Tesi realitzada al Servei d'Hematologia / Hospital Clínic / La leucemia linfática crónica (LLC) es la leucemia más frecuente en la edad adulta en los países occidentales, y se caracteriza por la acumulación y proliferación de linfocitos clonales B maduros CD5+ en la sangre, médula ósea, y ganglios linfáticos. La mediana de supervivencia de los pacientes es de alrededor de 10 años aunque su curso clínico es heterogéneo. Durante varias décadas el tratamiento de esta enfermedad se había basado en el empleo de agentes alquilantes como el clorambucilo, en los análogos de la purinas, o en la asociación de ambos, como la combinación de fludarabina y ciclofosfamida (FC). Posteriormente las combinaciones de rituximab, un anticuerpo monoclonal anti-CD20, con quimioterapia, en general FC, lo que ha pasado a denominarse tratamiento inmunoquimioterápico, revolucionaron el tratamiento de esta enfermedad al alcanzar intervalos de supervivencia libre de progresión (SLP) superiores a cinco años, lo que se tradujo en una mayor supervivencia de los enfermos. Sin embargo, a pesar de estos buenos resultados, los pacientes siguen recayendo de su enfermedad y la LLC continúa siendo incurable más allá del trasplante de progenitores hematopoyéticos. Con el fin de mejorar estos resultados se han diseñado nuevas combinaciones de quimioterapia como la asociación de FC con mitoxantrone (FCM), una anthracenedione con capacidad de inhibir la topoisomerasa II. Por otro lado, las estrategias de mantenimiento o las terapias de consolidación dirigidas a controlar la enfermedad mínima residual (EMR) persistente tras el tratamiento inicial, podrían derivar en una mejora en la evolución de los pacientes con LLC. Con estos antecedentes, diseñamos un ensayo clínico multicéntrico fase II en pacientes jóvenes (= 70 años) con LLC previamente no tratados que consistió en un tratamiento inicial con rituximab 500 mg/m2 (día 1) (375mg/m2 en el primer ciclo), fludarabina 25mg/m2 (días 1-3), ciclofosfamida 200mg/m2 (días 1-3), y mitoxantrone 6mg/m2 (día 1), (R-FCM), cada cuatro semanas, hasta un total de seis ciclos. Posteriormente, aquellos pacientes que obtuvieron al menos una respuesta parcial (RP) tras el tratamiento inicial fueron elegibles para la fase de mantenimiento, que consistió en 375mg/m2 de rituximab cada tres meses durante dos años. Además, se analizó la EMR mediante citometría de flujo de forma simultánea en sangre periférica y médula ósea. El objetivo principal del estudio fue el determinar la eficacia de R-FCM medida a través de la tasa de respuestas, incluyendo la tasa de respuestas con EMR negativa. Como objetivos secundarios se planteó el determinar la duración de la respuesta y la SLP, el análisis de las variables clínico-biológicas que influyen en la respuesta, y el perfil de toxicidad del tratamiento. Se incluyeron 81 pacientes en el estudio, con una mediana de edad de 60 años (rango, 40 a 70 años). La tasa de respuesta global obtenida tras el tratamiento inicial con R-FCM fue del 93%, con una tasa de respuesta completa (RC) con EMR negativa, tasa de RC con EMR positiva y de RP del 46%, 36% y 11%, respectivamente. Los factores que se correlacionaron con una menor tasa de RC fueron el estadio clínico avanzado al inicio del tratamiento, la deleción de 17p, y un valor elevado de ß2-microglobulina. En general, el tratamiento con R-FCM fue bien tolerado y aunque se observó algún grado de neutropenia en un 41% de los ciclos administrados, ésta fue grave únicamente en una 13% de los ciclos. En cuanto a la toxicidad infecciosa, se observó un evento infeccioso mayor en un 8% de los ciclos administrados. Sesenta y siete pacientes recibieron el tratamiento de mantenimiento con rituximab. Al finalizar el mantenimiento, un 40.6% de los pacientes presentaban una RC con EMR negativa, un 40.6% una RC con EMR positiva, un 4.8% un RP, y un 14% se consideraron como fallo de tratamiento. Seis de los 29 pacientes (21%) que se hallaban en RC con EMR positiva o en RP tras R-FCM mejoraron su respuesta mediante el tratamiento de mantenimiento. La SLP y la supervivencia global estimada a los cuatro años fueron del 74.8% y 93.7%, respectivamente. El nivel de EMR obtenido tras el tratamiento con R-FCM fue la variable con mayor poder predictivo de la SLP. Se observó neutropenia grave en el 8.5% de los ciclos de mantenimiento y 16 pacientes tuvieron un episodio infeccioso grado 3–4. En conclusión, la combinación de R-FCM es un tratamiento de primera línea altamente eficaz en pacientes jóvenes con LLC. Esta combinación obtuvo una alta tasa de RC, consiguiendo en gran parte de ellas la negativización de la EMR. El tratamiento de mantenimiento con rituximab tras R-FCM consiguió una SLP prolongada y mejoró la calidad de las respuestas en un porcentaje de pacientes, particularmente en aquellos con persistencia de enfermedad detectable tras R-FCM. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a frequent malignancy composed of CD5+ B-lymphocytes, is predominant in older people, and has a variable clinical course. The median survival of patients with CLL is approximately 10 years, but the individual prognosis is extremely variable. The addition of monoclonal antibodies to chemotherapy has significantly improved treatment of CLL. Based on excellent results with the chemotherapy-only regimen fludarabine, cyclophosphamide, and mitoxantrone (FCM), we built a new chemoimmunotherapy combination—rituximab plus FCM (R-FCM). The effectiveness of R-FCM followed by rituximab maintenance therapy as first-line treatment for younger patients with CLL (age = 70) has been investigated in a phase 2 clinical trial that included an initial treatment with rituximab 500 mg/m2 on day 1 (375 mg/m2 the first cycle), fludarabine 25 mg/m2 on days 1 to 3, cyclophosphamide 200 mg/m2 on days 1 to 3, and mitoxantrone 6 mg/m2 on day 1 (R-FCM), for 6 cycles. Patients achieving response received maintenance with rituximab 375 mg/m2 every 3 months for 2 years. Eighty-one patients (median age, 60 years; range, 40 to 70 years) were enrolled in the study. The overall response, minimal residual disease (MRD)–negative complete response (CR), MRD positive CR, and partial response (PR) rates were 93%, 46%, 36%, and 11%, respectively. Severe neutropenia developed in 13% of patients. Major and minor infections were reported in 8% and 5% of cycles, respectively. Advanced clinical stage, del(17p), or increased serum ß2-microglobulin levels correlated with a lower CR rate. Sixty-seven patients having achieved CR or PR with R-FCM were given maintenance therapy. At the end of maintenance, 40.6% of patients were in CR MRD-negative, 40.6% were in CR MRD-positive, 4.8% remained in PR, and 14% were considered failures. Six of 29 patients (21%) who were in CR MRD-positive or in PR after R-FCM improved their response upon rituximab maintenance. The 4-year progression-free survival (PFS) and overall survival rates were 74.8% and 93.7%, respectively. MRD status after R-FCM induction was the strongest predictor of PFS. R-FCM is highly effective in previously untreated CLL, with an 82% CR rate and a high proportion of MRD-negative CRs (46%). Treatment toxicity is acceptable. Maintenance with rituximab after R-FCM improved the quality of the response, particularly in patients MRD-positive after initial treatment, and obtained a prolonged PFS.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / The chromatin consists of a hierarchical and dynamical structure that is modulated during the different cell cycle stages in order to maintain genome integrity and preserve the genetic information coded in the DNA. The dynamic structure of the chromatin depends on the coordination of the different chromatin remodeling processes: histone modifications, chromatin remodeling enzymes/complexes, DNA methylation and chromatin architectural proteins (CAPs). Within the chromatin, the histone-mediated regulation responds mainly to the modification of its N-terminal domain or "tail." Among the different histone modifications, acetylation at specific lysine residues (K) is one of the best characterized, and the acetylation of lysine 16 of histone H4 is the most frequently acetylated residue in eukaryotes. The acetylated form of H4K16 is an important mark of actively transcribed euchromatin from yeast to humans; whereas its non acetylated form is associated with gene silencing and heterochromatin regions. The dynamics of this histone modification is mainly governed by three enzymes: the histone acetyltransferases (HAT) MOF (males absent of the first), and the histone deacetylases (HDAC) SIRT1 and SIRT2. Therefore, both groups of enzymes are essential for the regulation of gene expression and chromatin organization in the nucleus, regulating the transition between transcriptionally active and inactive state of chromatin. SIRT1 and SIRT2 belong to the Class III of HDACs, termed as sirtuins, which are crucial for genomic integrity, adaptation to the environment and aging, among other functions. On one hand, SIRT2 is the only mammalian sirtuin located in the cytoplasm, which is known to shuttle to the nucleus during G2/M. Consistently, this HDAC has its main role in deacetylating H4K16Ac during G2-M. So far, the role of SIRT2 as the main H4K16Ac during mitosis has only been demonstrated by mammalian cell culture experiments or yeast studies. Therefore, for the first time, our study demonstrates the essential role of SIRT2 in regulating H4K16Ac levels during mitosis in vivo. As a matter of fact, our results support the function of SIRT2 in regulating chromatin dynamics by its involvement in the control not only of H4K16Ac levels, but also of H4K20me1-3 levels during the whole cell cycle. Notwithstanding, as happens with other sirtuin members, SIRT2 has also been shown to regulate and deacetylate non-histone substrates that govern cell cycle, stress response, cell survival and genome stability. Furthermore, one of the main roles of SIRT2 consists of modulating cell cycle progression and SIRT2 has been found to regulate diverse mitotic checkpoint proteins such as CDH1, CDC20, BubR1 and p53. Additionally, our results suggest that the chromatin histone patterns generated by SIRT2 during mitosis are essential in the control of cell cycle progression and attend to two complementary mechanisms: the deacetylation of both H4K16Ac and PR-Set7, the monomethyltrasferase of H4K20. We have found that SIRT2 is clearly involved in a mitotic checkpoint and regulate H4K20me1 deposition under stressful conditions, in order to preserve genome integrity. On the other hand, SIRT1 has been mainly involved in regulating heterochomatin formation and gene silencing by deacetylating histone and non-histone substrates. In fact, SIRT1 is involved in the maintenance of genome integrity due to its role in heterochromatin formation by deacetylating histone marks (H3K9Ac and H1K26Ac) and regulating heterochromatin related proteins such as HP1, Suv39h1 and Ezh2. In addition, SIRT1 also deacetylates H4K16Ac, H3K9Ac and H1K26Ac at specific promoters in order to control gene expression; and regulates non-histone proteins such as p53, FoxO factors, and Rb, among others, to specifically modulate the gene expression pattern. Nonetheless, SIRT1 has recently been implicated in cell cycle regulation throughout the control of Mcm10, the eukaryotic DNA initiation factor essential for S-phase progression. Accordingly, our study also demonstrate how SIRT1 may be involved in the regulation of cell cycle progression by modulating the expression of PR-Set7 and Suv4-20h2, the enzymes in charge of mono- and di-methylate H4K20, respectively. Altogether this evidences the role of sirtuins in preserving genome integrity by modulating chromatin dynamics and cell cycle progression from mitosis to S-phase. / La cromatina consiste en una estructura jerárquica y dinámica que se regula durante el ciclo celular con el fin de mantener la integridad del genoma y preservar la información genética codificada en el ADN. Esta estructura dinámica depende de la coordinación de diferentes procesos: modificaciones histónicas, la actividad de enzimas/complejos remodeladores de la cromatina, metilación del ADN y la participación de proteínas estructurales de la cromatina. De entre estos procesos, las modificaciones histónicas tienen lugar en el dominio N-terminal o "cola" de las histonas. Entre las diferentes modificaciones que pueden sufrir, la acetilación de lisinas (K) es una de las mejor caracterizadas, y de entre ellas, la acetilación de la lisina 16 de la histona H4 es la más frecuente en eucariotas. La forma acetilada de H4K16 es una marca importante en eucromatina transcripcionalmente activa que se ha encontrado desde levaduras hasta el ser humano; mientras que su forma no acetilada se asocia con el silenciamiento de genes y regiones de heterocromatina. Esta dinámica de acetilación/desacetilación de este residuo histónico se rige principalmente por tres enzimas: la acetiltransferasa de histonas (HAT) MOF (varones ausentes de la primera), y las deacetilasas de histonas (HDAC) SIRT1 y SIRT2. Por lo tanto, los dos grupos de enzimas son esenciales para la regulación de la expresión de genes y la organización de la cromatina en el núcleo, regulando la transición entre el estado transcripcionalmente activo e inactivo de la cromatina. SIRT1 y SIRT2 pertenecen a la Clase III de las HDACs, denominado como sirtuinas, y son cruciales para el mantenimiento de la integridad genómica, la adaptación al entorno y el envejecimiento, entre otras funciones. Por un lado, SIRT2 es la única sirtuina de mamífero que se encuentra en el citoplasma, pero la cual pasa al núcleo durante G2/M. Como consecuencia, la principal función de esta HDAC es la desacetilación de H4K16Ac durante G2-M. Hasta el momento, el papel de SIRT2 como una de las principales desacetilasas de H4K16Ac durante mitosis sólo se ha demostrado por los experimentos realizados usando células de mamífero en cultivo o levaduras. Por lo tanto, nuestro estudio demuestra por primera vez el papel de SIRT2 en la regulación de los niveles de H4K16Ac en mitosis in vivo. De hecho, nuestros resultados apoyan la función de SIRT2 en la regulación de la cromatina por su participación en el control no sólo de los niveles de H4K16Ac, sino también los de H4K20me durante todo el ciclo celular. No obstante, como sucede con otros miembros de la familia de las sirtuinas, SIRT2 también regula y desacetila sustratos no histónicos que controlan el ciclo celular, la respuesta al estrés, la supervivencia celular y la estabilidad del genoma. Una de las principales funciones de SIRT2 consiste en su participación en el control del ciclo celular, habiéndose descrito diversas proteínas involucradas en el control mitótico que parecen estar reguladas por SIRT2, tales como CDH1, CDC20, BubR1 y p53. Además, nuestros resultados sugieren que los patrones de histonas generados por SIRT2 durante mitosis son esenciales en el control de la progresión del ciclo celular y se deben a dos mecanismos complementarios: la desacetilación tanto de H4K16Ac como de PR-Set7, la enzima encargada de monometilar H4K20. En consonancia, nuestro estudio ha podido demostrar como SIRT2 está claramente implicada en un punto de control de mitosis, y regula la deposición de H4K20me1 en condiciones de estrés, con el fin de preservar la integridad genómica. Por otro lado, SIRT1 ha sido principalmente descrita en la regulación de la formación de heterecromatina y silenciamiento génico por desacetilación de histonas y de sustratos no histónicos. De hecho, SIRT1 participa en el mantenimiento de la integridad del genómica a través de su función en la formación de heterocromatina, desacetilando marcas histonicas (H3K9ac y H1K26Ac) y regulando otras proteínas como HP1, Suv39h1 y Ezh2. Además, SIRT1 también desacetila H4K16Ac, H3K9Ac y H1K26Ac en promotores específicos con el fin de controlar la expresión génica; y regula proteínas no histónicas tales como Suv39h1, p53, factores FoxO, y Rb, entre otros, con el fin de modular específicamente el patrón de expresión. Además, SIRT1 ha sido recientemente implicada en el control del ciclo celular a través de la regulación de Mcm10, el factor eucariota esencial para la iniciación de la replicación del ADN durante la fase-S. Sin embargo, nuestros estudios demuestran cómo SIRT1 puede estar implicada en la regulación del ciclo celular modulando de la expresión de PR-Set7 y Suv4-20h2, las enzimas responsables de mono- y di-metilar H4K20, respectivamente. En conjunto, nuestros resultados evidencian el papel de las sirtuinas en la preservación de la integridad genomica mediante la modulación de la cromatina y de la progresión del ciclo celular desde mitosis a fase-S.

Tesi realitzada al Servei de Malalties Autoimmunes - Hospital Clínic / Giant cell arteritis (GCA) is a systemic vasculitis of unknown aetiology that affects medium-sized and large arteries. GCA may deeply impair the patient's quality of life as a result of systemic smouldering activity, disease progression or adverse effects related to therapy. The present thesis is a compendium of four articles assessing clinical and immunopathological characteristics associated with persistence of chronic inflammation in GCA patients. In the first publication, we described the clinical course of a small series of GCA patients derived from Latin America, a geographic area where data regarding this disease were virtually absent. We found that major features observed in this population were similar to those reported in series of Caucasian origin. The second article described the prevalence, predictors, and main features of relapses, one of the many faces of the persistent inflammatory activity that characterizes GCA. This study, performed in a large cohort of patients uniformly treated and followed, demonstrated that disease flares are frequent and, importantly, that a relapsing course was associated with higher and prolonged GC requirements and increased morbidity. The third publication was oriented to the need of identifying adjuvant therapies for GCA and deals with the potential benefit of adding angiotensin II receptor blockers (ARB) to standard prednisone treatment. The study rationale was based on the pleiotropic anti-inflammatory effects recently described for this drug class. Our results suggest that ATII receptor blockade may help to maintain remission, reduce the relapse rate, and spare glucocorticoids in patients with GCA. Following this clinical observation, we further investigated a potential contribution of the angiotensin II (ATII) system in the maintenance of inflammatory activity in GCA. In the fourth paper we showed that ATII system is overexpressed in GCA inflammatory lesions. In addition, we confirmed that ATII exhibited pro-inflammatory properties in co-cultures of Iymphocytes, monocytes and temporal artery-derived vascular smooth muscle cells which were reversed by the angiotensin II receptor blocker losartan.. / La arteritis de células gigantes (ACG) es una vasculitis sistémica idiopática que afecta principalmente arterias de mediano y gran calibre. La calidad de vida de estos pacientes puede verse seriamente afectada debido a múltiples complicaciones inmediatas y tardías. Esta tesis es un compendio de cuatro artículos que evalúan características clínicas e inmunopatológicas de la persistencia de la inflamación crónica en la ACG. En la primera publicación, se describen las características y la evolución de la enfermedad en una pequeña serie de pacientes latinoamericanos, concluyéndose que las manifestaciones y el comportamiento de esta vasculitis es similar a la reportada en otras cohortes, principalmente de origen caucásico. En el segundo artículo se describe la prevalencia, características y factores asociados con las recaídas o rebrotes, una manifestación de la constante actividad inflamatoria de la ACG. Nuestro estudio demostró que los pacientes con esta vasculitis sufren recaídas de manera frecuente, lo que se asoció a largo plazo con mayor requerimiento de esteroides sistémicos y mayor prevalencia de efectos adversos. La tercera publicación tuvo como punto de partida la necesidad de identificar tratamientos alternativos para lograr un mejor control de la ACG. El punto de partida de este estudio fueron los efectos anti-inflamatorios vinculados a los antagonistas de los receptores de angiotensina (ARA). Los resultados mostraron que la adición de ARA al tratamiento habitual de la ACG estaba asociado con un menor número de recaídas y un efecto ahorrador de corticoesteroides (CE). A partir de esta observación clínica, investigamos si la angiotensina II (ATll) podría desempeñar un papel en el mantenimiento de la actividad inflamatoria crónica de la ACG. En el cuarto manuscrito mostramos que el sistema de la ATll está sobre-expresado en las arterias temporales de pacientes con esta vasculitis. Además, corroboramos que la ATll es capaz de inducir citoquinas pro-inflamatorias en un sistema de co-cultivo de linfocitos, monocitos y células musculares lisas vasculares derivadas de arteria temporal, efecto inhibido mediante el bloqueante del receptor de angiotensina II, losartán.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / El limfoma de cèl•lules de mantell (MCL) és una neoplàsia limfoide sense tractament curatiu, per la qual cosa es requereix la recerca de nous fàrmacs. La identificació de noves dianes terapèutiques pel MCL i l’estudi del mecanisme d’actuació dels fàrmacs tenen una gran importància translacional. Atès que s’ha observat resposta clínica al fàrmac immunomodulador lenalidomida en pacients de MCL i que el seu mecanisme d’acció encara roman parcialment desconegut, hem volgut investigar si l’expressió i la localització subcel•lular de la ciclina D1, un important regulador del cicle cel•lular sobreexpressat en el MCL, i l’inhibidor de cinases dependents de ciclines, p27KIP1 podrien identificar casos de MCL sensibles a la lenalidomida, i si el fàrmac podria modular els complexos de ciclina D1/p27KIP1. Es va trobar que la ciclina D1 i p27KIP1 s’expressaven de forma coordinada en tots els casos testats de MCL. Les anàlisis d’immunoprecipitació i els assajos de siRNA van suggerir un rol directe de la ciclina D1 en la regulació dels nivells de p27KIP1. L’acumulació nuclear de totes dues proteïnes va correlacionar amb la tumorigenicitat del MCL in vivo, i la sensibilitat a l’activitat de la lenalidomida in vitro i in vivo. El mecanisme d’acció de la lenalidomida va dependre de la depleció de la ciclina D1 i de la dissociació dels complexos ciclina D1/p27KIP1, seguida de l’acumulació citosòlica de p27KIP1, aturada de cicle, apoptosi i inhibició de l’angiogènesi. Per tant, aquests resultats revelen un mecanisme d’acció de la lenalidomida en casos de MCL amb una incrementada tumorigenicitat in vivo que consisteix en la dissociació dels complexos ciclina D1/p27KIP1 i el subseqüent bloqueig de la proliferació i la inducció d’apoptosi. A més, es va analitzar la localització subcel•lular de p27KIP1 en línies cel•lulars en assajos in vitro, i no es va trobar correlació entre els nivells nuclears de p27KIP1 i la proliferació cel•lular. Resultats similars es van trobar en comparar el rati p27KIP1/ciclina D1 amb el percentatge de cèl•lules en fase S. També va ser analitzat el paper de p27KIP1 a mostres primàries in vitro i tampoc no es va trobar correlació. Aquests resultats suggereixen que ni p27KIP1 ni el complex que forma amb ciclina D1 estan implicats en la regulació de la proliferació en mostres de MCL in vitro. Com que el tractament amb bortezomib ha mostrat una activitat clínica prometedora en el MCL però sovint es desenvolupen resistències, hem volgut investigar sobre aquest esdeveniment. Ratolins immunodeprimits van ser inoculats amb línies de MCL amb diferent sensibilitat al fàrmac i a continuació es va procedir a determinar el perfil d’expressió gènica dels tumors i la validació funcional de les signatures gèniques identificades. Vàrem observar una augmentada tumorigenicitat in vivo en els casos de MCL resistent a bortezomib, que va ser associada a trets de diferenciació plasmocítica, com un augment en IRF4. La lenalidomida va ser particularment efectiva en aquest subgrup de tumors, actuant sobre el programa de diferenciació plasmocític i superant la resistència a bortezomib. La inhibició del gen diana d’IRF4, MYC, en les cèl•lules resistents a bortezomib (per knockdown o bé amb CPI203, un inhibidor de proteïnes BET), va induir de forma sinèrgica la mort cel•lular quan es va combinar amb la lenalidomida. En ratolins, l’addicció del CPI203 i la lenalidomida, va promoure la reducció de la càrrega tumoral, implicant la disminució simultània de MYC i d’IRF4 i la inducció d’apoptosi. Aquests resultats suggereixen que la senyalització exacerbada d’IRF4/MYC està associada a la resistència a bortezomib en el MCL in vivo i garanteix l’avaluació clínica de la lenalidomida conjuntament amb el CPI203 en casos de MCL refractaris a bortezomib. / Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid neoplasm characterized by the overexpression of cyclin D1. Clinical responses to lenalidomide have been observed, although its mechanism of action remains partially unknown. We investigated whether the expression and subcellular localization of cyclin D1 and p27KIP1 could identify MCL cases sensitive to lenalidomide, and whether the compound could modulate cyclin D1/p27KIP1 complexes. We found cyclin D1 and p27KIP1 to be coordinately expressed in all the samples tested. Experiments suggested a direct role of cyclin D1 in the regulation of p27KIP1 levels. The nuclear accumulation of both proteins correlated with MCL cell tumorigenicity in vivo, and sensitivity to lenalidomide activity in vitro and in vivo. Lenalidomide mechanism of action relied on cyclin D1 downregulation and disruption of cyclin D1/p27KIP1 complexes, followed by cytosolic accumulation of p27KIP1, cell proliferation arrest, apoptosis, and angiogenesis inhibition, especially in MCL cases with increased tumorigenicity in vivo. Moreover, we analyzed the subcellular localization of p27KIP1 in cell lines. We then compared the nuclear p27KIP1 protein level or the nuclear p27KIP1/cyclin D1 ratio and the percentage of cells in S phase, and observed no correlation between these parameters. Similar results were found in primary cells from patients. Altogether, our results strongly suggest that p27KIP1 or its complex with cyclin D1 may not be involved in the regulation of MCL cell proliferation in vitro. Bortezomib therapy has shown promising clinical activity in MCL, but the development of resistance is common. Immunodeficient mice were engrafted with MCL cell lines with different levels of sensitivity to the drug, followed by gene expression profiling of the tumors. We observed an increased tumorigenicity of bortezomib-resistant MCL cells in vivo, which was associated with plasmacytic differentiation features, like IRF4 upregulation. Lenalidomide was particularly active in this subgroup of tumors targeting plasmacytic differentiation program, thus overcoming bortezomib resistance. Moreover, repression of the IRF4 target gene MYC in bortezomib-resistant cells (by gene knockdown or CPI203, a BET inhibitor), synergistically induced cell death when combined with lenalidomide. In mice, addition of CPI203 to lenalidomide therapy further decreased tumor burden, involving simultaneous MYC and IRF4 downregulation and apoptosis.

Currently, resources that may be spent in health care are limited so it is necessary to rationalize their consumption and prioritise their allocation to the options with higher health outcome and economic sustainability. It is for that reason that economic analyses are increasingly included in medicine research as an instrument for evaluating different therapeutic strategies. In this thesis, both cost and health outcome are separately and jointly evaluated to compare different therapeutic strategies to treat diseases in different and specific health areas. The challenge was adapting and implementing the methods to reflect the assessed health issue. The analyses require data, and the main sources to obtain them are clinical studies (prospective or retrospective), or simulation models. The use of simulations avoids to experiment directly to the system of interest, these methods imply a smaller time consumption and cost, and any danger can be caused by the experimentation performance. However, the simulated data always is going to be an approximation of real data. Real data of a clinical trial was used in the assessment of the adherence to antiretroviral treatment promotion program in HIV infected patients. A decision tree was used to study the cost per health gain, measured by means of clinical and health related quality of life outcomes. The simulation of a Spanish cohort of postmenopausal women and their possible osteoporotic fractures was done to assess the performance of two treatments for the prevention of vertebral and non-vertebral fractures in terms of cost-effectiveness. Simulation by means of a Markov model required that the disease evolution and the related events were simplified using a finite number of health states and the probabilities of moving from one state to another as the time go on. Markov models were adapted to reflect that the risk of suffering an event can change over time. This analytical model was applied to elucidate whether co-receptors testing is cost-effective to determine patient¿s suitability to benefit from the use of an antiretroviral treatment that includes maraviroc. All HIV strains require binding to CD4 plus at least one of the 2 co-receptors CCR5 or CXCR4 to enter human cells. Some HIV can use both co-receptors, and some individuals have a mixture of strains. Only patients with exclusively CCR5-tropic HIV are considered eligible to use the CCR5 antagonist maraviroc. A budget impact analyses to assess the economic effects of introducing eculizumab for treating the paroxysmal nocturnal hemoglobinuria was performed. Direct and indirect costs of this disease treatment were estimated and reported from the perspective of the health care system and from the societal perspective. Most of the published clinical studies are focused on measuring health in terms of efficacy and/or safety. But, sometimes the health and well-being quantification is not a direct measurement. Here, the calculation of the burden of disease for osteoporotic women who may suffer from fractures done at an individual level was presented in terms of disability adjusted life years (DALYs). Few studies of burden of diseases are available, and even less for Spanish population and performed using individual characteristics. The pharmacoeconomic studies can be useful in the health resources rationalization, and both budget impact analyses and new health measures are complementary tools. The work performed in this thesis constitutes a good example of methods application and adaptation to answer real clinical questions. / Actualment, els recursos destinats a la salut són limitats i es fa necessari racionalitzar-ne el seu consum; cal prioritzar la despesa en opcions que reportin un major benestar i que siguin sostenibles econòmicament. És per aquest motiu, que cada cop hi ha més estudis clínics que inclouen paràmetres econòmics com a instrument per triar entre diferents estratègies terapèutiques. En aquesta tesi, tant el cost com la resposta de salut s'estudien per separat i conjuntament per a comparar diferents estratègies per al tractament de malalties de diferent àrees de salut. El repte es troba en adaptar i implementar la metodologia necessària per a dur a terme el seguiment d'aquests problemas de salut. Les anàlisis requereixen dades i la majoria d'elles provenen d'estudis clínics, ja siguin prospectius o retrospectius, o bé de models de simulació. L'ús de dades simulades evita experimentar directament amb el sistema d'interès, implicant un temps menor, un cost més econòmic i un decreixement del risc d'experimentació necessaris per a l'obtenció de resultats. Per contrapartida, la simulació és una aproximació de les dades reals. D'una banda, l'avaluació d'un programa de promoció de l'adherència al tractament antiretroviral per pacients VIH+ es du a terme amb dades reals recollides en el marc d'un assaig clínic. El cost per unitat de guany en salut, mesurat amb paràmetres clínics i en qualitat de vida, es representa mitjançant un arbre de decisió. A continuació, la simulació d'una cohort de dones espanyoles post menopàusiques i les seves possibles fractures òssies permet comparar, en termes de cost-efectivitat, dos tractaments usats en la prevenció de fractures vertebrals i no vertebrals. Els models de Markov permeten simular el curs de la malaltia fent servir un nombre finit d'esdeveniments que representen els possibles estats de salut i la probabilitat de que un pacient canviï d'estat amb l'adaptació dels models de Markov per permetre que el risc de patir un esdeveniment variï en el temps permet determinar si els tests de co-receptors del VIH són cost-efectius per decidir si un pacient es pot beneficiar del tractament antiretroviral amb maraviroc. Les cadenes de VIH s'han d'unir als CD4, com a mínim, en un dels dos co-receptors possibles, CCR5 o CXCR4, per entrar a la cèl.lula. Alguns virus VIH fan servir els dos co-receptors i alguns individus tenen una mixtura de cadenes de VIH. Els pacients que es poden beneficiar de l'ús de maraviroc son aquells que estan infectats únicament per virus amb el co-receptor CCR5. Per últim, una anàlisis d'impacte pressupostari permet quantificar la despesa econòmica d'introduir eculizumab per a tractar la hemoglobinúria paroxística nocturna. En aquest cas, s'ha fet una estimació de costos directes i indirectes i es reporten des de la perspectiva del sistema sanitari i des de la perspectiva de la societat. La major part d'estudis clínics publicats es centren en la mesura de la salut en termes d'eficàcia i/o de seguretat; però moltes vegades, la salut i el benestar no es poden quantificar de manera directa. En aquest cas, la càrrega de la malaltia de l'osteoporosi en dones post menopàusiques ha estat quantificada mitjançant anys de vida viscuts amb discapacitat (DALYs) calculats a partir de dades obtingudes a nivell d'individu. Actualment es disposa de pocs estudis de càrrega de malaltia, i menys encara per a població espanyola i amb dades individuals. Els estudis farmacoeconòmics són d'utilitat en l'assignació de recursos, i els estudis d'impacte pressupostari i la generació de noves mesures per a quantificar la salut i el benestar son eines complementàries. El treball realitzat en aquesta tesis és un bon exemple d'aplicació i adaptació de l'estadística per a respondre diferents qüestions de rellevància clínica actualment.

La sortida de mitosis comprèn tots els processos de la mitosis que van des de la segregació de les cromàtides germanes a l’obtenció de dues cèl·lules filles genèticament idèntiques. A nivell molecular, les cèl·lules inicien diversos processos per inactivar la Cdk mitòtica, requisit imprescindible per acabar la mitosis i entrar en la següent fase G1. La sortida de mitosis en el llevat de gemmació, S. Cerevisiae, s’inicia amb l’activació del complex promotor d’anafase APCCdc20 i l’activació de la fosfatasa Cdc14. Dues rutes complementàries i seqüencials, FEAR (de l’anglès Cdc14 early anaphase release) i MEN (de l’anglès mitotic exit network), promouen l’alliberament i activació de la fosfatasa Cdc14 durant l’anafase, la qual es considera clau per eliminar l’activitat mitòtica de Cdk1 i sortir de mitosis. La fosfatasa Cdc14 es manté segrestada al nuclèol durant la resta del cicle cel·lular mitjançant la seva unió a la proteïna nucleolar Net1. A l’inici de l’anafase, la proteasa separasa hidrolitza el complex de cohesina, desencadenant així la separació de les cromàtides germanes i, alhora, coopera amb Zds1 per promoure la inhibició de la fosfatasa PP2ACdc55. La caiguda d’activitat PP2ACdc55 facilita la fosforilació de Net1 dependent de Cdk1, promovent així que Cdc14 s’alliberi al nucli. La quinasa polo, Cdc5, contribueix en aquest procés. A mesura que l’activitat mitòtica de Cdk1 disminueix, degut a l’acció d’APCCdc20 degradant ciclines mitòtiques i l’activitat de Cdc14, les cèl·lules activen la ruta MEN per mantenir Net1 fosforilat i Cdc14 actiu fins al final d’anafase. La ruta de MEN comprèn la GTPasa Tem1, i les quinases Cdc15 i Mob1-Dbf2. L’inici de la ruta està regulat pel complex Bfa1-Bub2, que manté Tem1 inactiu fins l’anafase, i per Lte1, que promou l’activació de Tem1. Un cop activa, la ruta de MEN allibera Cdc14 al citoplasma, on permet l’acumulació de l’inhibidor de Cdk1, Sic1, i on també activa el complex APCCdh1, el qual finalitza amb la degradació de les ciclines mitòtiques. Per tant, la completa activació de Cdc14 al final de l’anafase promou la inactivació de Cdk1 i contraresta les fosforilacions mitòtiques d’aquesta, permetent així la sortida de mitosis i entrada a G1. Com la cèl·lula coordina la segregació cromosòmica amb la inactivació de la Cdk mitòtica és de gran interès, doncs errors en aquest procés provoquen la mort cel·lular. Així doncs, la descripció detallada dels mecanismes moleculars que regulen la sortida de mitosis tenen un gran potencial pel disseny de futures teràpies contra el càncer. El treball que es presenta en aquesta tesis doctoral aprofundeix en el paper de la fosfatasa PP2ACdc55 en la sortida de mitosis, fosfatasa que està emergent com a regulador clau del cicle cel·lular en organismes superiors. Resultats previs del grup suggereixen la implicació de la fosfatasa PP2ACdc55 en la iniciació de la ruta MEN i d’altres possibles funcions. OBJECTIUS 1. Descriure el paper de la fosfatasa PP2ACdc55 en la regulació de la ruta MEN 2. Identificar nous possibles substrats i funcions de la fosfatasa PP2ACdc55 mitjançant un screening proteòmic.

Estudios previos han demostrado que los miRNAs juegan un papel muy importante en infinidad de procesos celulares, y son imprescindibles para la correcta homeostasis celular. Su desregulación ha sido ampliamente descrita en cáncer. En este sentido algunos estudios han demostrado que la expresión de miRNAs puede definir entidades de forma más precisa que el estudio de expresión mediante microarrays de miles de RNAs. A partir de este fundamento en esta tesis llevamos a cabo la caracterización del perfil de expresión de miRNA en una amplia cohorte de pacientes con LMA diagnosticados y tratados en nuestro centro y en otros centros del grupo cooperativo CETLAM, correspondientes a una amplia diversidad de variedades citogenéticas y moleculares, con un doble objetivo: una mejor caracterización de los mecanismos biológicos subyacentes de algunas variedades biológicas, menos conocidas, y, por otra parte, el análisis del posible valor pronóstico del nivel de expresión de algunos miRNAs expresados en la enfermedad. Así, y como resultado de los estudios de esta tesis, obtuvimos la firma de miRNA distintiva de la LMA t(8;16). Por otra parte, en un segundo estudio, pudimos identificar algunos miRNA cuyo nivel de expresión proporcionaba información pronóstica adicional a las mutaciones de los genes más habitualmente analizados en la categoría de pacientes con riesgo citogenético intermedio. La leucemia mieloide aguda (LMA) con t(8;16)(p11;p13) (LMA t(8;16)) tiene un perfil clínico- biológico característico, pero su patrón de expresión de microRNAs es desconocido. En el presente trabajo hemos analizado 670 miRNAs maduros en 7 pacientes con LMA con t(8;16) y en 113 pacientes con otros subtipos de LMA, así como en tres controles CD34+ de donante sano. El análisis jerárquico de grupos (“Hierarchical cluster analysis”) demostró que todos los pacientes con LMA t(8;16) se agruparon en un grupo (“cluster”) independiente. Asimismo, el análisis supervisado reveló una firma distintiva de 94 miRNAs, la mayoría de los cuales estaban infraexpresados, entre los que se encontraban el miR-21 y el cluster miR-17-92. Con el objetivo de entender porqué miR-21 y el cluster miR-17-92 se encontraban infraexpresados en este subgrupo en comparación con el resto de grupos de LMA, se estudió la expresión de sus factores de transcripción STAT3 y c-Myc respectivamente. El análisis de expresión del RNAm de dos conocidos factores de transcripción de estos miRNAs (STAT3 y c-Myc) mostró una infraexpresión significativa de STAT3 (P=0.04). Por otra parte, el análisis bioinformático mostró que 29 de los miRNAs que estaban infraexpresados podrían estar regulados por metilación. Con el fin de comprobar si estos miRNAs podían estar regulados por metilación, tratamos una muestra de células primarias de LMA t(8;16) con 5-aza-2'-deoxycytidina (5-AZA-dC) y Tricostatin A (TSA) y encontramos que 27 miRNAs se reexpresaron después de dicho tratamiento. Sin embargo, no se encontraron diferencias en el estado de metilación entre las LMA con t(8;16) y los otros subtipos ni en metilación global, ni en metilación de promotores de miRNAs. Finalmente, se correlacionó la expresión de RNAm (de la que disponíamos de un estudio previo: Camós, Esteve et al; Cancer Res 2006) con la expresión de miRNAs para identificar posibles dianas reguladas por los miRNAs de la firma. La correlación entre la expresion de mRNA y la de miRNAs identificó RET como una potencial diana de tres de los miRNAs característicos de esta entidad. Mediante ensayo de Renilla-Luciferas y citometría de flujo tras la transfección con pre-miRNAs se confirmó que RET estaba regulado por los miRNAs de la firma miR-218, miR-128, miR-27b, miR-15a y miR-195. En conclusión, la LMA t(8;16) presenta una firma característica de miRNAs que está regulada parcialmente mediante mecanismos epigenéticos y que tienen como diana el protooncogén RET. La LMA es una enfermedad heterogénea cuyo tratamiento óptimo varía de acuerdo a los factores de riesgo citogenéticos y los marcadores moleculares. Varios estudios han demostrado la importancia pronóstica de los miRNAs en LMA. En este trabajo analizamos en una serie de 238 pacientes con LMA de riesgo citogenético intermedio (LMA-RI) que provienen de 16 instituciones que forman parte del grupo cooperativo CETLAM, la asociación entre la expresión de algunos miRNAs y el pronóstico clínico. En primer mediante el estudio de expresión de 670 miRNAs en un subgrupo de 85 pacientes de LMA-RI que provenían de una sola institución identificamos 10 miRNAs con valor pronóstico. Posteriormente validamos estos 10 miRNAs mediante ensayos individuales en toda la cohorte (n=288) confirmando el impacto pronóstico de 4 miRNAs. Niveles altos de miR-196b y miR-644 se asociaron de manera independiente con una supervivencia acortada y niveles bajos de miR-135a y miR-409-3p se asociaron con un mayor riesgo de recaída. De manera interesante miR-135a y miR-409-3p mantuvieron su valor pronóstico independiente dentro del subgrupo molecular de mal pronóstico (NPM1 no mutado y CEBPA no mutado y/o FLT3-ITD), y miR-644 mantuvo su valor pronóstico en el subgrupo molecular favorable. En conclusión, en el presente trabajo se han identificado 4 miRNAs con valor pronóstico en LMA-RI, y que además añaden información pronóstica adicional a los marcadores moleculares. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs (22–24 nucleotides in length) that have an important regulatory role in most biological processes, including development, regulation of cell proliferation and apoptosis, and stem cell self-renewal and differentiation. Moreover, their expression is altered in cancer, where they can function as both oncogenes and tumor suppressor genes. Several studies have shown the importance of microRNA (miRNA) deregulation in AML. Distinctive miRNA profiles have been identified correponding to specific cytogenetic subtypes. From the prognostic standpoint, some studies have identified several miRNAs associated with clinical outcome. Given the relevant regulatory role of miRNAs in hematopoiesis and their deregulated expression in hematological malignancies including AML, we have analyzed miRNAs expression in AML patients and we have performed two main studies. First, we have described a specific miRNA profile of t(8;16) AML subype and second the prognostic value of miRNAs in a large cohort of patients with IR-AML treated within the Spanish cooperative group CETLAM. Acute myeloid leukemia (AML) with t(8;16)(p11;p13) (t(8;16) AML) has unique clinico-biological characteristics, but its microRNA pattern is unknown. We analyzed 670 microRNAs in seven patients with t(8;16) AML and 113 with other AML subtypes. Hierarchical cluster analysis showed that all t(8;16) AML patients grouped in an independent cluster. Supervised analysis revealed a distinctive signature of 94-microRNAs, most of which were downregulated, including miR-21 and cluster miR-17-92. The mRNA expression analysis of two known transcription factors of these microRNAs (STAT3 and c-Myc, respectively) showed significant downregulation of STAT3 (P=0.04). A bioinformatic analysis showed that 29 of the downregulated microRNAs might be regulated by methylation; we treated a t(8;16) AML sample with 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AZA-dC) and trichostatin A and found that 27 microRNAs were re-expressed after treatment. However, there was no difference in methylation status between t(8;16) and other AML subtypes, either overall or in the microRNA promoter. Cross-correlation of mRNA and microRNA expression identified RET as a potential target of several microRNAs. A Renilla-luciferase assay and flow cytometry after transfection with pre-microRNAs confirmed that RET is regulated by miR-218, miR-128, miR-27b, miR-15a and miR-195. In conclusion, t(8;16) AML harbors a specific microRNA signature that is partially epigenetically regulated and targets RET proto-oncogene. Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous disease, and optimal treatment varies according to cytogenetic risk factors and molecular markers. Several studies have demonstrated the prognostic importance of microRNAs (miRNAs) in AML. Here we report a potential association between miRNA expression and clinical outcome in 238 intermediate-risk cytogenetic AML (IR-AML) patients from 16 institutions in the CETLAM cooperative group. We first profiled 670 miRNAs in a subset of 85 IR-AML patients from a single institution and identified 10 outcome-related miRNAs. We then validated these 10 miRNAs by individual assays in the total cohort and confirmed the prognostic impact of 4 miRNAs. High levels of miR-196b and miR-644 were independently associated with shorter overall survival, and low levels of miR-135a and miR-409-3p with a higher risk of relapse. Interestingly, miR-135a and miR-409-3p maintained their independent prognostic value within the unfavorable molecular subcategory (wild-type NPM1 and CEBPA and/or FLT3-ITD), and miR-644 retained its value within the favorable molecular subcategory. miR-409-3p, miR-135a, miR-196b and mir-644 arose as prognostic markers for IR-AML, both overall and within specific molecular subgroups.

Estudios previos han demostrado que los miRNAs juegan un papel muy importante en infinidad de procesos celulares, y son imprescindibles para la correcta homeostasis celular. Su desregulación ha sido ampliamente descrita en cáncer. En este sentido algunos estudios han demostrado que la expresión de miRNAs puede definir entidades de forma más precisa que el estudio de expresión mediante microarrays de miles de RNAs. A partir de este fundamento en esta tesis llevamos a cabo la caracterización del perfil de expresión de miRNA en una amplia cohorte de pacientes con LMA diagnosticados y tratados en nuestro centro y en otros centros del grupo cooperativo CETLAM, correspondientes a una amplia diversidad de variedades citogenéticas y moleculares, con un doble objetivo: una mejor caracterización de los mecanismos biológicos subyacentes de algunas variedades biológicas, menos conocidas, y, por otra parte, el análisis del posible valor pronóstico del nivel de expresión de algunos miRNAs expresados en la enfermedad. Así, y como resultado de los estudios de esta tesis, obtuvimos la firma de miRNA distintiva de la LMA t(8;16). Por otra parte, en un segundo estudio, pudimos identificar algunos miRNA cuyo nivel de expresión proporcionaba información pronóstica adicional a las mutaciones de los genes más habitualmente analizados en la categoría de pacientes con riesgo citogenético intermedio. La leucemia mieloide aguda (LMA) con t(8;16)(p11;p13) (LMA t(8;16)) tiene un perfil clínico- biológico característico, pero su patrón de expresión de microRNAs es desconocido. En el presente trabajo hemos analizado 670 miRNAs maduros en 7 pacientes con LMA con t(8;16) y en 113 pacientes con otros subtipos de LMA, así como en tres controles CD34+ de donante sano. El análisis jerárquico de grupos (“Hierarchical cluster analysis”) demostró que todos los pacientes con LMA t(8;16) se agruparon en un grupo (“cluster”) independiente. Asimismo, el análisis supervisado reveló una firma distintiva de 94 miRNAs, la mayoría de los cuales estaban infraexpresados, entre los que se encontraban el miR-21 y el cluster miR-17-92. Con el objetivo de entender porqué miR-21 y el cluster miR-17-92 se encontraban infraexpresados en este subgrupo en comparación con el resto de grupos de LMA, se estudió la expresión de sus factores de transcripción STAT3 y c-Myc respectivamente. El análisis de expresión del RNAm de dos conocidos factores de transcripción de estos miRNAs (STAT3 y c-Myc) mostró una infraexpresión significativa de STAT3 (P=0.04). Por otra parte, el análisis bioinformático mostró que 29 de los miRNAs que estaban infraexpresados podrían estar regulados por metilación. Con el fin de comprobar si estos miRNAs podían estar regulados por metilación, tratamos una muestra de células primarias de LMA t(8;16) con 5-aza-2'-deoxycytidina (5-AZA-dC) y Tricostatin A (TSA) y encontramos que 27 miRNAs se reexpresaron después de dicho tratamiento. Sin embargo, no se encontraron diferencias en el estado de metilación entre las LMA con t(8;16) y los otros subtipos ni en metilación global, ni en metilación de promotores de miRNAs. Finalmente, se correlacionó la expresión de RNAm (de la que disponíamos de un estudio previo: Camós, Esteve et al; Cancer Res 2006) con la expresión de miRNAs para identificar posibles dianas reguladas por los miRNAs de la firma. La correlación entre la expresion de mRNA y la de miRNAs identificó RET como una potencial diana de tres de los miRNAs característicos de esta entidad. Mediante ensayo de Renilla-Luciferas y citometría de flujo tras la transfección con pre-miRNAs se confirmó que RET estaba regulado por los miRNAs de la firma miR-218, miR-128, miR-27b, miR-15a y miR-195. En conclusión, la LMA t(8;16) presenta una firma característica de miRNAs que está regulada parcialmente mediante mecanismos epigenéticos y que tienen como diana el protooncogén RET. La LMA es una enfermedad heterogénea cuyo tratamiento óptimo varía de acuerdo a los factores de riesgo citogenéticos y los marcadores moleculares. Varios estudios han demostrado la importancia pronóstica de los miRNAs en LMA. En este trabajo analizamos en una serie de 238 pacientes con LMA de riesgo citogenético intermedio (LMA-RI) que provienen de 16 instituciones que forman parte del grupo cooperativo CETLAM, la asociación entre la expresión de algunos miRNAs y el pronóstico clínico. En primer mediante el estudio de expresión de 670 miRNAs en un subgrupo de 85 pacientes de LMA-RI que provenían de una sola institución identificamos 10 miRNAs con valor pronóstico. Posteriormente validamos estos 10 miRNAs mediante ensayos individuales en toda la cohorte (n=288) confirmando el impacto pronóstico de 4 miRNAs. Niveles altos de miR-196b y miR-644 se asociaron de manera independiente con una supervivencia acortada y niveles bajos de miR-135a y miR-409-3p se asociaron con un mayor riesgo de recaída. De manera interesante miR-135a y miR-409-3p mantuvieron su valor pronóstico independiente dentro del subgrupo molecular de mal pronóstico (NPM1 no mutado y CEBPA no mutado y/o FLT3-ITD), y miR-644 mantuvo su valor pronóstico en el subgrupo molecular favorable. En conclusión, en el presente trabajo se han identificado 4 miRNAs con valor pronóstico en LMA-RI, y que además añaden información pronóstica adicional a los marcadores moleculares. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs (22–24 nucleotides in length) that have an important regulatory role in most biological processes, including development, regulation of cell proliferation and apoptosis, and stem cell self-renewal and differentiation. Moreover, their expression is altered in cancer, where they can function as both oncogenes and tumor suppressor genes. Several studies have shown the importance of microRNA (miRNA) deregulation in AML. Distinctive miRNA profiles have been identified correponding to specific cytogenetic subtypes. From the prognostic standpoint, some studies have identified several miRNAs associated with clinical outcome. Given the relevant regulatory role of miRNAs in hematopoiesis and their deregulated expression in hematological malignancies including AML, we have analyzed miRNAs expression in AML patients and we have performed two main studies. First, we have described a specific miRNA profile of t(8;16) AML subype and second the prognostic value of miRNAs in a large cohort of patients with IR-AML treated within the Spanish cooperative group CETLAM. Acute myeloid leukemia (AML) with t(8;16)(p11;p13) (t(8;16) AML) has unique clinico-biological characteristics, but its microRNA pattern is unknown. We analyzed 670 microRNAs in seven patients with t(8;16) AML and 113 with other AML subtypes. Hierarchical cluster analysis showed that all t(8;16) AML patients grouped in an independent cluster. Supervised analysis revealed a distinctive signature of 94-microRNAs, most of which were downregulated, including miR-21 and cluster miR-17-92. The mRNA expression analysis of two known transcription factors of these microRNAs (STAT3 and c-Myc, respectively) showed significant downregulation of STAT3 (P=0.04). A bioinformatic analysis showed that 29 of the downregulated microRNAs might be regulated by methylation; we treated a t(8;16) AML sample with 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AZA-dC) and trichostatin A and found that 27 microRNAs were re-expressed after treatment. However, there was no difference in methylation status between t(8;16) and other AML subtypes, either overall or in the microRNA promoter. Cross-correlation of mRNA and microRNA expression identified RET as a potential target of several microRNAs. A Renilla-luciferase assay and flow cytometry after transfection with pre-microRNAs confirmed that RET is regulated by miR-218, miR-128, miR-27b, miR-15a and miR-195. In conclusion, t(8;16) AML harbors a specific microRNA signature that is partially epigenetically regulated and targets RET proto-oncogene. Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous disease, and optimal treatment varies according to cytogenetic risk factors and molecular markers. Several studies have demonstrated the prognostic importance of microRNAs (miRNAs) in AML. Here we report a potential association between miRNA expression and clinical outcome in 238 intermediate-risk cytogenetic AML (IR-AML) patients from 16 institutions in the CETLAM cooperative group. We first profiled 670 miRNAs in a subset of 85 IR-AML patients from a single institution and identified 10 outcome-related miRNAs. We then validated these 10 miRNAs by individual assays in the total cohort and confirmed the prognostic impact of 4 miRNAs. High levels of miR-196b and miR-644 were independently associated with shorter overall survival, and low levels of miR-135a and miR-409-3p with a higher risk of relapse. Interestingly, miR-135a and miR-409-3p maintained their independent prognostic value within the unfavorable molecular subcategory (wild-type NPM1 and CEBPA and/or FLT3-ITD), and miR-644 retained its value within the favorable molecular subcategory. miR-409-3p, miR-135a, miR-196b and mir-644 arose as prognostic markers for IR-AML, both overall and within specific molecular subgroups.

INTRODUCTION Quinolones are potent and broad spectrum antibacterial agents and, among them, several fluoroquinolones, such as ciprofloxacin, are the treatment of choice against several human infections. Resistance to quinolones is steadily increasing and can be explained by different mechanisms: i) mutations in the target genes, ii) mutations leading to decreased intracellular accumulation of the antibiotic (either by overexpression of efflux pumps or diminished production of porins, the entrance channels for quinolones), and iii) aquisition of plasmid-encoded genes. Acquisition of quinolone resistance is a stepwise process. The first mutation usually leads to nalidixic acid resistance whereas further mutations trigger resistance to fluoroquinolones such as ciprofloxacin. WORK JUSTIFICATION Nalidixic acid resistance is an increasing trend among Escherichia coli, Salmonella Typhimurium and Yersinia enterocolitica clinical isolates thereby compromising the success of antimicrobial therapies. However, ciprofloxacin resistance is not increasing to the same extent in S. Typhimuium and Y. Enterocolitica strains. These results suggest that ciprofloxacin resistance acquisition can somehow impair the bacterial ability in causing disease. Moreover, an in depth study of the mechanisms of fluoroquinolone resistance may lead to the development of new strategies for either combating or reducing the emergence or potential emergence of fluoroquinolone resistance or limiting this effect. OBJECTIVES The main objective of this thesis was to study the molecular mechanisms leading to fluoroquinolone resistance in several pathogens of clinical importance: uropathogenic E. coli and enteric S. Typhimurium and Y. enterocolitica isoaltes. Futhermore, in parallel, the effect of fluoroquinolone resistance acquisition on the expression of several virulence factors (e.g., those leading to invasion and biofilm production) in the two enteric pathogens was evaluated. RESULTS The results obtained in this thesis have led to the publication of four original articles, two manuscripts pending of acceptance in scientific journals and two blocks of additional results. • E. coli: The mechanisms of resistance to fluoroquinolones were studied in two strains: PS5, a susceptible clinical isolate, and NorE5, a fluoroquinolone resistant mutant obtained in vitro (norfloxacin MIC of 32 microg/mL). NorE5 was shown to overexpress the efflux pump AcrAB-TolC attributable to increased SoxS expression likely associated to a mutation within SoxR. Additionally, the mdtG and ompN genes were reported to belong to the soxS regulon. Particularly, the ompN gene is cotranscribed with the upstream gene ydbK. • S. Typhimurium: The prevalence of quinolone resistance mechanisms was evaluated in a collection of Salmonella spp clinical isolates. Almost half of the strains (41.5%) were resistant to nalidixic acid due to a mutation in the target gene gyrA and efflux pump overexpression. Moreover, two S. Typhimurium clinical isolates susceptible to nalidixic acid were selected to obtain in vitro ciprofloxacin resistant mutants (50-64, ciprofloxacin MIC of 64 microg/mL, and 59-64, ciprofloxacin MIC of 256 microg/mL). Strain 50-64 acquired three target gene mutations, overexpressed AcrAB-TolC but showed a reduced fitness as well as invasion on cell culture. Strain 59-64 acquired five target gene mutations, overexpressed the regulator ramA leading to increased efflux independently of AcrAB, which was inactivated in both the clinical and the resistant strain. • Y. enterocolitica: A nalidixic acid-susceptible Y. enterocolitica clinical isolate was selected to obtain in vitro a ciprofloxacin resistant mutant (Y.83-64, ciprofloxacin MIC of 64 microg/mL). The resistant strain acquired four target gene mutations, overexpressed AcrAB-TolC attributable to a mutation in the promoter of the marA homolog (marAYe) present in Yersinia. Moreover, strain Y.83-64 showed reduced invasion. In parallel, the heterogeneity in the selection of target gene mutations was assessed in an intermediate mutant (ciprofloxacin MIC of 4 microg/mL). / INTRODUCCIÓ Les quinolones són antibiòtics d’ampli espectre i gran potència d’entre els quals, algunes fluoroquinolones com la ciprofloxacina, representen el tractament d’elecció per moltes infeccions. La resistència a aquests compostos és deguda a: i) mutacions en els gens diana, ii) mutacions que redueixen l’acumulació interna de l’antibiòtic (sobreexpressió de bombes d’expulsió i descens en la producció de porines), iii) adquisició de gens plasmídics. L’adquisició de resistència a les quinolones és un procés gradual. La primera mutació generalment confereix resistència a l’àcid nalidíxic, mentre que noves mutacions deriven en resistència a la ciprofloxacina. JUSTIFICACIÓ I OBJECTIUS L’increment de resistència a l’àcid nalidíxic en soques d’Escherichia coli, Salmonella Typhimurium i Yersinia enterocolitica és cada vegada més important, tot i que la resistència a la ciprofloxacina en els dos últims patògens no augmenta de manera significativa. Els resultats suggereixen que l’adquisició de resistència podria comprometre la virulència del bacteri. A més a més, un millor coneixement dels mecanismes de resistència pot afavorir l’emergència de noves estràtegies terapèutiques. L’objectiu principal d’aquesta memòria ha estat estudiar els mecanismes moleculars de resistència a les fluoroquinolones en aquests patògens així com el seu efecte en la virulència. RESULTATS • E. coli: Es van estudiar els mecanismes de resistència a les fluoroquinolones en dues soques: PS5, un aïllat clínic sensible, i NorE5, un mutant resistent a la norfloxacina. Es va identificar la sobreexpressió de la bomba AcrAB-TolC en NorE5 atribuïble a la sobreproducció de SoxS, originada per una mutació en el regulador SoxR. A més a més es van caracteritzar dos gens nous que pertanyen al reguló de SoxS: mdtG, que codifica per un sistema transportador, i ompN, que codifica per una porina i es coexpressa amb ydbK. • S. Typhimurium: Es va avaluar la prevalença dels mecanismes de resistència a l’àcid nalidíxic en un grup de soques clíniques de Salmonella spp. El 41.5% de les soques eren resistents amb una mutació en el gen gyrA i la sobreexpressió de bombes d’expulsió. Alternativament, es van seleccionar dues soques clíniques de S. Typhimurium (50-wt i 59-wt) sensibles a l’àcid nalidíxic per obtenir en el laboratori els corresponents mutants resistents a la ciprofloxacina (50-64 and 59-64). La soca 50-64 va adquirir 3 mutacions en el gens diana, sobreexpressava AcrAB-TolC, tenia una capacitat invasiva molt reduïda així com un creixement inferior a l’habitual. La soca 59-64 va adquirir 5 mutacions en els gens diana, sobreexpressava el regulador ramA associat a la sobreexpressió d’una bomba desconeguda, doncs tenia AcrAB inactivat per una mutació interna ja en la soca clínica original. • Y. enterocolitica: Es va seleccionar un aïllat clínic sensible a l’àcid nalidíxic per obtenir un mutant resistent a la ciprofloxacina (Y.83-64). La soca resistent va adquirir 4 mutacions en els gens diana, sobreexpressava AcrAB-TolC, atribuïble a la sobreexpressió de marAYe degut a una mutació en el promotor, i va mostrar un descens en la capacitat invasiva. Alternativament, es va avaluar l’heterogeneïtat en la selecció de mutacions en els gens diana en un mutant amb menor resistència a la ciprofloxacina.

Programa de Doctorat en Medicina / Las células tumorales adquieren una serie de características adaptativas específicas, como son la autosuficiencia en señales de crecimiento, insensibilidad a las señales inhibitorias de crecimiento, evasión de la apoptosis y potencial de proliferación ilimitado. A parte de estas características, la alteración de gradientes de pH entre los espacios intra y extracelular, también se considera un patrón adaptativo celular, que se inicia desde etapas muy tempranas durante el proceso de transformación neoplásica y que se mantiene durante el proceso de carcinogénesis e incrementa en la medida en que las células tumorales se hacen más agresivas. Estas alteraciones de gradientes de pH, se caracterizan por aumento del pH intracelular y disminución del pH extracelular, condiciones que se ha demostrado ejercen un efecto permisivo para la adquisición de las características celulares antes señaladas, que favorecen la progresión maligna. Así, la alcalinización del pH intracelular promueve el aumento de la proliferación celular y la evasión de la apoptosis, mientras que la acidificación del pH extracelular crea el ambiente propicio para la degradación de matriz extracelular que favorece la agresividad, invasión y metástasis. El transporte de iones a través de la membrana plasmática es un proceso fundamental para el mantenimiento y regulación del volumen celular, balance osmótico y el pH intracelular. Tanto, los aniones como los cationes, al ser solutos con carga negativa y positiva respectivamente, no pueden difundir libremente entre los espacios intra y extracelular, por lo que su transporte debe ser mediado por proteínas especializadas transmembrana que funcionan como canales o como transportadores simporte o antiporte. En células tumorales estas proteínas transportadoras se encuentran sobreexpresadas o hiperactivadas, lo que promueve el desequilibrio en el balance normal principalmente entre, Cl-, HCO3- e H+ a nivel intra y extracelular, lo cual en consecuencia genera el desarrollo de las alteraciones en el gradiente de pH. El desarrollo de fármacos capaces de promover la disrupción del gradiente de pH característico del microambiente tumoral, constituye una prometedora estrategia terapéutica antitumoral. Estudios previos han demostrado que compuestos de origen natural como las prodigininas y tambjaminas promueven muerte celular relacionada con su capacidad de desacoplar las H+-ATPasas a nivel lisosomal y mitocondrial, lo cual promueve la alcalinización de estos compartimentos intracelulares, este efecto ha sido atribuido a la habilidad de estos compuestos como transportadores simporte H+/Cl-. En el presente trabajo de tesis doctoral, hemos estudiado una serie de compuestos sintéticos derivados de la familia de las prodigininas y tambjaminas, así como de compuestos de origen orgánico como la urea, que actúan principalmente como transportadores de aniones como el bicarbonato (HCO3-) y cloruro (Cl-), con el objetivo de determinar la relación entre su capacidad como transportadores de aniones y su efecto in vitro a nivel de procesos celulares como citotoxicidad, apoptosis y migración celular en células de cáncer escamoso de cavidad bucal. Los resultados obtenidos indican que un patrón común entre los diferentes compuestos estudiados es su capacidad como eficientes transportadores de Cl-, principalmente por un mecanismo antiporter Cl-/HCO3-. Esta propiedad les permite revertir gradientes de pH, promoviendo la alcalinización de lisosomas observado en los ensayos con la coloración vital con naranja de acridina. Esta capacidad de interferir con el pH fue correlacionada con su efecto como agentes citotóxicos, apoptóticos, inhibidores de la migración celular y como agentes sensibilizantes al efecto de fármacos antitumorales tipo bases débiles. Estos hallazgos sugirieren que el efecto de estos compuestos a nivel del pH de orgánulos intracelulares, podría ser un mecanismo esencial para ejercer su actividad citotóxica, ya que los análogos con baja o nula capacidad como transportadores de aniones fueron incapaces de inducir cambios en el pH de estos compartimentos y muerte celular. / The dysregulated cellular pH is considered an adaptive feature of most cancer cells allowing the metabolic adaptations required for cell proliferation and evasion of apoptosis, two hallmarks of malignancy. Conditions of higher intracellular pH (pHi) promotes resistance to apoptosis due to key proteins involved which remain inactive, also alter functions of proteins involved in dynamism cytoskeleton actin integrity which is considered to play a key role in the regulation of numerous apoptotic processes such as cell rounding, membrane blebbing, loss of focal adhesion, caspase activation and mitochondrial membrane permeabilization. On other hand the acidic extracellular microenvironment promotes cellular invasion and metastasis, due to the proteases involved in both processes which require acidic pH to function properly. Thus, this characteristic pH gradient of the tumor microenvironment is maintained and mediated by changes in the expression and/or activity of plasma membrane bound proteins such as proton pumps vacuolar ATPase (V-ATPase), Na+/H+ exchanger (NHE) and carbonic anhydrases (CA), which have been reported in cancer cells related with their aggressiveness, multidrug resistance and metastasis. All these proteins together facilitate cellular H+ extrusion and favors intracellular HCO-3 transport into the cells, consequently a higher pHi and lower pHe. Development of synthetic anion membrane transporters is an interesting subject, since they can substitute the specialized membrane proteins that control the transport of anions across cellular membranes. Anion transporters are small molecules able to bind anions and take them across cellular membranes through either symporter and/or antiporter mechanisms. Previous studies have shown that natural compounds such as prodiginines and tamjamines are able to trigger cellular death related to its ability to uncouple H+-ATPases pumps. Herein, we include a number of synthetic derivatives from natural compounds such as prodiginine and tambjamine family as well as organic compounds such as urea. Our results show that the common feature among these compounds is their ability as efficient transmembrane Cl- transporters, which can function as efficient Cl-/HCO3- exchangers. This property allows them to revert the altered pH gradient present in cancer cells, increasing lysosomal pH observed through acridine orange assays in living cells and we have correlated it with their ability as anion transporters, which in turn demonstrates direct association with their capability to induce cell death observed in viability assays as well as apoptosis markers activation and inhibition of cell migration. Hence, high anion transport rates decrease cell viability while compounds with complete or partial block of anion transport capability show little or no effect on the cellular processes mentioned above.