O objetivo deste trabalho foi modificar os procedimentos da maturação in vitro (MIV) para induzir a competência de oócitos bovinos com intensa atividade da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH), determinada pelo emprego do corante vital Azul de Cresil Brilhante (BCB). Foram realizados dois experimentos; no primeiro trabalho foi realizada a MIV de oócitos após a identificação da atividade da G6PDH, empregando-se a seguinte proporção: competentes (sem atividade enzimática)/não competentes - 10:01, respectivamente. Os resultados revelaram um efeito negativo dos oócitos não competentes sobre a capacidade dos competentes em realizarem a MIV, a FIV e a CIV. Os resultados sugerem que para aumentar a produção de embriões deve-se realizar a MIV de oócitos competentes e não competentes, separadamente. O objetivo do segundo experimento foi verificar se a prolongação do tempo de MIV (30h) afetaria as taxas de MIV, FIV e CIV obtidas a partir de oócitos não competentes. Os oócitos não competentes não foram afetados, positiva ou negativamente, pelo prolongamento do tempo de MIV, no entanto, os oócitos competentes sofreram decréscimo na capacidade de serem fecundados e desenvolverem-se até o estágio de blastocistos. Podemos concluir que as modificações realizadas no procedimento da MIV não foram capazes de induzir competência em oócitos com intensa atividade da enzima G6PDH. / The present work aimed modify the in vitro maturation (IVM) procedure to induce competence of bovine oocytes with high glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) activity. Two experiments were carried out; the first non-competent oocytes (with high enzymatic activity) were matured with competent oocyte (lower G6PDH activity) on proportion of 1:10, respectively. The second experiment aimed observe the effect of prolonged IVM (from 24 to 30h) on the cleavage and development rates in oocytes with higher enzymatic activity. Our data showed that oocytes with lower enzymatic activity did not induce competence of higher G6PDH activity oocyte. However, we observed a negatively effect on the cleavage and development rates on oocytes competent, then, to increase the number of embryos in vitro produced we need to mature oocytes competent and non-competent separately. In the second experiment, the non-competent gametes submitted to prolonged IVM were not affected, however, competent oocytes were negatively affect by prolonged IVM. We can concluded that the IVM modifications did not able to induce the competence in the oocytes with high G6PDH activity.

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.

O objetivo do trabalho foi relacionar a baixa produtividade com perdas corporais lactacionais, caracterizando o perfil das fêmeas propensas ao risco, estudar detalhadamente este grupo de fêmeas e avaliar possíveis alternativas para minimizar os efeitos do catabolismo. O primeiro experimento analisou fêmeas de diferentes ordens de parto (OP) e perda de peso na lactação. Houve efeito da interação entre ordem de parto e perda de peso na taxa de parto das fêmeas (P<0,05) em fêmeas OP1 e OP2. Não houve interação da classe de OP com classe de perda de peso (P>0,05) para IDE e total de leitões nascidos. Fêmeas OP1 apresentaram IDE mais longo e menor tamanho da leitegada no parto subsequente (P<0,05) em comparação às fêmeas OP2 e OP3-5. As perdas corporais na lactação não afetaram o IDE (P>0,05), mas reduziram o tamanho da leitegada do parto seguinte (P<0,05). Os resultados sugerem que as fêmeas mais jovens são mais sensíveis ao catabolismo, afetando o desempenho reprodutivo após o desmame. Além disso, perdas corporais lactacionais reduzem o tamanho da leitegada subsequente. O segundo experimento estudou o efeito do peso ao parto (PP) e consumo energético em relação à mantença (CEM) na lactação de fêmeas OP1 e OP2 no desempenho reprodutivo. O baixo CEM afetou as perdas corporais em ambas as OP (P<0,05). O peso ao parto não afetou o consumo alimentar em fêmeas OP1, mas influenciou a ingestão de OP2. A concentração sérica de NEFA foi influenciada pelo CEM em OP1 e OP2. Alto CEM de OP1 implicou em aumento de ureia. Em OP1, o tamanho da leitegada não foi afetado pelo PP ou CEM, mas foi reduzida em OP2 com baixo PP ou CEM. O terceiro trabalho investigou o efeito de atrasar o primeiro serviço de OP1 após o desmame com tratamento com altrenogest (ALT) ou cobertura do segundo estro após o desmame (SKIP), comparado à inseminação no primeiro estro (CON). A restrição alimentar de 60% na última semana de lactação induziu uma perda média de peso corporal de 17kg. Quanto maior foi o intervalo desmame-serviço, maior foi a recuperação do peso à inseminação. O grupo ALT foi mais síncrono na entrada ao estro após a retirada do produto. A taxa de prenhez foi maior no SKIP e CON. ALT teve maior peso de corpora lutea e níveis de progesterona até 120h pós-ovulação. Não foi observada diferenças na taxa de ovulação, embriões viáveis, sobrevivência embrionária, tamanho dos embriões ou volume de fluido placentário. Dependendo do sistema de produção, estas estratégias podem trazer benefícios econômicos, quando aplicadas com critério em fêmeas com maior risco à baixa produtividade, uma vez que custo deve ser considerado. / The aim of this work was to relate low productivity to lactational weight loss, identifying the profile of females with more risk, study in details this cohort of sows and evaluate possible alternatives to minimize the effects of catabolism. The first trial evaluated females of different parity order (PO) and weight loss during lactation. There was interaction effect between parity order and weight loss on farrow rate (P<0.05) in PO1 and PO2 females. There was no interaction between PO and weight loss class (P>0.05) on WEI and subsequent total born. PO1 females presented longer WEI and lower litter size on subsequent farrowing compared to PO2 and PO3-5 females. Weight loss did not affect WEI (P>0.05), but it was related to a decrease of litter size in the subsequent farrowing (P<0.05). Results suggest young females are more sensitive to catabolism, affecting reproductive performance post weaning. The second experiment studied the effect of body weight at farrowing (BWF) and energy intake related to maintenance (MEIM) during lactation on subsequent reproductive performance of PO1 and PO2 sows. Low MEIM affected body weight loss in both PO (P<0.05). BWF did not affect energy intake in PO1 sows but influenced the consumption in PO2 sows. Serum NEFA concentration was influenced by MEIM in PO1 and PO2 sows. High MEIM PO1 sows showed higher urea concentration. In PO1, litter size was not affected by BWF or MEIM but was reduced in PO2 with Low BWF or MEIM. Third trial investigated the effect of delayed breeding in weaned PO1 sows with altrenogest treatment (ALT) or breeding at second estrus after weaning (SKIP), compared to breeding at first estrus after weaning (CON). Feed restriction at 60% during last week of lactation induced 17kg of body weight loss. The longer weaning to service interval resulted in greater recover of body weight at breeding. ALT group was more synchronized in estrus after altrenogest withdrawal. Pregnancy rate was greater in SKIP and CON. ALT had higher corpora lutea weight and progesterone levels at 120h post-ovulation. No differences in ovulation rate, live embryos, embryo survival, embryo size, or placental fluid volume were detected. Depending on the production system, these strategies may offer economic benefits, when carefully applied in a cohort of females with more risk to low productivity, since costs must be considered.

Dentre os principais desafios que persistem no campo da biologia da reprodução está a compreensão da natureza dos processos celulares e moleculares que determinam a qualidade dos oócitos. Um dos fenômenos a serem melhor compreendidos é a aquisição da competência do oócito, e qual o papel desempenhado pelo ambiente folicular que circunda o gameta no seu potencial de desenvolvimento. As células foliculares, especialmente as células do cumulus, certamente desempenham um papel fundamental na aquisição da competência de oócitos in vivo. Durante a maturação in vitro (MIV) do oócito observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária, e também pode estar relacionada à composição do meio de MIV. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar a expressão dos transcritos dos genes que codificam para as proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e b-actina (ACTB) em complexos cumuli-oócitos (CCOs) bovinos não maturados, e submetidos à maturação in vitro em meios com diferentes suplementações protéicas; e 2) avaliar as taxas de maturação nuclear dos oócitos submetidos às diferentes condições de MIV. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em três grupos experimentais: G1: CCOs não maturados; G2: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com soro fetal bovino (SFB); G3: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com albumina sérica bovina (BSA). A MIV foi realizada em a 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Para a extração do RNA total das amostras de CCOs foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi submetido à captação específica do mRNA através de separação magnética (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos transcritos. Parte dos oócitos dos grupos G2 e G3 foi desnudada das células do cumulus, e submetida à coloração com Hoechst 33342, para avaliação da maturação nuclear. A análise dos resultados de abundância relativa dos mRNAs de interesse mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de HAS2 (p=0,000), link protein 1 (p=0,001), conexina 43 (p=0,007) e b-actina (p=0,011), sendo maior nos grupos de CCOs submetidos à MIV em meio suplementado com SFB. A avaliação da morfologia nuclear não mostrou diferenças significativas entre as taxas de maturação nos grupos G2 e G3. Pode-se concluir que a exposição de CCOs bovinos à diferentes condições de MIV influenciou a expressão dos transcritos de HAS2, link protein 1, conexina 43 e b-actina. Entretanto, a MIV em presença de SFB ou BSA não mostrou diferença nas taxas de retomada da meiose e de maturação nuclear. / Understanding the cellular and molecular processes that determine the oocytes quality is one of the main challenges that persist in biology of reproduction. The acquisition of oocyte competence, and the role played by the follicular environment surrounding the gamete in its development potential are phenomena to be better understood. Follicular cells, especially the cumulus cells, certainly play a role in the oocyte competence acquisition in vivo. During in vitro maturation (IVM) of oocytes was observed expansion and mucification of granulosa cells forming the cumulus-oocyte complex (COC), due to the intense synthesis of extracellular matrix components. These changes in the appearance of cumulus are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization to occur. The expression of proteins associated with the extracellular matrix of cumulus cells may be under the influence of oocyte origin, and may also be related to the composition of the IVM medium. The aim of this work were 1) to evaluate the expression of gene transcripts coding for proteins hyaluronic acid synthase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and actin-b (ACTB) in bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) not matured or submitted to IVM in media with different proteic supplements, and 2) assess the rates of nuclear maturation of oocytes subjected to different conditions of IVM. The COCs were obtained from ovaries collected from cows immediately after slaughter, morphologically selected and divided into three groups: G1: not matured COCs; G2: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with fetal calf serum (FCS); and G3: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with bovine serum albumin (BSA). IVM was performed at 39°C in 5% CO2 and maximum relative humidity for 22 to 24 hours. For extraction of total RNA of COCs samples, TRIzol® reagent was used. Total RNA was subjected to capture of specific mRNA by magnetic separation (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). The mRNAs were reverse-transcribed into cDNA using the RT-PCR to evaluate the expression patterns of transcripts. Some of the oocytes from G2 and G3 was stripped of cumulus cells, and subjected to staining with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The analysis of relative abundance of interest mRNAs showed a significant difference between the different groups tested for transcripts of HAS2 (p = 0.000), link protein 1 (p = 0.001), connexin 43 (p = 0.007) and actin-b (p = 0.011), being higher in the groups of COCs submitted to IVM in medium supplemented with FCS. The evaluation of nuclear morphology showed no significant differences between maturation rates of G2 and G3. In conclusion, the IVM in media supplemented with FCS or BSA showed differeces in HAS2, link protein 1, connexin 43 and actin-b transcripts expression of bovine COCs. However, the nuclear maturation rates of oocytes subjected to IVM in media with different proteic supplements was not affected.

O objetivo do trabalho foi relacionar a baixa produtividade com perdas corporais lactacionais, caracterizando o perfil das fêmeas propensas ao risco, estudar detalhadamente este grupo de fêmeas e avaliar possíveis alternativas para minimizar os efeitos do catabolismo. O primeiro experimento analisou fêmeas de diferentes ordens de parto (OP) e perda de peso na lactação. Houve efeito da interação entre ordem de parto e perda de peso na taxa de parto das fêmeas (P<0,05) em fêmeas OP1 e OP2. Não houve interação da classe de OP com classe de perda de peso (P>0,05) para IDE e total de leitões nascidos. Fêmeas OP1 apresentaram IDE mais longo e menor tamanho da leitegada no parto subsequente (P<0,05) em comparação às fêmeas OP2 e OP3-5. As perdas corporais na lactação não afetaram o IDE (P>0,05), mas reduziram o tamanho da leitegada do parto seguinte (P<0,05). Os resultados sugerem que as fêmeas mais jovens são mais sensíveis ao catabolismo, afetando o desempenho reprodutivo após o desmame. Além disso, perdas corporais lactacionais reduzem o tamanho da leitegada subsequente. O segundo experimento estudou o efeito do peso ao parto (PP) e consumo energético em relação à mantença (CEM) na lactação de fêmeas OP1 e OP2 no desempenho reprodutivo. O baixo CEM afetou as perdas corporais em ambas as OP (P<0,05). O peso ao parto não afetou o consumo alimentar em fêmeas OP1, mas influenciou a ingestão de OP2. A concentração sérica de NEFA foi influenciada pelo CEM em OP1 e OP2. Alto CEM de OP1 implicou em aumento de ureia. Em OP1, o tamanho da leitegada não foi afetado pelo PP ou CEM, mas foi reduzida em OP2 com baixo PP ou CEM. O terceiro trabalho investigou o efeito de atrasar o primeiro serviço de OP1 após o desmame com tratamento com altrenogest (ALT) ou cobertura do segundo estro após o desmame (SKIP), comparado à inseminação no primeiro estro (CON). A restrição alimentar de 60% na última semana de lactação induziu uma perda média de peso corporal de 17kg. Quanto maior foi o intervalo desmame-serviço, maior foi a recuperação do peso à inseminação. O grupo ALT foi mais síncrono na entrada ao estro após a retirada do produto. A taxa de prenhez foi maior no SKIP e CON. ALT teve maior peso de corpora lutea e níveis de progesterona até 120h pós-ovulação. Não foi observada diferenças na taxa de ovulação, embriões viáveis, sobrevivência embrionária, tamanho dos embriões ou volume de fluido placentário. Dependendo do sistema de produção, estas estratégias podem trazer benefícios econômicos, quando aplicadas com critério em fêmeas com maior risco à baixa produtividade, uma vez que custo deve ser considerado. / The aim of this work was to relate low productivity to lactational weight loss, identifying the profile of females with more risk, study in details this cohort of sows and evaluate possible alternatives to minimize the effects of catabolism. The first trial evaluated females of different parity order (PO) and weight loss during lactation. There was interaction effect between parity order and weight loss on farrow rate (P<0.05) in PO1 and PO2 females. There was no interaction between PO and weight loss class (P>0.05) on WEI and subsequent total born. PO1 females presented longer WEI and lower litter size on subsequent farrowing compared to PO2 and PO3-5 females. Weight loss did not affect WEI (P>0.05), but it was related to a decrease of litter size in the subsequent farrowing (P<0.05). Results suggest young females are more sensitive to catabolism, affecting reproductive performance post weaning. The second experiment studied the effect of body weight at farrowing (BWF) and energy intake related to maintenance (MEIM) during lactation on subsequent reproductive performance of PO1 and PO2 sows. Low MEIM affected body weight loss in both PO (P<0.05). BWF did not affect energy intake in PO1 sows but influenced the consumption in PO2 sows. Serum NEFA concentration was influenced by MEIM in PO1 and PO2 sows. High MEIM PO1 sows showed higher urea concentration. In PO1, litter size was not affected by BWF or MEIM but was reduced in PO2 with Low BWF or MEIM. Third trial investigated the effect of delayed breeding in weaned PO1 sows with altrenogest treatment (ALT) or breeding at second estrus after weaning (SKIP), compared to breeding at first estrus after weaning (CON). Feed restriction at 60% during last week of lactation induced 17kg of body weight loss. The longer weaning to service interval resulted in greater recover of body weight at breeding. ALT group was more synchronized in estrus after altrenogest withdrawal. Pregnancy rate was greater in SKIP and CON. ALT had higher corpora lutea weight and progesterone levels at 120h post-ovulation. No differences in ovulation rate, live embryos, embryo survival, embryo size, or placental fluid volume were detected. Depending on the production system, these strategies may offer economic benefits, when carefully applied in a cohort of females with more risk to low productivity, since costs must be considered.

Dentre os principais desafios que persistem no campo da biologia da reprodução está a compreensão da natureza dos processos celulares e moleculares que determinam a qualidade dos oócitos. Um dos fenômenos a serem melhor compreendidos é a aquisição da competência do oócito, e qual o papel desempenhado pelo ambiente folicular que circunda o gameta no seu potencial de desenvolvimento. As células foliculares, especialmente as células do cumulus, certamente desempenham um papel fundamental na aquisição da competência de oócitos in vivo. Durante a maturação in vitro (MIV) do oócito observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária, e também pode estar relacionada à composição do meio de MIV. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar a expressão dos transcritos dos genes que codificam para as proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e b-actina (ACTB) em complexos cumuli-oócitos (CCOs) bovinos não maturados, e submetidos à maturação in vitro em meios com diferentes suplementações protéicas; e 2) avaliar as taxas de maturação nuclear dos oócitos submetidos às diferentes condições de MIV. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em três grupos experimentais: G1: CCOs não maturados; G2: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com soro fetal bovino (SFB); G3: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com albumina sérica bovina (BSA). A MIV foi realizada em a 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Para a extração do RNA total das amostras de CCOs foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi submetido à captação específica do mRNA através de separação magnética (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos transcritos. Parte dos oócitos dos grupos G2 e G3 foi desnudada das células do cumulus, e submetida à coloração com Hoechst 33342, para avaliação da maturação nuclear. A análise dos resultados de abundância relativa dos mRNAs de interesse mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de HAS2 (p=0,000), link protein 1 (p=0,001), conexina 43 (p=0,007) e b-actina (p=0,011), sendo maior nos grupos de CCOs submetidos à MIV em meio suplementado com SFB. A avaliação da morfologia nuclear não mostrou diferenças significativas entre as taxas de maturação nos grupos G2 e G3. Pode-se concluir que a exposição de CCOs bovinos à diferentes condições de MIV influenciou a expressão dos transcritos de HAS2, link protein 1, conexina 43 e b-actina. Entretanto, a MIV em presença de SFB ou BSA não mostrou diferença nas taxas de retomada da meiose e de maturação nuclear. / Understanding the cellular and molecular processes that determine the oocytes quality is one of the main challenges that persist in biology of reproduction. The acquisition of oocyte competence, and the role played by the follicular environment surrounding the gamete in its development potential are phenomena to be better understood. Follicular cells, especially the cumulus cells, certainly play a role in the oocyte competence acquisition in vivo. During in vitro maturation (IVM) of oocytes was observed expansion and mucification of granulosa cells forming the cumulus-oocyte complex (COC), due to the intense synthesis of extracellular matrix components. These changes in the appearance of cumulus are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization to occur. The expression of proteins associated with the extracellular matrix of cumulus cells may be under the influence of oocyte origin, and may also be related to the composition of the IVM medium. The aim of this work were 1) to evaluate the expression of gene transcripts coding for proteins hyaluronic acid synthase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and actin-b (ACTB) in bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) not matured or submitted to IVM in media with different proteic supplements, and 2) assess the rates of nuclear maturation of oocytes subjected to different conditions of IVM. The COCs were obtained from ovaries collected from cows immediately after slaughter, morphologically selected and divided into three groups: G1: not matured COCs; G2: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with fetal calf serum (FCS); and G3: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with bovine serum albumin (BSA). IVM was performed at 39°C in 5% CO2 and maximum relative humidity for 22 to 24 hours. For extraction of total RNA of COCs samples, TRIzol® reagent was used. Total RNA was subjected to capture of specific mRNA by magnetic separation (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). The mRNAs were reverse-transcribed into cDNA using the RT-PCR to evaluate the expression patterns of transcripts. Some of the oocytes from G2 and G3 was stripped of cumulus cells, and subjected to staining with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The analysis of relative abundance of interest mRNAs showed a significant difference between the different groups tested for transcripts of HAS2 (p = 0.000), link protein 1 (p = 0.001), connexin 43 (p = 0.007) and actin-b (p = 0.011), being higher in the groups of COCs submitted to IVM in medium supplemented with FCS. The evaluation of nuclear morphology showed no significant differences between maturation rates of G2 and G3. In conclusion, the IVM in media supplemented with FCS or BSA showed differeces in HAS2, link protein 1, connexin 43 and actin-b transcripts expression of bovine COCs. However, the nuclear maturation rates of oocytes subjected to IVM in media with different proteic supplements was not affected.

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.

O objetivo deste trabalho foi modificar os procedimentos da maturação in vitro (MIV) para induzir a competência de oócitos bovinos com intensa atividade da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH), determinada pelo emprego do corante vital Azul de Cresil Brilhante (BCB). Foram realizados dois experimentos; no primeiro trabalho foi realizada a MIV de oócitos após a identificação da atividade da G6PDH, empregando-se a seguinte proporção: competentes (sem atividade enzimática)/não competentes - 10:01, respectivamente. Os resultados revelaram um efeito negativo dos oócitos não competentes sobre a capacidade dos competentes em realizarem a MIV, a FIV e a CIV. Os resultados sugerem que para aumentar a produção de embriões deve-se realizar a MIV de oócitos competentes e não competentes, separadamente. O objetivo do segundo experimento foi verificar se a prolongação do tempo de MIV (30h) afetaria as taxas de MIV, FIV e CIV obtidas a partir de oócitos não competentes. Os oócitos não competentes não foram afetados, positiva ou negativamente, pelo prolongamento do tempo de MIV, no entanto, os oócitos competentes sofreram decréscimo na capacidade de serem fecundados e desenvolverem-se até o estágio de blastocistos. Podemos concluir que as modificações realizadas no procedimento da MIV não foram capazes de induzir competência em oócitos com intensa atividade da enzima G6PDH. / The present work aimed modify the in vitro maturation (IVM) procedure to induce competence of bovine oocytes with high glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) activity. Two experiments were carried out; the first non-competent oocytes (with high enzymatic activity) were matured with competent oocyte (lower G6PDH activity) on proportion of 1:10, respectively. The second experiment aimed observe the effect of prolonged IVM (from 24 to 30h) on the cleavage and development rates in oocytes with higher enzymatic activity. Our data showed that oocytes with lower enzymatic activity did not induce competence of higher G6PDH activity oocyte. However, we observed a negatively effect on the cleavage and development rates on oocytes competent, then, to increase the number of embryos in vitro produced we need to mature oocytes competent and non-competent separately. In the second experiment, the non-competent gametes submitted to prolonged IVM were not affected, however, competent oocytes were negatively affect by prolonged IVM. We can concluded that the IVM modifications did not able to induce the competence in the oocytes with high G6PDH activity.

Este trabalho teve objetivou-se avaliar o efeito da melatonina adicionada ao meio de maturação (meio B199) sobre a maturação nuclear, a distribuição dos grânulos corticais e dos microtúbulos, a produção in vitro de embriões e sobre a apoptose das células do cumulus (CC) e dos embriões. Os complexos cumulus-ovócitos (COCs), aspirados de folículos ovarianos obtidos de ovários de vacas oriundas de abatedouros, foram cultivados por 24 h, conforme os tratamentos: 1) Grupo Controle: meio B199 acrescidos de 0,5 µg/mL de FSH e 5,0 µg/mL de LH; 2) Grupo MEL: meio B199 com 1 µg/mL de melatonina; 3) Grupo MEL/FSH/LH: meio B199 com 1 µg/mL de melatonina e 0,5 µg/mL de FSH e 5,0 µg/mL de LH. Após a maturação in vitro (MIV), os COCs de todos os grupos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV) e desenvolvimento embrionário in vitro. A condição de cultivo em todas as etapas foi microgotas, sob óleo de silicone, com atmosfera de 5% de CO2 em ar, a 38,5ºC. Foram avaliadas as taxas de clivagem e de embriões produzidos no dia 7 (D-7) pós-inseminação in vitro. Após a MIV, os ovócitos de todos os grupos também foram corados com Hoechst 33342, com anticorpo monoclonal anti-tubulina conjugada com FITC ou cultivados com aglutinina Lens Culinaris conjugada a FITC para avaliação da taxa de maturação nuclear (progressão da meiose), distribuição dos microtúbulos e dos grânulos corticais, respectivamente. Para avaliação do grau de apoptose das CC e dos embriões, utilizou-se a técnica do cometa. Não houve diferença (P > 0,05) entre o grupo controle e os tratados com melatonina (MEL e MEL/FSH/LH) na taxa de ovócitos em metáfase II (66,18±4,04; 66,46±4,04 e 59,61±4,04), no percentual de blastocistos com baixo grau de apoptose (31,46±6,01; 38,36±6,01 e 32,92±6,01), na taxa de clivagem (85,70±2,47; 88,52±2,47 e 85,65±2,47) e nem na taxa de embriões no D-7 (54,47±3,67; 60,01±3,67 e 58,40±3,67). A distribuição dos microtúbulos e dos grânulos corticais também não foi alterada pelos grupos tratados com melatonina. O percentual de CC que não apresentaram dano no DNA no grupo MEL (37,64±2,41) foi superior (P<0,01) ao grupo MEL/FSH/LH (28,08±2,41) e ao grupo controle (17,83±2,41). Os resultados sugerem que a adição de melatonina durante o cultivo in vitro para maturação de ovócitos bovinos protegeu as CCs de danos no DNA promovendo a diminuição da incidência de apoptose e foi capaz de suportar o desenvolvimento embrionário produzindo taxas de embriões no D-7 similares as obtidas no sistema tradicional de produção in vitro de embriões. / The aim of this study was to examine the effect of addition of melatonin in maturation medium (B199) on the nuclear maturation, the cortical granules and microtubules distribution, the in vitro production of embryos and the DNA damage (apoptosis) of cumulus cells and embryos. The bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) aspirated from follicles from abattoir ovaries were cultured for 24 h according to treatments: 1) Control group: B199 medium with 0.5 µg/ml FSH and 5.0 µg/ml LH; 2) MEL group: B199 medium with 1 µg/ml melatonin; 3) MEL/FSH/LH group: B199 medium with 1 µg/ml melatonin, 0.5 µg/ml FSH and 5.0 µg/ml LH. After in vitro maturation (IVM) the COCs of all groups were submitted to in vitro fertilization and in vitro embryo development. All cultures were in droplets under oil, at 38.5ºC in na atmosphere of 5% CO2 in air. The cleavage rate and the percentage of embryos produced on Day 7 (D-7) after in vitro insemination were evaluated. After IVM, the oocytes of all groups were stained with Hoechst 33342, or stained with FITCconjugated anti-?-tubulin antibody or cultured with FITC-conjugated Lens Culinaris agglutinin to evaluate the nuclear maturation rate, microtubules and cortical granules distribution, respectively. The incidence of apoptosis of the CC and embryos was also measured by Comet assay. There was no difference (P > 0.05) among groups on metaphase II oocyte rates (Control = 68.18±4.04; MEL = 66.46±4.04; MEL/FSH/LH = 59.61±4.04), on the percentage of blastocysts with low incidence of apoptosis (Control = 31,46±6,01; MEL = 38,36±6,01; MEL/FSH/LH = 2,92±6,01), on cleavage rate (Control = 85.70±2.47; MEL = 88.52±2.47; MEL/FSH/LH = 85.65±2.47) and on D-7 embryo rate (Control = 54.47± 3.67; MEL = 60.01±3.67; MEL/FSH/LH = 58.40±3.67). The distribution of microtubules and cortical granules was not affected by the groups treated with melatonin. The percentage of cumulus cells with no DNA damage in MEL group (37.64±2.41) was significantly superior to MEL/FSH/LH (28.08±2.41) and control groups (17.83±2.41). The results suggest that the addition of melatonin to the IVM medium protected the cumulus cells from DNA damage by diminishing the incidence of apoptosis and also supported the embryo development by producing D-7 embryo rates similar to those obtained in traditional system of bovine embryo in vitro production.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico encontrado em diversos tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos. A síntese do NO é realizada pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Um dos mecanismos de ação do NO é dado pela ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), resultando na produção de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), um mensageiro secundário nessa via de sinalização celular. O GMPc por sua vez é capaz de modular a atividade de algumas fosfodiesterases (PDEs), enzimas responsáveis pela degradação do GMPc e de outro nucleotídeo cíclico, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da elevação dos níveis de NO por meio do doador de óxido nítrico (SNAP) e o uso de inibidores de diferentes isoformas de fosfodiesterases no meio de cultivo durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos sobre a retomada da meiose, concentração de NO e níveis de GMPc e AMPc. Deste modo, os complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram cultivados por até 9 horas com o doador de NO (SNAP - 10-7 M) associado ou não ao inibidor de GCs (ODQ - 10-5 M) e associado ou não aos inibidores das fosfodiesterases, PDE5 (Sildenafil - 10&micro;M), PDE3 (Cilostamide - 20&micro;M) e PDE8 (Dipiridamole - 50&micro;M). As amostras foram avaliadas quanto a taxa de retomada da meiose, níveis de NO (9h de MIV) e níveis dos nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc (0, 1, 2 e 3h de MIV). O SNAP retardou o rompimento da vesícula germinativa com 9horas de cultivo (P&lt;0,05) e quando o SNAP foi associado ao ODQ o efeito foi revertido (P&gt;0,05). A inclusão de SNAP no cultivo, os níveis de NO foram elevados (P&lt;0,05). Os níveis de GMPc só foram influenciados positivamente pelo SNAP com 1 hora de cultivo (P&lt;0,05) e após 2 e 3 horas, esta influência não persistiu (P&gt;0,05), visto que o ODQ aboliu o efeito. A influência do SNAP foi devido ao estímulo da GCs. Para os níveis de AMPc, o doador de NO não foi capaz de influenciar suas concentrações durante as 3 horas de cultivo (P&gt;0,05). Quando o SNAP foi associado ao Sildenafil (SNAP+SIL) não houve diferença em relação ao grupo imaturo (P&gt;0,05), porém, também não se diferiu do tratamento SNAP e controle (P&gt;0,05). Para as taxas de retomada de meiose todos os tratamentos foram eficientes e conseguiram retardar a quebra da vesícula germinativa diante do grupo controle (P&lt;0,05), sendo o grupo SNAP+CIL mais eficiente. Para os níveis de AMPc, nem mesmo com a utilização de inibidores das PDE3 e PDE8 foi possível atenuar a queda do nucleotídeo. Em conclusão, o SNAP exerceu influência na retomada da meiose, na concentração de NO e nos níveis de GMPc sendo que sua ação se deve à atividade da GCs. Não houve influência sobre os níveis de AMPc, quando o SNAP foi associado a inibidores específicos de fosfodiesterases, mesmo quando apresentaram efeito sobre a retomada da meiose. A via NO/GCs/GMPc não parecer atuar sobre a via PDE3/AMPc, sugerindo a ação de outras vias no controle da meiose. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger found in many cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages. The synthesis of NO is made by the action of nitric oxide synthase (NOS). One of the mechanisms of action of NO is given by the activation of the enzyme soluble guanylate cyclase (sGC), resulting in the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), a secondary messenger in this pathway of cell signaling. The cGMP in turn is capable of modulating the activity of some phosphodiesterases (PDEs), enzymes responsible for degradation of cGMP and other cyclic nucleotide, cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The objective of this study was to investigate the effects of elevated levels of NO via nitric oxide donor (SNAP) and the use of inhibitors of phosphodiesterase isoforms in the culture medium during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP and cAMP levels. Thus, the complexes cumulus-oocyte (COCs) were cultured for cattle up to 9 hours with the NO donor (SNAP - 10-7 M) with or without the inhibitor of sGC (ODQ - 10-5 M) and with or without to inhibitors of phosphodiesterase PDE5 (Sildenafil - 10&micro;M), PDE3 (Cilostamide - 20&micro;M) and PDE8 (Dipyridamole - 50&micro;M). The samples were evaluated for the rate of resumption of meiosis, levels of NO (9h - IVM) and levels of cyclic nucleotides cGMP and cAMP (0, 1, 2 and 3h - IVM). The SNAP delayed with germinal vesicle breakdown of 9hours cultivation (P &lt; 0.05) when SNAP was associated with ODQ was reversed the effect (P&gt; 0.05). The inclusion of SNAP cultivation, NO levels were increased (P&lt;0.05). cGMP levels were positively influenced only by the snap 1 hour in culture (P&lt;0.05) and after 2 and 3 hours, this effect was not maintained (P&lt;0.05), whereas ODQ abolished the effect. The influence of SNAP was due to stimulation of GCs. For cAMP levels, the NO donor was not able to influence their concentrations during the 3 h incubation (P&gt;0.05). When SNAP was associated with Sildenafil (SIL+SNAP) there was no difference compared to the immature group (P&gt;0.05), however, also did not differ from SNAP treatment and control (P&gt;0.05). Rates for resumption of meiosis all treatments were efficient and able delay before germinal vesicle breakdown in the control group (P&lt;0.05), with SNAP+CIL group more efficient. For cAMP levels, even with the use of inhibitors of PDE3 and PDE8 was possible to alleviate the decrease of the nucleotide. In conclusion, SNAP exerted influence on the resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP levels and that its action is due to a GCs activity. There was no effect on cAMP levels, when SNAP was associated with specific phosphodiesterase inhibitors, even when presented effect on the resumption of meiosis. The pathway NO/sGC/cGMP seem not act on the pathway PDE3/AMPc, suggesting the action of other pathways in the control of meiosis.