Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Papel do Imatinib na Angiogénese de Cancro da Mama Hormono-dependente Em estudos anteriores decobrimos que a progesterona é capaz de induzir a expressão do factor de crescimento A derivado das plaquetas (PDGF-A) em células humanas de cancro da mama (células MCF7). Sabendo que o PDGF tem um papel relevante na angiogénese, e que o imatinib tem como alvo o receptor de tirosina-cinase do PDGF (PDGFR), o objectivo do presente trabalho foi examinar o efeito do imatinib em células MCF7, células de músculo liso de aorta humana (HAoSMC) e células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) tratadas com progesterona. A expressão do PDGFR- fosforilado (activado) foi detectada em células MCF7 e HAoSMC, e, de forma muito ténue, em HUVEC. Os efeitos do imatinib no crescimento celular, apoptose e migração foram então analisados. Nas células MCF7 o imatinib inibiu efectivamente a formação de colónias e a viabilidade celular, avaliada por MTT. A corroborar estes resultados foram também encontrados aumentos significativos na percentagem de células apoptóticas após incubação, das células MCF7, com imatinib. Surpreendentemente, estes efeitos inibitórios foram todos aumentados pela presença de progesterona. Os ensaios de migração celular em células MCF7 também mostraram uma redução na capacidade de migração após tratamento com imatinib. Em concordância com a falta de PDGFR- activo, o imatinib não foi capaz de prevenir o crescimento, sobrevivência e migração das HUVEC. Em contraste, a viabilidade e proliferação das HAoSMC, avaliadas por MTT e BrdU respectivamente, foram inibidas pelo imatinib. Foi ainda encontrado um aumento significativo na percentagem de células HAoSMC apoptóticas após incubação com imatinib. Os ensaios de migração celular mostraram também uma redução na capacidade migratória após tratamento com o fármaco. Todos estes resultados revelam que o imatinib é capaz de afectar a sobrevivência, crescimento e migração de células MCF7 e HAoSMC. Além disso, a incubação com progesterona parece sustentar a actividade do PDGFR- , promovendo, nestas células, a acção inibitória do imatinib. Assim, este estudo indica que o imatinib pode ser um bom agente terapêutico em cancro da mama hormono-dependente e, possivelmente, contra outras patologias vasculoproliferativas, como a ateroesclerose, em que também existe um crescimento anormal de células do musculo liso. Ramo de especialização: Angiogénese / In previous studies, we found that progesterone was able to induce the expression of platelet-derived growth factor A (PDGF-A) in human breast cancer MCF7 cells. Knowing that PDGF plays a relevant role in angiogenesis, and that imatinib mesylate targets PDGF receptor tyrosine kinase activity, the aim of the present study was to examine the effects of imatinib on progesterone-treated MCF7 cells, Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) and Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). Expression of phosphorylated (activated) PDGFR- was detected in MCF7 cells and HAoSMC, but in a very low extent in HUVEC. The effects of imatinib on cell growth, apoptosis and migration were then analyzed. In MCF7 cells imatinib effectively inhibited anchorage-dependent colony formation, and cell viability as evaluated by MTT assay. Corroborating these findings, a significant increase in the percentage of apoptotic cells was observed when MCF7 cells were treated with imatinib. Surprisingly, these inhibitory effects were all enhanced by the presence of progesterone. Cell migration assays in MCF7 cells did also show a reduction in the migratory capacity after incubation with imatinib. In agreement with the lack of active PDGFR- , imatinib was unable to prevent HUVEC growth, survival or migration ability. In contrast, HAoSMC viability and proliferation were effectively inhibited by imatinib, as evaluated by MTT and BrdU assay, respectively. Supporting these findings, a significant increase in the percentage of apoptotic HAoSMC was also observed after treatment with imatinib. Cell migration assays did also show a reduction in the migratory ability after incubation with imatinib. Altogether, these facts reveal that imatinib is able to affect MCF7 and HAoSMC survival, growth and migration. Furthermore, incubation with progesterone seems to sustain PDGFR activity, prompting these cells to the inhibitory action of imatinib. Our findings indicate that imatinib might be a good therapeutic agent in progesterone-dependent breast cancer and, possibly, against other vascular-associated disorders, such as atherosclerosis, that carry in common smooth muscle cells abnormal growth.

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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Os oncocitomas renais são constituídos por células cujo citoplasma contém numerosas mitocôndrias, morfológica e bioquimicamente anormais (células oxifílicas, oncocíticas ou células de Hürthle). Tumores com fenótipo oncocítico, condicionado pela acumulação de mitocôndrias, podem ocorrer em diversos órgãos, preferencialmente em tecidos com baixo índice proliferativo. Na tireóide, onde são denominados tumores de células de Hürthle, foram identificadas alterações do ADN mitocondrial (mtDNA) e de um gene nuclear que codifica uma proteína mitocondrial (GRIM-19), com diferenças significativas em comparação com tumores não oncocíticos. Nos oncocitomas renais não há, até à data, estudos que descrevam a ocorrência destas alterações. A acumulação de mitocôndrias no citoplasma das células pode ser consequência de uma alteração primária no mtDNA que codifica enzimas mitocondriais, ou provocada por mutações no ADN nuclear (nDNA) que codifica proteínas mitocondriais. Na tentativa de perceber melhor a tumorigénese dos tumores oncocíticos em geral e dos oncocitomas renais em particular, estudámos uma série de 14 oncocitomas renais e o parênquima renal não neoplásico adjacente, no que diz respeito a algumas alterações do mtDNA e do nDNA. Foi efectuada a reavaliação do material anátomopatológico e fez-se extracção de ADN dos tecidos obtidos após microdissecção do material incluído em parafina. Foram pesquisadas alterações do mtDNA como a delecção comum, mutações na região D-loop e nas subunidades 6 e 8 do complexo V (ATPase). As alterações do GRIM-19 foram avaliadas por estudo imuno-histoquímico. A delecção comum foi detectada em 78,6% dos oncocitomas renais e em 50% dos casos também no parênquima não neoplásico. Verificou-se instabilidade na região não codificadora D-loop em 42,9% dos tumores. Foram identificadas mutações somáticas da ATPase 6 e/ou 8 em 14,3% dos casos. A expressão de GRIM-19 nos oncocitomas renais foi discretamente menos intensa do que a observada nas células dos túbulos proximais adjacentes. As alterações encontradas no mtDNA de oncocitomas renais não se afastam substancialmente das observadas anteriormente no estudo de tumores de células de Hürthle da tireóide, tanto no que diz respeito ao tipo de alterações, como à sua frequência. Estudo das alterações do ADN mitocondrial e do GRIM-19 em oncocitomas renais: Comparação com os tumores de células de Hürthle da tireóide 2 A homogeneidade celular fenotípica dos oncocitomas renais e a notável transformação oncocítica observada no parênquima renal não neoplásico na maioria (12/14) dos casos estudados leva a presumir que o evento carcinogénico deverá ter ocorrido numa célula com anomalia prévia do mtDNA ou do nDNA que codifica enzimas mitocondriais. Esta hipótese é favorecida pela existência da delecção comum no parênquima renal não neoplásico numa maior percentagem de casos (50%) que a observada no parênquima não neoplásico tireoideu nos casos de tumores de células de Hürthle (25-33%). É possível que a delecção comum seja um marcador das alterações que ocorrem na biogénese mitocondrial nestas condições. As mutações na ATPase 6 parecem ocorrer preferencialmente nos tumores de células oxifílicas, pelo menos do rim e da tireóide. Os nossos resultados não favorecem a existência de um papel determinante para a instabilidade na região não codificadora D-loop na transformação oncocítica, apesar dessa alteração estar presente em 42,9% dos tumores. É provável que as mutações na região D-loop resultem, sobretudo, da produção aumentada de espécies reactivas de oxigénio pelas células tumorais em geral. A função principal do GRIM-19 na tumorigénese renal não parece estar relacionada com a cadeia respiratória mitocondrial, ou pelo menos, não parece estar relacionada com o fenótipo oncocítico, uma vez que a expressão de GRIM-19 está significativamente mais afectada nos carcinomas de células renais que nos oncocitomas. / Renal oncocytomas are composed by cells whose cytoplasm is packed with an abnormally high mumber of biochemically and morphologically deficient mitochondria (oxyphilic, oncocytic or Hürthle cells). Tumours with an oncocytic fenotype, resulting from mitochondria accumulation, may occur in many organs, predominantly in tissues with low proliferation index. In the thyroid, where they are called Hürthle cell tumours, our group has identified alterations in the mitochondrial DNA (mtDNA) and in a nuclear gene that encodes for a mitochondrial protein (GRIM-19), with significant differences when compared to non-oncocytic tumours. Regarding renal oncocytomas there are no publications describing the occurrence of such alterations. The mitochondria accumulation in the cytoplasm of cells may be the result of a primary alteration in mtDNA that encodes for mitochondrial enzymes, or it can be a consequence of mutations in nuclear DNA (nDNA) that encodes for mitochondrial proteins. In an attempt to contribute to a better understanding of the tumourigenesis of oxyphilic cell tumours in general and of renal oncocytomas in particular, we studied 14 renal oncocytomas and the respective non neoplastic parenchyma regarding some mtDNA and nDNA alterations. The cases were reviewed and DNA extraction was performed in microdissected tissues obtained from the paraffin-embedded material. We searched for mtDNA alterations such as the common deletion, mutations in the D-loop non codifying region and in the subunits 6 and 8 of complex V (ATPase). GRIM-19 alterations were evaluated by immunohistochemistry. The mtDNA common deletion was detected in 78.6% of renal oncocytomas and in 50% of the cases in the respective non neoplastic parenchyma. Instability in the Dloop region was detected in 42.9% of the tumours. We identified somatic mutations in ATPase 6 and/or 8 in 14,3% of the cases. GRIM-19 expression was slightly less intense in the oncocytomas than in the adjacent proximal renal tubules. Our results do not differ substantially from those obtained in Hürthle cell tumours of the thyroid, namely in the kind of alteration and its relative frequency. The homogenous cellular fenotype of renal oncocytomas and the obvious oncocytic transformation observed in the non neoplastic renal parenchyma in most of the studied cases (12/14) indicates that the carcinogenic event must have occurred in a Estudo das alterações do ADN mitocondrial e do GRIM-19 em oncocitomas renais: Comparação com os tumores de células de Hürthle da tireóide 4 cell with a previous anomaly of mtDNA and/or nDNA that encodes for mitochondrial enzymes. This hypothesis is favoured by the presence of the common deletion in a higher percentage of the non-neoplastic parenchyma of oncocytomas (50%) than in nonneoplastic thyroid parenchyma in the cases of Hürthle cell tumours (25-33%). It is possible that the common deletion may be an indirect biomarker of the alterations occurring in mitochondrial biogenesis in these conditions. Mutations in ATPase 6 seem to occur predominantly in oxiphylic cell tumours, at least in kidney and thyroid. Our results do not favour the existence of a determinant role for the instability of the non codifying D-loop region in the oncocytic transformation, despite finding such alterations in 42.9% of the tumours. It is probable that mutations in the D-loop region are mainly the result of increased reactive oxygen species production by tumoural cells in general. The main role of GRIM-19 in renal tumourigenesis does not seem to be related to the mitochondrial respiratory chain, or at least, does not seem to be related with oncocytic features, since the expression of GRIM-19 is significantly more affected in renal cell carcinomas than in oncocytomas.

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Mestrado Integrado em Medicina / Master Degree in Medicine

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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / CONTRIBUIÇÃO PARA O ESTUDO DA BIOPATOLOGIA DOS ADENOCARCINOMAS CUTÂNEOS EM CANÍDEOS Ana Laura da Silva Santos Saraiva Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular RESUMO Os adenocarcinomas cutâneos são tumores relativamente raros em canídeos, estando porém inseridos num grande grupo de neoplasias, com uma expressão bastante significativa na patologia veterinária os tumores epiteliais com diferenciação anexal. Alguns autores fundamentam a reduzida incidência dos adenocarcinomas cutâneos no seu sub-diagnóstico. Assim sendo, uma caracterização mais precisa poderá ajudar no diagnóstico mais exacto e melhor fundamentado destas lesões. Tendo em vista este objectivo, foram analisados 31 tumores malignos com diferenciação glandular, em canídeos: 8 tumores malignos das glândulas apócrinas, 6 tumores malignos das glândulas ceruminosas, 7 carcinomas sebáceos e 10 carcinomas das glândulas perianais hepatóides. Na série em estudo, e sempre que possível, foram analisados alguns parâmetros clínicos tais como o sexo, a idade e a raça dos animais, assim como o tamanho, a localização e a evolução das lesões. Foram utilizados métodos histoquímicos e imuno-histoquímicos (citoqueratinas AE1/AE3 e 14, vimentina, p63, Ki-67) para a caracterização dos tumores. Através da análise dos resultados obtidos, verificámos que nenhuma raça demonstrou propensão para qualquer um dos tipos de tumores estudados. Os animais afectados tinham geralmente uma idade avançada, com médias entre os 8 e os 12 anos. Notou-se igualmente uma tendência sexual para os machos. A evolução das lesões foi por norma favorável, já que em nenhum caso se verificou metastização à distância, mesmo quando se observou invasão vascular, e raras foram as recidivas locais das lesões. A análise histopatológica dos adenocarcinomas cutâneos permitiu uma caracterização mais cuidada dos vários grupos de tumores, tendo-se verificado uma tendência para a invasão da epiderme, ulceração, necrose e infiltração inflamatória mononuclear. O estudo imuno-histoquímico permitiu reconhecer a CK14, a p63 e a calponina como marcadores moleculares úteis no diagnóstico e caracterização destes tumores. O índice de proliferação dos carcinomas cutâneos com diferenciação glandular foi determinado pelo uso do anticorpo anti-Ki-67, tendo-se revelado uma técnica sensível e com perspectivas de poder ser utilizada no estabelecimento do comportamento biológico dos adenocarcinomas cutâneos. / CONTRIBUTION FOR THE STUDY OF THE BIOPATHOLOGY OF CANINE CUTANEOUS ADENOCARCINOMAS Ana Laura da Silva Santos Saraiva Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular ABSTRACT The cutaneous adenocarcinomas are included in the wide group of the epithelial tumours with adnexal differentiation which, although relatively rare in dogs, are of importance in veterinary pathology. Some authors suggest that the small incidence of the cutaneous adenocarcinomas is due to their non- or misdiagnosis. Therefore, a more precise characterization of these tumours will be of help for a better diagnostic of these lesions. We analysed 31 malignant tumours with glandular differentiation, in dogs: 8 apocrine malignant tumours, 6 ceruminous malignant tumours, 7 sebaceous carcinomas and 10 hepatoid gland carcinomas. In our study sample, and whenever possible, we analysed several clinical parameters, namely the sex, age and breed of the animals, and size, position and evolution of the lesions. We also used histochemistry and immuno-histochemestry (cytokeratins AE1/AE3 and 14, vimentin, p63, calponin and Ki-67) to further characterize the tumours under study. Our results showed that the incidence of the studied tumours did not relate to the breed, was higher in older animals (8-12 years) and affected males more than females. The clinical evolution of the lesions was normally favourable as no distant metastases were observed, even when vascular invasion was present. Also, local recurrence was rare. Our histopathological analysis revealed that these tumours had a tendency for epidermis invasion, ulceration, necrosis and mononuclear inflammatory infiltration. By immuno-histochemistry we showed that CK14, p63 and calponin can be used as molecular markers for the diagnosis and characterization of the cutaneous adenocarcinomas. We determined the proliferation index of the various tumours using a specific antibody anti-Ki-67 and showed that this is indeed an accurate technique that can be used in future to further characterize the biological behaviour of the cutaneous glandular carcinomas.

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