na luz glandular. Os pesos absoluto e relativo das próstatas dorsolateral e anterior não sofreram alteração neste período de tratamento. Entretanto, após 30 dias de tratamento, observou-se uma redução de aproximadamente 20% nos pesos absoluto e relativo de todos os lobos prostáticos e um aumento do volume glandular ocupado pelo colágeno no estroma nos três lobos prostáticos. O tratamento com doxazosina também reduziu o índice de proliferação celular e aumentou o índice apoptótico em todos os períodos analisados. A próstata ventral de ratos tratados com a combinação de Fin+Dox apresentou perda de peso após 30 dias de tratamento. Nos dois períodos de tratamento ocorreu diminuição do índice de proliferação celular, aumento de apoptose e do volume estromal de colágeno, mais evidentes quando comparados ao tratamento com as drogas isoladas. O tratamento combinado também provocou aumento da imunomarcação para o TGF-ß1 demonstrado por imunohistoquímica, principalmente no epitélio. A expressão dos RNAms para MMP-2, TIMPs-1 and - 2 dimunuiu após 30 dias de tratamento, enquanto o RNAm para a MMP-9 não foi detectado em nenhum grupo experimental. O tratamento com Fin+Dox por 30 dias promoveu uma diminuição na atividade gelatinolítica da MMP-2 e um aumento na atividade da MMP-9. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram que tanto o tratamento com doxazosina quanto o tratamento combinado de Fin+Dox induzem grandes alterações glandulares que levam a atrofia prostática, sendo ainda mais significativa com o tratamento combinado, possivelmente pela ação complementar destas duas drogas sobre o parênquima e o estroma glandulares. Nesta atrofia, a MMP-9 e o TGF-ß 1parecem desempenhar um papel importante. Desta forma, nossos resultados auxiliam o entendimento dos dados clínicos, demonstrando que a combinação dos dois fármacos pode ser mais eficaz no tratamento da HPB. / Abstract: Finasteride (Fin), an inhibitor of type II 5-a reductase, and Doxazosin (Dox), an a1- adrenergic blocker, have been widely used in treatment of Benign Prostate Hyperplasia (BPH) symptoms. Recently, clinical data have demonstrated that the combined therapy with Fin+Dox reduced the long-term risk of acute urinary retention and the need for invasive therapies than either drug alone. Moreover, both drugs, alone or in combination have been suggested to be effective in the treatment of prostate cancer by inducing apoptosis in normal and tumoral cells. However, little is known about the effects of these drugs administrated alone or their combination on prostate tissue morphohysiology, including prostate morphology, cell proliferation, apoptosis and matrix metalloproteinases activities. Male adult Wistar rats (13 weeks old) were treated with doxazosin (25mg/kg/day) or with finasteride (25mg/kg/day) or with the combination of both drugs. The ventral (VP), dorsolateral (DLP) and anterior prostate (AP) were excised and processed for histochemical, morphometric and biochemical analysis. The results of morphological and stereological analyses demonstrate that Dox treatment for 3 day resulted in an increased in ventral prostate absolute and relative weight with secretion accumulation. The weight of dorsolateral and anterior prostate did not change in this period of treatment. However, after 30 days, the prostate exhibited an absolute and relative weight reduction of about 20% and an increase in collagen volume fraction in the stromal space in the three prostatic lobes. Dox also reduced epithelial cell proliferation and increased apoptosis in the three prostatic lobes in all periods of tretament. Rat VP treated with Fin+Dox also presented a reduction in absolute and relative weight, decrease in epithelial cell proliferation, increase in apoptosis and collagen volume fraction in the stroma in all periods analyzed, more than Dox alone. Fin+Dox treatment also increased the TGF-ß 1 immunoreaction in the epithelium and in the stroma of VP. The mRNA for MMP-2, TIMPs-1 and - 2 expression after 30 days of treatment were decreased. The mRNA for MMP-9 was not detected in any groups analyzed. Fin+Dox treatment for 30 days promoted a decrease in gelatinolitic activity of MMP-2 and an increase in MMP-9. Take together, these results demonstrated that both Dox alone or in combination with Fin induced changes in glandular histoarchitecture, leading to a prostate atrophy, being the combined treatment more effective in inducing glandular atrophy, possibly to the complementary action of the Fin and Dox on prostate parenchyma and stroma, respectively. In this process, the MMP-9 and TGF-ß1 appear to participate effectively. Our results contribute to a better understanding of the clinical data, demonstrating that the combined treatment can be more effective in the BPH treatment. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Marcela Rocha de Oliveira Carrilho, Caio Cezar Randi Ferraz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-13T08:00:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_JulianaNascimento_D.pdf: 1975919 bytes, checksum: 2c0bf72bcc8b2c20101ceb2474690583 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Conceitos da odontologia restauradora adesiva vêm sendo empregados em endodontia na cimentação de pinos intrarradiculares e na obturação dos condutos. O primeiro estudo que compõe este trabalho teve como objetivo comparar a qualidade e durabilidade do selamento promovido por materiais obturadores endodônticos que se aderem à dentina (Epiphany/ Resilon) àquelas obtidas com materiais convencionais (AH Plus/ guta-percha) e verificar a influência da existência de uma barreira coronária neste selamento. Dentes humanos unirradiculares receberam tratamento endodôntico e obturação com uma das combinações de materiais em estudo (Epiphany/ Resilon ou AH Plus/ guta-percha). Os condutos obturados receberam selamento coronário com Coltosol, Clearfil SE Bond/ Filtek Z-250 ou foram deixados sem barreira coronária. A qualidade do selamento proporcionada por cada combinação de material foi avaliada por um método de transporte de fluidos em dois períodos: após a presa do cimento endodôntico (imediato) e depois de 180 dias de armazenamento. Espécimes obturados com Epiphany/Resilon apresentaram maior permeabilidade (selamento menos efetivo) independentemente do tipo de selamento coronário e do período de avaliação. Ambos materiais utilizados como barreira coronária (Coltosol ou Clearfil SE Bond/ Filtek Z-250) aumentaram significativamente o selamento dos espécimes. Após o armazenamento, observou-se redução nos níveis de permeabilidade dos espécimes obturados com AH Plus/guta-percha sem selamento coronário ou selados com Coltosol e dos espécimes obturados com Epiphany/Resilon que não receberam selamento coronário. Concluiu-se que a capacidade de selamento de materiais obturadores adesivos é inferior àquela dos materiais obturadores convencionais e que o armazenamento por 180 dias não interferiu negativamente nesse selamento. A presença de uma barreira coronária contribuiu para a efetividade do selamento radicular. O segundo estudo teve como objetivo investigar a expressão de enzimas metaloproteinases da matriz (MMPs) na dentina radicular uma vez que tais enzimas têm sido implicadas na perda da estabilidade da união dente-material restaurador. Fragmentos de dentina humana coronária e radicular foram triturados e transformados em pó e as proteínas dentinárias extraídas com o uso de hidrocloreto de guanidina e EDTA. A análise por zimografia revelou atividade gelatinolítica na dentina coronária e radicular correspondente à MMP-2 e MMP-9. A metaloproteinase 2 foi mais intensamente detectada na dentina radicular desmineralizada e a MMP-9 foi, em sua maioria, recuperada do compartimento mineralizado do tecido, antes do uso do EDTA. Através do ensaio de Western Blot detectou-se ainda MMP-8 em ambos os substratos. Concluiu-se que metaloproteinases são expressas em dentina radicular de maneira semelhante à dentina coronária. No terceiro estudo a mesma metodologia foi empregada para a detecção de metaloproteinases no substrato dentinário bovino, uma vez que este é frequentemente utilizado como um substituto à dentina humana em ensaios de resistência de união. As proteínas da dentina bovina coronária apresentaram atividade gelatinolítica em zimografia correspondente à MMP-2 e MMP-9, enquanto a dentina radicular apresentou atividade compatível com MMP-2 somente. Pode-se concluir que o substrato dentinário bovino expressa metaloproteinases com atividade gelatinolítica e que existem diferenças no perfil de expressão entre coroa e raiz. / Abstract: Restorative strategies involving dentin bonding have been increasingly applied to endodontics. The first study evaluated the immediate and long-term sealing ability of adhesive versus conventional endodontic filling materials and investigated the influence of a coronal seal on leakage rates. After chemo-mechanical preparation/irrigation, human roots were filled with either AH Plus/gutta-percha or Epiphany/Resilon. Coronal sealing was performed with Coltosol or Clearfil SE Bond/Filtek Z250, and some samples received no material. The quality of root canal sealing was assessed by a fluid transport method, performed after sealer setting and 180 days of storage. Specimens filled with Epiphany/Resilon exhibited higher leakage than specimens filled with AH Plus/gutta-percha regardless of experimental condition. Coronal sealing reduced leakage significantly, but no difference was detected between Coltosol and Clearfil/Filtek Z250. After storage, significant decrease in leakage was observed in roots filled with AH Plus/gutta-percha either without coronal sealing or sealed with Coltosol, as well as in roots filled with Epiphany/Resilon without coronal sealing. It was concluded that adhesive filling materials did not provide better sealing than the conventional materials and that this sealing was not disturbed by storage of root filled specimens The presence of a coronary seal contributed to reduce leakage. Matrix metalloproteinases (MMPs) found in coronary dentin may play a role in the loss of stability of bonded restorations. The second study aimed to investigate whether these enzymes can also be detected in root dentin. Crown and root sections of human teeth were pulverized into powder and dentin proteins were extracted by using guanidine-HCl and EDTA. Zymography revealed gelatinolytic activity in both crown and root dentin samples, with bands corresponding to MMP-2 and MMP-9. MMP-2 activity was more evident in demineralized root dentin whereas MMP-9 was mostly extracted from the mineralized compartment of dentin. Western Blot analysis was able to detect MMP-8 equally distributed in crown and root dentin. In conclusion, MMPs are expressed in radicular dentin similarly to crown dentin. Using the same methodology, the third study assessed whether metalloproteinases are expressed in bovine dentin since this substrate has been frequently used as a substitute to human dentin in bond strength evaluations. Protein extracts obtained from bovine crown dentin exhibited gelatinolytic activity in zymography corresponding to MMP-2 and MMP-9. A similar pattern could be observed in root dentin proteins regarding the expression of MMP-2 isoforms, but no gelatinolytic activity was observed in the molecular weight area corresponding to MMP-9. It could be concluded that bovine sound dentin can express MMPs with gelatinolytic activity, but differences may occur in the expression profile of crown and root dentin substrates. / Doutorado / Endodontia / Mestre em Clínica Odontológica

Orientador: Jose Mauro Granjeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T17:09:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_KatiuciaBatistadaSilva_D.pdf: 3483379 bytes, checksum: 7c286d954d5465463a66555914cbdafc (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi delinear o perfil de expressão temporal e espacial das MMP-2 e -9, TIMP-1 e -2 e RECK durante os eventos de formação de tecidos mineralizados (osso, esmalte e dentina) em camundongos em fase embrionária, recém nascidos e indivíduos adultos através de imunohistoquímica e hibridização in situ. Durante a amelogênese em incisivos de rato adulto, na fase de secreção, as MMPs e RECK foram imunocoradas na região infracelular dos ameloblastos de secreção e RECK foi ainda detectado difuso no citoplasma destas células. MMP-9 foi localizada nas células do retículo estrelado e RECK nas células do epitélio externo. Na fase de transição, detectados uma fraca imunomarcação ao nível da membrana dos ameloblastos de transição para as MMPs e RECK esteve difuso no citoplasma destas células. Na camada papilar, as MMPs e RECK foram imunomarcadas nos macrófagos ou células dendríticas. Do início ao final da fase de maturação, a expressão de RECK foi aumentando nos ameloblastos de maturação e nas células da camada papilar, enquanto que a expressão das MMPs foi diminuindo nestas células. AS TIMPs foram detectadas somente nos ameloblastos na fase de maturação. Nós observamos RECK e a MMP-9 no citoplasma do odontoblastos, provavelmente, no complexo de Golgi ou na rede do retículo endoplasmático rugoso. Durante a ossificação intramembranosa da mandíbula e maxila, os osteoblastos foram imunocorados pelas MMPs, TIMPs e RECK. Na degradação da cartilagem de Meckel, MMPs, TIMPs e RECK foram imunomarcadas nas células do pericôndrio, bem como o mRNA de RECK. Durante a odontogênese, RECK foi imunocorado nas células do epitélio oral migrando ao ecto-mesênquima, na fase de broto, no epitélio interno do órgão do esmalte, na fase de capuz e em odontoblastos e ameloblastos na fase final de campânula. Transcritos de RECK foram localizados em todo o germe dentário na fase de capuz, mais concentrado no nó-do-esmalte secundário, na fase de campânula inicial e nos odontoblastos e ameloblastos, na fase final de campânula. O osso alveolar foi marcado em todos os períodos. Durante a ossificação endocondral, os condrócitos foram imunopositivos para as MMPs, TIMPs e RECK, na fase de diferenciação dos condrócitos (E13). Na fase de molde cartilaginoso (E14) os condrócitos hipertróficos foram imunocorados para as MMPs e RECK. RECK e TIMPs foram também encontradas no pericôndrio. Na fase de invasão vascular e celular (E15), MMPs, TIMPs e RECK foram expressos por células que migram do colar ósseo para o centro da diáfise, bem como por osteoclastos/condroclastos próximos ao septo transverso. Os condrócitos hipertróficos continuam imunocorados. De E16 a PN1, as MMPs, TIMPs e RECK foram expressas por osteoblastos e condrócitos hipertróficos na placa de crescimento e pelas células do periósteo e pericôndrio. Os resultados obtidos apontam para a expressão diferenciada de MMPs, TIMPs e RECK nos diversos eventos estudados, sugerindo que a atividade biológica destas proteínas regula a degradação da matriz extracelular tanto durante o desenvolvimento dos tecidos como sua manutenção. Além disso, pela primeira vez, demonstra-se a expressão de RECK pelas células formadoras de tecido ósseo e dentário. / Abstract: Our objective was to analyse the spatial-temporal distribution of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 and RECK during development of mineralized tissue (bone, enamel, and dentine) in embryos, newborn, and adult mice by immunohistochemistry and in situ hybridization. During rat amelogenesis, at the secretion phase, MMPs and RECK were immunostained in the ameloblast infracelular region and RECK was also detected in the cytoplasm of these cells. MMP-9 was localized in the stellated cells and RECK in the outer enamel epithelium cells. At the transition phase, a weak immunostaining was observed at the ameloblast membranes for MMPs and RECK. RECK was also detected in the cytoplasm of these cells. At the papillary layer, MMPs and RECK have been observed in macrophages and/or dendritic cells. At early and late maturation phases, MMPs and Reck profiles were similar to the transition phase, but the immunostaining was less pronounced. TIMPs were identified exclusively in maturation ameloblasts throughout the maturation phase. We also observed that the cytoplasm of odontoblasts, probably at the Golgi apparatus and/or the RER network were immunostained for Reck and MMP-9. During mandible and maxillae intramembranous ossification, osteoblasts were immunostained for MMPs (early stage), TIMPs (late stage) and RECK. In Meckel cartilage degradation, MMPs, RECK and TIMPs mRNA and protein were found in perichondrial cells. During odontogenesis migrating epithelial cells in bud stage, enamel inner epithelial cells in cap stage, and ameloblasts and odontoblasts in bell stage were immunostained for RECK. Also, RECK mRNA was found difuse in all tooth germ in cap stage, mainly localized in primary enamel knout in early bell stage, and in ameloblasts and odontoblasts in late bell stage. The alveolar bone was immunolabelled in all periods. During endochondral ossification, chondrocytes were immunopositive for MMPs, RECK, and TIMPs during chondrocyte differentiation (E13). At the cartilaginous template (E14), the hypertrophic chondrocytes (HC) were immunostained for MMPs and RECK. RECK and TIMPs immunopositive cells were found in the perichondrium. At the vascular and cellular invasion (E15), MMPs, RECK and TIMPs were expressed by migrating cells from bone collar as well as by osteoclasts/chondroclasts close to the transverse septum. HC remained immunostained. From E16 to PN1, MMPs, TIMPs, and RECK were expressed by osteoblasts and HC in the growth plate and by cells in the perichondrium and periosteum. The results show the differential expression of MMPs, TIMPs, and RECK during the processess studied, sugesting that the biological activity these proteins regulates the MEC degradation and its maintenance in tissue development. Our results show for the first time that RECK is expressed by bone-forming and tooth-forming cells during mouse endochondral and intramembranous and in embryonic and adult odontogenesis, even if these cells are from different embryonic origins. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular