Introdução: O Meduloblastoma (MB) é o tumor sólido maligno mais comum do sistema nervoso central em crianças. Corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos, surge no cerebelo e sua origem é embrionária, sendo altamente invasivo. Como tratamento padrão usa-se a ressecção cirúrgica do tumor, quimioterapia e radioterapia crânio-espinhal; porém, a taxa de sobrevida livre de eventos (SLE) em cinco anos para os pacientes de baixo risco é de aproximadamente 70% e a maioria dos pacientes que sobrevivem sofre de efeitos secundários a longo prazo. Portanto, crescem as buscas por novos tratamentos que apresentem menores efeitos colaterais ou que diminuam/eliminem a necessidade de radiação. Vários fatores contribuem para o desenvolvimento e progressão da doença, entre eles, a regulação da expressão gênica por microRNAs (miRNAs). Essas moléculas regulam diversos processos biológicos, exercendo regulação gênica negativa a nível pós-transcricional; no entanto, seu papel em MB ainda é pouco explorado. Objetivo: Avaliar o perfil de expressão de miRNAs diferencialmente expressos em amostras de pacientes portadores de MB e correlacionar seus níveis de expressão com características clínicas dos pacientes, assim como identificar possíveis marcadores de prognóstico. Metodologia: Foram selecionados 15 miRNAs a partir de dados prévios obtidos pela técnica de microarranjo. Foi realizada a expressão desses miRNAs por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e feita a comparação com as características clínicas, utilizando amostras de pacientes portadores de MB adultos e pediátricos (N=51) e amostras de cerebelos não neoplásicos fetais (N=10) e não fetais (N=7). A comparação entre os grupos foi feita por teste de Mann-Whitney e a análise de sobrevida livre de eventos (SLE) e sobrevida global (SG) por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. A análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para avaliação dos fatores prognósticos. Resultados: Os miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485-5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais e não fetais; o miR-31-5p está hipoexpresso e o miR-199a-5p está hiperexpresso nos tumores em relação ao cerebelos não fetais; o miR-202-3p e o miR-650 estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais. Além disso, os miRNAsmiR-199a-5p e -329 estãoshipoexpressos em pacientes menores que 3 anos, com relação aos maiores de 3 anos; os miRNAs miR-202-3p, -329, -491-4p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes que tiveram grau de ressecção completo do tumor, em comparação aos que tiveram grau incompleto; e os miRNAs miR-202-3p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes classificados como baixo risco em comparação aos classificados como alto risco. Adicionalmente, o miR-211-5p está hipoexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos; e o miR-512-3p está hiperexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos. Expressão do miR-211-5p foi fator prognóstico independente para SLE quando analisada com as variáveis expressão do miR-512-3p e grupo de risco por modelo de regressão de Cox. Conclusão: É possível observar um padrão diferencial de expressão desses miRNAs no MB, podendo ser biomarcadores importantes para esta doença. Estudos futuros serão realizados para investigar o papel desses miRNAs na progressão desse tumor. / Introduction: Medulloblastoma (MB) is the most common malignant solid tumor of the central nervous system in children,and it arises in the cerebellum with an embrionary origin. MB corresponds to approximately 20% of all pediatric intracranial tumors, and it is highly invasive. The standard treatment relies on tumor surgical resection, chemotherapy and craniospinal radiotherapy; however, the five years event-free survival for low-risk patients is approximately 70%, and most survival patients suffer from long-term side effects. Thus, the search for new treatments with fewer side effects or aiming to reduce/eliminate radiation is of great interest. Several factors contribute to the development and progression of this disease, among them the regulation of gene expression by microRNAs (miRNAs). These molecules regulate diverse biological processes, exerting negative regulation in gene expression at posttranscriptional level, however its role in MB is still poorly explored. Objective: Evaluate the profile of differentially expressed miRNAs in MB samples, correlate their expression levels with patients clinical features, and identify potential prognostic markers. Material and methods: 15 miRNAs were selected based on previous data obtained from a large-scale gene expression analysis using the microarray assay. It was performed their expression and compared with the clinical features of the patients by RT-qPCR. For this, it was used pediatric and adult patients samples (n=51) diagnosed with MB and non-neoplastic fetal (n=10) and non fetal (n=7) cerebellum samples. The comparison between groups was performed by Mann-Whitney test and event-free survival (EFS) analysis and overall survival (OS) by Kaplan-Meier and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to evaluate the prognostic factors. Results: The miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485- 5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p are downregulated in tumors when compared to fetal and nonfetal cerebellum; miR-31-5p is downregulated and miR-199a-5p is upregulated only in tumors compared to non-fetal cerebellum; miR-202-3p and miR-650 are downregulated in tumors only when compared to fetal cerebellum. In addition, miR-199a-5p and miR-329 are downregulated in patients under 3 years old compared to those who are higher than 3 year; miR-202-3p,miR-329, miR-491-5p and miR-512-3p are downregulated in patients who had complete tumor resection compared to those who had incomplete tumor resection; and miR- 202-3p and miR-512-3p are downregulated in low risk patients compared to high risk patients. In addition, miR-211-5p is downregulated and miR-512-3p is upregulated in patients with a poorer event-free survival and overall survival. The expression of miR-211-5p was an independent prognostic factor for EFS when analyzed with the variables miR-512-3p expression and risk group by Cox regression model Conclusion: It is possible to observe a differential pattern of expression of these miRNAs in MB and they may be important biomarkers for this disease. Further studies will be conducted to investigate the role of these miRNAs in the progression of this tumor.

Introdução: O Meduloblastoma (MB) é o tumor sólido maligno mais comum do sistema nervoso central em crianças. Corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos, surge no cerebelo e sua origem é embrionária, sendo altamente invasivo. Como tratamento padrão usa-se a ressecção cirúrgica do tumor, quimioterapia e radioterapia crânio-espinhal; porém, a taxa de sobrevida livre de eventos (SLE) em cinco anos para os pacientes de baixo risco é de aproximadamente 70% e a maioria dos pacientes que sobrevivem sofre de efeitos secundários a longo prazo. Portanto, crescem as buscas por novos tratamentos que apresentem menores efeitos colaterais ou que diminuam/eliminem a necessidade de radiação. Vários fatores contribuem para o desenvolvimento e progressão da doença, entre eles, a regulação da expressão gênica por microRNAs (miRNAs). Essas moléculas regulam diversos processos biológicos, exercendo regulação gênica negativa a nível pós-transcricional; no entanto, seu papel em MB ainda é pouco explorado. Objetivo: Avaliar o perfil de expressão de miRNAs diferencialmente expressos em amostras de pacientes portadores de MB e correlacionar seus níveis de expressão com características clínicas dos pacientes, assim como identificar possíveis marcadores de prognóstico. Metodologia: Foram selecionados 15 miRNAs a partir de dados prévios obtidos pela técnica de microarranjo. Foi realizada a expressão desses miRNAs por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e feita a comparação com as características clínicas, utilizando amostras de pacientes portadores de MB adultos e pediátricos (N=51) e amostras de cerebelos não neoplásicos fetais (N=10) e não fetais (N=7). A comparação entre os grupos foi feita por teste de Mann-Whitney e a análise de sobrevida livre de eventos (SLE) e sobrevida global (SG) por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. A análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para avaliação dos fatores prognósticos. Resultados: Os miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485-5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais e não fetais; o miR-31-5p está hipoexpresso e o miR-199a-5p está hiperexpresso nos tumores em relação ao cerebelos não fetais; o miR-202-3p e o miR-650 estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais. Além disso, os miRNAsmiR-199a-5p e -329 estãoshipoexpressos em pacientes menores que 3 anos, com relação aos maiores de 3 anos; os miRNAs miR-202-3p, -329, -491-4p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes que tiveram grau de ressecção completo do tumor, em comparação aos que tiveram grau incompleto; e os miRNAs miR-202-3p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes classificados como baixo risco em comparação aos classificados como alto risco. Adicionalmente, o miR-211-5p está hipoexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos; e o miR-512-3p está hiperexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos. Expressão do miR-211-5p foi fator prognóstico independente para SLE quando analisada com as variáveis expressão do miR-512-3p e grupo de risco por modelo de regressão de Cox. Conclusão: É possível observar um padrão diferencial de expressão desses miRNAs no MB, podendo ser biomarcadores importantes para esta doença. Estudos futuros serão realizados para investigar o papel desses miRNAs na progressão desse tumor. / Introduction: Medulloblastoma (MB) is the most common malignant solid tumor of the central nervous system in children,and it arises in the cerebellum with an embrionary origin. MB corresponds to approximately 20% of all pediatric intracranial tumors, and it is highly invasive. The standard treatment relies on tumor surgical resection, chemotherapy and craniospinal radiotherapy; however, the five years event-free survival for low-risk patients is approximately 70%, and most survival patients suffer from long-term side effects. Thus, the search for new treatments with fewer side effects or aiming to reduce/eliminate radiation is of great interest. Several factors contribute to the development and progression of this disease, among them the regulation of gene expression by microRNAs (miRNAs). These molecules regulate diverse biological processes, exerting negative regulation in gene expression at posttranscriptional level, however its role in MB is still poorly explored. Objective: Evaluate the profile of differentially expressed miRNAs in MB samples, correlate their expression levels with patients clinical features, and identify potential prognostic markers. Material and methods: 15 miRNAs were selected based on previous data obtained from a large-scale gene expression analysis using the microarray assay. It was performed their expression and compared with the clinical features of the patients by RT-qPCR. For this, it was used pediatric and adult patients samples (n=51) diagnosed with MB and non-neoplastic fetal (n=10) and non fetal (n=7) cerebellum samples. The comparison between groups was performed by Mann-Whitney test and event-free survival (EFS) analysis and overall survival (OS) by Kaplan-Meier and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to evaluate the prognostic factors. Results: The miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485- 5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p are downregulated in tumors when compared to fetal and nonfetal cerebellum; miR-31-5p is downregulated and miR-199a-5p is upregulated only in tumors compared to non-fetal cerebellum; miR-202-3p and miR-650 are downregulated in tumors only when compared to fetal cerebellum. In addition, miR-199a-5p and miR-329 are downregulated in patients under 3 years old compared to those who are higher than 3 year; miR-202-3p,miR-329, miR-491-5p and miR-512-3p are downregulated in patients who had complete tumor resection compared to those who had incomplete tumor resection; and miR- 202-3p and miR-512-3p are downregulated in low risk patients compared to high risk patients. In addition, miR-211-5p is downregulated and miR-512-3p is upregulated in patients with a poorer event-free survival and overall survival. The expression of miR-211-5p was an independent prognostic factor for EFS when analyzed with the variables miR-512-3p expression and risk group by Cox regression model Conclusion: It is possible to observe a differential pattern of expression of these miRNAs in MB and they may be important biomarkers for this disease. Further studies will be conducted to investigate the role of these miRNAs in the progression of this tumor.

O meduloblastoma (MB) é um câncer do sistema nervoso central, de origem embrionária, que surge no cerebelo. É o tumor maligno cerebral mais frequente na infância e corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos. Atualmente, o tratamento é realizado com cirurgia, quimioterapia e radioterapia e está relacionado com diversos efeitos colaterais em médio e longo prazo. Diversos fatores contribuem para o seu desenvolvimento e progressão, entre estes, alterações nas vias de sinalização, como a Sonic Hedgehog (SHH) e Wingless. As modificações nos padrões epigenéticos, como a metilação do DNA, tem também um papel central na biologia deste tumor. Tais alterações comprometem funções básicas da célula como o controle da proliferação, sobrevivência celular e apoptose. Drogas epigenéticas como os inibidores de DNA metiltransferases (DNMTs) têm demonstrado efeitos antineoplásicos e resultados promissores para terapia do câncer. A Zebularina é um inibidor de DNMTs, que consequentemente reduz a metilação do DNA, e tem se mostrado uma importante droga antitumoral, com baixa toxicidade e atividade adjuvante à quimioterapia em tumores quimio-resistentes. Diversos estudos têm descrito seus efeitos em diferentes tipos de neoplasias, entretanto, não há relatos da sua ação em MB. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar os potenciais efeitos antineoplásicos da Zebularina em quatro linhagens de MB pediátrico (DAOY, ONS-76, UW402 e UW473). Foi observado que o tratamento com a Zebularina promoveu inibição da proliferação celular e da capacidade clonogênica, aumentou o número de células apoptóticas e células na fase S do ciclo celular (p<0,05). Adicionalmente, o tratamento induziu um aumento na expressão proteica de p53, p21 e Bax e uma diminuição da ciclina A, Bcl-2 e Survivina. Além disso, quando combinada com o quimioterápico vincristina agiu de modo sinérgico; e de modo antagônico quando combinada com a cisplatina. Através de análises de expressão gênica em larga escala (plataforma Agilent de microarray), foi encontrada diferentes vias moduladas pela droga, incluindo a dos Receptores Toll-Like e o aumento dos genes SUFU e BATF2. Aqui, foi encontrado que a Zebularina pode modular a ativação da via SHH, reduzindo os níveis de SMO, de GLI1 e de um de seus alvos, o PTCH1; contudo sem alterar os níveis de SUFU. Confirmou-se que o gene BATF2 é induzido pela Zebularina e possui regiões ricamente metiladas. Além disso, a baixa expressão do gene BATF2 está associada à um pior prognóstico em MB. Todos esses dados sugerem que a Zebularina pode ser uma droga em potencial para o tratamento adjuvante do MB / Medulloblastoma (MB) is an embryonal cerebellum tumor. It is the most common brain malignancy in children and accounts for approximately 20% of all pediatric intracranial tumors. Currently, treatment consists of surgery, chemotherapy and radiation and is associated to medium- and long-term side effects. Several factors contribute to the development and progression of MB, for instance, alterations in signaling pathways, such as Sonic Hedgehog (SHH) and Wingless. Epigenetic changes in DNA methylation patterns also play a central role in the biology of this tumor. Such changes are able to alter basic cell functions, controlling cell proliferation, survival and apoptosis. Epigenetic drugs as DNA methyltransferases (DNMTs) inhibitors have shown anticancer effects and promising results for cancer therapy. Zebularine is a low toxicity DNMTs inhibitor that induces DNA demethylation and has been reported as an important antitumor drug with adjuvant activity to chemotherapy in chemoresistant tumors. Studies have described its effects on different types of cancer, however, there are not data concerning its action in MB. Therefore, this study aimed to analyze the potential anticancer effects of Zebularine in four pediatric MB lines (UW402, UW473, ONS- 76 and DAOY). It was observed that treatment with Zebularine promoted inhibition of cell proliferation and clonogenic capacity, increased the number of apoptosis rate and cells in S phase of the cycle (p <0.05). In addition, the treatment induced an increasing in the protein expression of p53, p21 and Bax and a decreasing in cyclin A, Survivin and Bcl-2. Also, when combined with the chemotherapeutic agent vincristine acted synergistically but resulted in antagonism when combined with cisplatin. Through large-scale gene expression analysis (Agilent microarray platform), it was found different pathways modulated by Zebularine, including the Toll-Like Receptors pathway and the overexpression of SUFU and BATF2 genes. Zebularine was able to modulate SHH pathway activation, by reducing levels of SMO, GLI1 and one of its targets, PTCH1, whereas there were no changes in SUFU levels. It was confirmed that the gene BATF2 is induced by Zebularine and contains regions richly methylated. In addition, BATF2 low expression is associated with a worse prognosis in MB. All these data suggest that Zebularine may be a potential drug for the adjuvant treatment of MB

O meduloblastoma (MB) é um câncer do sistema nervoso central, de origem embrionária, que surge no cerebelo. É o tumor maligno cerebral mais frequente na infância e corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos. Atualmente, o tratamento é realizado com cirurgia, quimioterapia e radioterapia e está relacionado com diversos efeitos colaterais em médio e longo prazo. Diversos fatores contribuem para o seu desenvolvimento e progressão, entre estes, alterações nas vias de sinalização, como a Sonic Hedgehog (SHH) e Wingless. As modificações nos padrões epigenéticos, como a metilação do DNA, tem também um papel central na biologia deste tumor. Tais alterações comprometem funções básicas da célula como o controle da proliferação, sobrevivência celular e apoptose. Drogas epigenéticas como os inibidores de DNA metiltransferases (DNMTs) têm demonstrado efeitos antineoplásicos e resultados promissores para terapia do câncer. A Zebularina é um inibidor de DNMTs, que consequentemente reduz a metilação do DNA, e tem se mostrado uma importante droga antitumoral, com baixa toxicidade e atividade adjuvante à quimioterapia em tumores quimio-resistentes. Diversos estudos têm descrito seus efeitos em diferentes tipos de neoplasias, entretanto, não há relatos da sua ação em MB. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar os potenciais efeitos antineoplásicos da Zebularina em quatro linhagens de MB pediátrico (DAOY, ONS-76, UW402 e UW473). Foi observado que o tratamento com a Zebularina promoveu inibição da proliferação celular e da capacidade clonogênica, aumentou o número de células apoptóticas e células na fase S do ciclo celular (p<0,05). Adicionalmente, o tratamento induziu um aumento na expressão proteica de p53, p21 e Bax e uma diminuição da ciclina A, Bcl-2 e Survivina. Além disso, quando combinada com o quimioterápico vincristina agiu de modo sinérgico; e de modo antagônico quando combinada com a cisplatina. Através de análises de expressão gênica em larga escala (plataforma Agilent de microarray), foi encontrada diferentes vias moduladas pela droga, incluindo a dos Receptores Toll-Like e o aumento dos genes SUFU e BATF2. Aqui, foi encontrado que a Zebularina pode modular a ativação da via SHH, reduzindo os níveis de SMO, de GLI1 e de um de seus alvos, o PTCH1; contudo sem alterar os níveis de SUFU. Confirmou-se que o gene BATF2 é induzido pela Zebularina e possui regiões ricamente metiladas. Além disso, a baixa expressão do gene BATF2 está associada à um pior prognóstico em MB. Todos esses dados sugerem que a Zebularina pode ser uma droga em potencial para o tratamento adjuvante do MB / Medulloblastoma (MB) is an embryonal cerebellum tumor. It is the most common brain malignancy in children and accounts for approximately 20% of all pediatric intracranial tumors. Currently, treatment consists of surgery, chemotherapy and radiation and is associated to medium- and long-term side effects. Several factors contribute to the development and progression of MB, for instance, alterations in signaling pathways, such as Sonic Hedgehog (SHH) and Wingless. Epigenetic changes in DNA methylation patterns also play a central role in the biology of this tumor. Such changes are able to alter basic cell functions, controlling cell proliferation, survival and apoptosis. Epigenetic drugs as DNA methyltransferases (DNMTs) inhibitors have shown anticancer effects and promising results for cancer therapy. Zebularine is a low toxicity DNMTs inhibitor that induces DNA demethylation and has been reported as an important antitumor drug with adjuvant activity to chemotherapy in chemoresistant tumors. Studies have described its effects on different types of cancer, however, there are not data concerning its action in MB. Therefore, this study aimed to analyze the potential anticancer effects of Zebularine in four pediatric MB lines (UW402, UW473, ONS- 76 and DAOY). It was observed that treatment with Zebularine promoted inhibition of cell proliferation and clonogenic capacity, increased the number of apoptosis rate and cells in S phase of the cycle (p <0.05). In addition, the treatment induced an increasing in the protein expression of p53, p21 and Bax and a decreasing in cyclin A, Survivin and Bcl-2. Also, when combined with the chemotherapeutic agent vincristine acted synergistically but resulted in antagonism when combined with cisplatin. Through large-scale gene expression analysis (Agilent microarray platform), it was found different pathways modulated by Zebularine, including the Toll-Like Receptors pathway and the overexpression of SUFU and BATF2 genes. Zebularine was able to modulate SHH pathway activation, by reducing levels of SMO, GLI1 and one of its targets, PTCH1, whereas there were no changes in SUFU levels. It was confirmed that the gene BATF2 is induced by Zebularine and contains regions richly methylated. In addition, BATF2 low expression is associated with a worse prognosis in MB. All these data suggest that Zebularine may be a potential drug for the adjuvant treatment of MB

O meduloblastoma (MB) é um tumor embrionário que se origina de alterações genéticas em vias importantes para neurôgenese do cerebelo como Sonic hedgehog (Shh) e Wingless (Wnt). Alterações específicas nessas vias permitem a classificação do MB pelo perfil de expressão e mutacional em quatro subgrupos: SHH, WNT, grupo 3 e grupo 4. A ativação dessas vias pode estar relacionada à hipermetilação de reguladores negativos. A dinâmica da hidroximetilação foi descrita durante o desenvolvimento cerebelar, mas não há relatos na literatura sobre os níveis da hidroximetilação em amostras de MB. Os principais objetivos desse trabalho foram: avaliar os níveis de expressão dos genes TETs e IDHs em MB por qPCR; investigar os níveis de hidroximetilação por meio de imuno-histoquímica e dot-blot; avaliar mutações no éxon 4 de IDH1 e IDH2 por sequenciamento; analisar a metilação e hidroximetilação em genes reguladores negativos das vias SHH, WNT, NOTCH, BMP; modular a atividade dos genes TETs por meio do ácido ascórbico e verificar sua influência funcional e epigenética. Foi observada diminuição na expressão dos genes TETs e IDHs em amostras de MB apenas em comparação com cerebelos fetais, mas não em relação aos cerebelos não-fetais. As linhagens celulares de MB apresentaram expressão diminuída em comparação aos dois grupos controles. A classificação das amostras de MB permitiu verificar uma expressão gênica subgrupo específica. A expressão de TET3 apresentou associação com status da doença; e maiores níveis de IDH2 foram associados à metástase. Não foram encontradas mutações no éxon 4 de IDH1, ou no éxon 4 de IDH2 em MB. Os níveis de hidroximetilação global estão diminuídos em amostras de MB e linhagens celulares em comparação aos cerebelos não-neoplásicos; porém não estão associados com características clínicas dos pacientes. Não foram encontrados níveis detectáveis de hidroximetilação nos genes estudados. Os efeitos do ácido ascórbico foram linhagem-específicos, não ocorreu aumento nos níveis de hidroximetilação, mas alterações na expressão do gene TET3. Em conclusão, níveis de hidroximetilação e expressão dos genes TETs e IDHs são importantes para o MB. No entanto, estudos funcionais direcionados à manipulação desses genes são necessários para elucidar suas funções nesse tumor. / Medulloblastoma (MB) is an embryonic tumor that originates from genetic alterations in pathways that are important to the neurogenesis of cerebellum, such as Sonic hedgehog (Shh) e Wingless (Wnt). These alterations allow us to classify MB based in expression and mutational profile in four subgroups: SHH, WNT, group 3 and group 4. The activation of these pathways could be related to hypermethylation of negative regulators. Hydroxymethylation dynamics was described during cerebellum development, but there are not reports in the literature about hydroxymethylation levels in MB samples. The main aims of this study were: to evaluate TET and IDH genes expression in MB using qPCR; to investigate hydroxymethylation levels using immunohistochemistry and dot-blot; to evaluate mutations in exon 4 of IDH1 and IDH2 genes through sequencing analysis; to analyze methylation and hydroxymethylation levels in genes that regulate SHH, WNT, NOTCH and BMP pathways; to modulate TET genes activity through ascorbic acid and verify its functional and epigenetic influence in MB cell lines. We observed a decrease in TET and IDH genes expression in MB samples compared to fetal cerebellum, but not according to non-fetal cerebellum. MB cell lines presented a decrease when compared to both control groups. The classification of MB samples allowed us to verify a subgroup-specific gene expression. TET3 expression was associated with disease status; and higher levels of IDH2 gene expression were associated with metastasis. We did not find mutations in exon 4 of IDH1 and exon 4 of IDH2 genes in MB samples. Hydroxymethylation levels were decreased in MB samples and cell lines when compared to non-neoplastic cerebellum; however, they were not associated with clinical characteristics of the patients. We did not detect hydroxymethylation levels in the studied genes. Ascorbic acid effects are cell linespecific: we did not observe increase in hydroxymethylation levels, but alterations in TET3 gene expression. In conclusion, hydroxymethylation and expression levels of TET and IDH genes are important for MB. Though, functional assays that target these genes are required to elucidate their function in MB.

O meduloblastoma é o tumor maligno do sistema nervoso central mais frequente na infância e adolescência. A expressão de genes tipicamente expressos em células-tronco está correlacionada com pior prognóstico em pacientes com meduloblastoma e a expressão de POU5F1 se mostrou capaz de distinguir pacientes com desfecho clínico desfavorável e pior sobrevida. Apesar do seu valor prognóstico, não há evidências diretas da contribuição de OCT4 para a aquisição de fenótipos mais agressivos em meduloblastoma. Nesse contexto, o presente trabalho investigou o papel da isoforma OCT4A em características pró-tumorigênicas de meduloblastoma in vitro e in vivo, e também avaliou as alterações moleculares que podem ser responsáveis pela aquisição de fenótipo mais agressivo em células de meduloblastoma humano. Para tanto, foi realizada a superexpressão de OCT4A mediada por retrovírus em três linhagens celulares de meduloblastoma (Daoy, D283Med e USP-13-Med). As células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A exibiram maior proliferação e alterações no ciclo celular. Foram observados também aumentos na atividade clonogênica, geração de esferas tumorais e desenvolvimento tumoral em modelo subcutâneo, sendo esses efeitos dependentes dos níveis de OCT4A. A avaliação da mobilidade celular in vitro demonstrou diminuição na adesão celular e aumento da invasão celular de esferoide 3D. Em modelo ortotópico de meduloblastoma, as células com superexpressão de OCT4A geraram tumores mais desenvolvidos, com fenótipos mais agressivos, infiltrativos e metastáticos. A superexpressão de OCT4A foi associada a maior instabilidade genômica, entretanto, as aberrações em números de cópias variaram em frequência e tipo de alteração dependendo da linhagem celular, e sendo pouco associada com os genes diferencialmente expressos. De forma interessante, uma relevante expressão diferencial de RNAs não-codificadores de proteínas foi observada em células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A, incluindo os recém descobertos e pouco caracterizados RNAs não codificadores longos, além de múltiplos RNAs pequenos nucleolares. Assim, os resultados aqui apresentados fundamentam a relevância de fatores envolvidos em pluripotência para o agravamento de traços associados com desfecho clínico desfavorável em meduloblastoma e destacam o valor prognóstico e terapêutico de OCT4A neste tumor pediátrico do sistema nervoso central / Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in infants. The expression of typical pluripotency genes is correlated with poor prognosis in medulloblastoma and POU5F1 expression was shown capable of discriminating patients with poor survival outcome. Despite this prognostic value, direct evidences of OCT4 contribution to more aggressive traits in medulloblastoma are missing. In this context, we investigated the role of OCT4A isoform on pro-tumorigenic features of medulloblastoma in vitro and in vivo and evaluated molecular alterations that could be responsible for acquisition of a more aggressive phenotype in medulloblastoma cells. Retroviral-mediated overexpression of OCT4A were performed in three medulloblastoma cell lines (Daoy, D283Med and USP-13-Med). Medulloblastoma cells overexpressing OCT4A displayed enhanced cell proliferation and cell cycle alterations. Increased clonogenic activity, tumorsphere generation capability and subcutaneous tumor development were also observed, and these effects were OCT4A expression level-dependent. Evaluation of cell mobility in vitro showed loss of cell adhesion and greater 3D-spheroid invasion. In an orthotopic model of medulloblastoma, OCT4A overexpressing cells generated more developed, aggressive, infiltrative and metastatic tumors. OCT4A overexpression was associated with chromosomal instability but copy number aberrations varied in frequency and type according to the cell line, with little association with differently expressed genes. Interestingly, marked differential expression of non-coding RNAs, including newly discovered, still poorly characterized, long non-coding RNAs and multiple small nucleolar RNAs were observed in medulloblastoma cells with OCT4A overexpression. Altogether, our findings support the relevance of pluripotency-related factors in the aggravation of medulloblastoma traits classically associated with poor clinical outcome, and underscore the prognostic and therapeutic value of OCT4A in this challenging type of pediatric brain cancer

Meduloblastoma é um câncer do sistema nervoso central, altamente invasivo, de origem embrionária, localizado no cerebelo. É mais comum em crianças e corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos. Os tratamentos mais utilizados são cirurgia e quimioterapia, sendo que a radioterapia é aplicada somente em crianças com mais de 3 anos devido aos seus efeitos colaterais. Diversos estudos têm mostrado o papel do NF-B na regulação de genes envolvidos com o processo neoplásico. NF-B é um fator de transcrição chave na regulação da resposta imune e no processo de inflamação e está envolvido na regulação da transcrição de um grande número de genes relacionados ao processo de tumorigênese, além de ser constitutivamente ativo em diversos tipos de câncer, sendo um importante potencial alvo terapêutico. O DHMEQ (Dehidroximetilepoxiquinomicina) é uma droga que inibe a translocação do NF-B do citoplasma para o núcleo, inibindo assim a sua atuação como ativador transcricional. Vários trabalhos tem mostrado os efeitos antineoplásicos do DHMEQ em inúmeros tipos tumorais, entretanto, não há trabalhos que evidenciem esses efeitos em meduloblastoma. Assim, o presente estudo objetivou avaliar os efeitos dessa droga nas linhagens UW402, UW473 e ONS-76 de meduloblastoma pediátrico através de estudos funcionais e moleculares. Os resultados de proliferação demostraram uma significativa diminuição do crescimento celular nas linhagens de meduloblastoma, inibindo cerca de 80, 70 e 60% nas linhagens UW402, UW473 e ONS-76, respectivamente, na dose de 20 g/mL, e apresentou um IC50 de 10g/mL em 48h para as linhagens UW402 e UW473 e em 72h na linhagem ONS-76. Adicionalmente, elevou o nível de apoptose para 50, 17 e 31% nessas linhagens, respectivamente, inibiu fortemente a capacidade clonogênica, a migração e a invasão celular nas três linhagens e foi sinérgico na combinação com outros quimioterápicos em grande parte dos pontos de combinação, além de radiossensibilizar fortemente as três linhagens. Os resultados são congruentes com o potencial efeito antitumoral de DHMEQ. / Medulloblastoma is a cancer of the central nervous system, highly invasive, of embryonic origin, located in the cerebellum. It is more common among children and accounts for approximately 20% of all pediatric intracranial tumors. The most common treatments are surgery and chemotherapy, and radiotherapy is only to children older than 3 years old due to its side effects. Several studies have demonstrated the role of NF-B in the regulation of genes involved in the neoplastic process. NF-B is a key transcription factor in the regulation of immune response and inflammation process, and it is involved in the transcriptional regulation of a large number of genes related to the tumorigenesis process, and constitutively active in many types of cancer, being an important potential therapeutic target. DHMEQ (Dehidroximetilepoxiquinomicina) is a drug that inhibits the translocation of NF-B from the cytoplasm to the nucleus, thus inhibiting its activity as a transcriptional activator. Several studies have shown the antineoplastic effects of DHMEQ in numerous tumor types, however, there is no surveys that have tested their effects in medulloblastoma. Thus, the present study aimed to evaluate the effects of this drug in UW402, UW473 and ONS-76 pediatric medulloblastoma cell lines through functional and molecular studies. The proliferation test results demonstrated a significant decrease in the cell growth in the medulloblastoma cell lines, inhibiting approximately 80, 70 and 60% for UW402, UW473 and ONS-76, respectively, at a dose of 20g/mL, and showed an IC50 of 10g/mL at 48h for UW402 and UW473 and at 72h in ONS-76. Additionally, increased the level of apoptosis to 50, 17 and 31% in these cell lines, respectively, strongly inhibited the clonogenic capacity, the migration and cell invasion in the three lines and it was synergistic in combination with other chemotherapeutic agents in most combination points, and radiosensitization strongly the three cell lines. The results are congruent with the potential antitumor effect of DHMEQ.

O meduloblastoma (MB) é o tumor maligno cerebral mais frequente em crianças e adolescentes. Trata-se de uma doença heterogênea sob o aspecto genético, sendo reconhecido ao menos 12 subgrupos genético-moleculares, com impacto na apresentação clínicopatológica. Pacientes do subgrupo SHH apresentam mutação somática em genes da via Hedgehog, incluindo PTCH1, SUFU, SMO e ativação dos genes GLI1 e GLI2. Mutações no gene TP53 também podem estar presentes, particularmente em crianças acima de 3 anos, e conferem um pior prognóstico. O trióxido de arsênio (ATO) possui ação inibitória sobre os genes da via SHH, mas pouco se sabe sobre sua ação no MB. O presente estudo objetivou avaliar os potenciais efeitos citotóxicos e radiossensibilizantes do ATO sobre as linhagens de MB pediátrico grupo SHH (ONS-76: TP53-selvagem; DAOY: TP53-mutado c.725G>T e UW402, TP53-mutado c.464C>A). Foram comparadas as taxas de proliferação celular, clonogenicidade e apoptose nas linhagem de MB antes e após o tratamento com ATO. Também foi avaliada a clonogenicidade da associação droga e irradiação. Foram investigadas proteínas responsáveis pelo reparo dos danos causados ao DNA (Rad51 e Ku86) através de Western Blot. Foi realizada análise da expressão gênica relativa por QPCR e estudados genes que integram a via SHH, assim como efetores finais desta via de sinalização. A viabilidade celular foi monitorada nos tempos de 24 à 120 horas pelo ensaio de resazurina. A taxa de apoptose foi mensurada por meio de marcação com anexina e iodeto de propídio e avaliada por citometria de fluxo. Os ensaios foram realizados em triplicata e analisados por One Way e Two Way ANOVA, utilizando o pós-teste Bonferroni, e sendo considerados resultados significativos valores de p<0,05. Foi possível observar uma diminuição na viabilidade celular após tratamento com ATO nas três linhagens estudadas. Além disso, houve uma diminuição significativa na capacidade clonogênica. Observou-se também um aumento nas taxas de apoptose nas linhagens, sendo acima de 70% de morte celular para a linhagem DAOY. Foi observado que o tratamento com ATO radiossensibilizou a linhagem UW402, TP53-mutado. Não foi encontrada associação com proteínas de reparo no tempo e dose estudados. O estudo de expressões relativas dos genes estudados demonstrou inibição, principalmente nas linhagens de interesse DAOY e UW402 -(SHH TP53) mutado. Estes achados in vitro apontam para um efeito citotóxico do ATO sobre as linhagens de MB pediátrico, podendo apresentar efeito radiossenssibilizante. O ATO deve ser melhor explorado como droga alvo para MB SHH+, em caráter experimental. / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in children and adolescents. It is a heterogeneous disease under the genetic aspect, with at least 12 geneticmolecular subgroups being recognized, with impact on the clinical-pathological presentation. Patients of the SHH subgroup present somatic mutation in genes of the Hedgehog pathway, including PTCH1, SUFU, SMO and activation of the genes GLI1 and GLI2. Mutations in the TP53 gene may also be present, particularly in children over 3 years, and confer a worse prognosis. The arsenic trioxide (ATO) has an inhibitory action on SHH pathway genes, but little is known about its action. The present study aimed to evaluate the potential cytotoxic and radiosensitizing effects of ATO on the pediatric MB cells of SHH group (ONS-76: TP53- wild type; DAOY: TP53-mutated c.725GT and UW402 TP53-mutated c.464C>A). Cell proliferation, clonogenicity and apoptosis were compared in the MB strains following ATO treatment. The clonogenicity assay of ATO combined with irradiation was also evaluated. We investigated proteins responsible for repairing DNA damage and performed Western blotting of the Rad51 and Ku86 proteins. Gene expression analysis was performed using the real-time PCR. Selected genes integrating the SHH pathway as well as final effectors of signaling were also assesed. Cell viability was monitored at endpoints from 24 to 120h by the resazurin assay. The rate of apoptosis was measured by labeling with annexin and propidium iodide, as assessed by flow cytometry. The assays were performed in triplicate and analyzed by One Way and Two Way ANOVA, using the Bonferroni post-test, and being considered significant results a p value less than 0.05. It was possible to observe a decrease in cell viability in the three studied strains. In addition, there was a significant decrease in clonogenic capacity. There was also an increase in the apoptosis rates in the lineages, being above 70% of cell death for the DAOY lineage. It was found that the ATO treatment radiosensitized the UW402 strain - TP53-mutated. No association with time and dose of ATO and irradiation on the repair proteins was found. The study of the relative expressions of the studied genes demonstrated inhibition, mainly in the mutant line of interest DAOY and UW-402, a SHHTP53 mutated cell-line. These in vitro findings point to a cytotoxic effect of ATO on pediatric medulloblastoma lines, with a potential radiosensitizing effect. This study offers rationale for further assesment of ATO on SHH-MB, either alone or along with radiotherapy as a preclinical drug.

INTRODUÇÃO: A combinação de radioterapia e altas doses de cisplatina no tratamento do meduloblastoma tem se mostrado causa de importante ototoxicidade. Com a introdução da técnica de intensidade modulada do feixe (IMRT), tornou-se possível diminuir a dose média de radiação no aparelho auditivo. OBJETIVOS: O objetivo é determinar se com a radioterapia com reforço de dose com IMRT, é possível atingir índices menores de perda auditiva e se há um limite de dose no ouvido para a mesma. Analisar também se o volume de ouvido contornado durante o planejamento inverso influencia o resultado. MÉTODO: Quarenta e um pacientes com meduloblastoma (idade mediana, 10 anos) com audição normal ao início da radioterapia com IMRT foram avaliados retrospectivamente. O último seguimento e a última audiometria realizada após o término da radioterapia foram considerados. A função auditiva foi graduada em uma escala de 0 a 4 de acordo com os critérios de toxicidade do Pediatric Oncology Group (POG). As doses mínima, máxima, média e mediana recebidas pelo aparelho auditivo, bem como o volume contornado no planejamento do IMRT foram correlacionados com o grau de função auditiva. Foi realizada análise univariada e multivariada dos dados. RESULTADOS: O seguimento mediano foi de 41 meses (12,8 a 71) para avaliação audiométrica e 44 meses (14-72) para a sobrevida global. As doses medianas mínima, máxima, média e mediana recebidas pelo aparelho auditivo foram respectivamente de: 3785 (589,4 a 4758,2), 4832,5 (3724 a 5447,9), 4366,5 (2808,5 a 5097,3) e 4360,5 (2878 a 5031,1). Sete pacientes (17%) apresentaram perda auditiva graus 3 e 4. A análise univariada entre as variáveis não mostrou diferença com significância estatística, exceto para a dose de cisplatina (P < 0,03). Na análise multivariada com regressão logística, a dose mediana no aparelho auditivo foi um fator significativo para a perda auditiva graus 3 e 4 (P < 0,01), ao passo que a dose cumulativa de cisplatina apresentou tendência à perda graus 3 e 4 (P = 0,075). Não houve correlação entre o volume contornado no planejamento a perda auditiva. Perda auditiva graus 3 e 4 foi incomum com dose mediana no aparelho auditivo menor que 42 Gy (P = 0,063) e dose cumulativa de cisplatina abaixo de 375 mg/m² (P < 0,01). Nenhum paciente que recebeu carboplatina em substituição à cisplatina apresentou perda auditiva grave. Não houve associação, com significância estatística, entre as variáveis analisadas e a ototoxicidade, quando estes pacientes foram excluídos da análise. Quatro pacientes morreram e dois apresentaram recidiva no momento do estudo, levando a uma sobrevida global de 90% e uma sobrevida livre de doença de 85% em 44 meses. CONCLUSÕES: Os resultados mostram que o tratamento com IMRT leva a uma baixa taxa de perda auditiva grave, mesmo com um seguimento maior, o que é consistente com outros estudos. Acreditamos ser seguro contornar somente a cóclea e que uma dose mediana para a mesma deve ser mantida abaixo de 42 Gy. A quimioterapia com cisplatina continua a ter um papel importante no tratamento, no entanto a dose cumulativa não deve exceder 375 mg/m². A sobrevida foi impressionante neste estudo, uma vez que 21 (51,2%) foram classificados como alto risco / INTRODUCTION: The combination of radiation therapy and cisplatin chemotherapy for the treatment of medulloblastoma is a known cause of important ototoxicity. With the introduction of intensity-modulated radiation therapy (IMRT), it became possible to deliver less radiation to the auditory apparatus. PURPOSE: To determine if boost radiotherapy with IMRT can achieve a lower rate of hearing loss and if theres a cutoff dose for it. Also, to analyze whether the auditory apparatus volume contoured in inverse planning influences the outcome. METHODS: Forty-one pediatric medulloblastoma patients (median age, 10 years) with normal hearing at the time of radiation with IMRT were retrospectively evaluated. The last audiogram and follow-up from the completion of radiation were considered. Hearing function was graded on a scale 0 to 4 according to Pediatric Oncology groups toxicity criteria. Minimum, maximum, mean and median doses to the inner ear and its volume contoured in IMRT planning, as well the cisplatin dose were recorded and correlated with hearing function. Univariate and multivariate data analysis were performed. RESULTS: The median follow-up was 41 months (range 12.8-71.0 months) for audiometric evaluation and 44 months (range 14-72 months) for survival. Median doses for minimum, maximum, mean and median in the inner ear were respectively: 3785 (range, 589.4 to 4758.2), 4832.5 (range 3724 to 5447.9), 4366.5 (range 2808.5 to 5097,3) and 4360,5 (range 2878 to 5031,1). Seven patients (17%) have experienced Grade 3 or 4 hearing loss. Univariate analysis showed no difference among the variables with statistical significance, except for cisplatin dose (P < 0.03). In multivariate analysis with logistic regression, median dose in inner ear was a significant factor for hearing loss grade 3 or 4 (P < 0,01), meanwhile cisplatin dose had a trend to hearing loss grade 3 or 4 (P = 0.075). There was no relationship between the auditory apparatus volume contoured in planning and hearing loss. Grade 3 or 4 hearing loss were uncommon with median dose to the inner ear bellow 42 Gy (P = 0.063) and cisplatin dose less than 375 mg/m² (P < 0.01). None of the patients who received carboplatin in lieu of cisplatin had severe hearing loss. There was no statistically significant association between ototoxicity and the variables, when these patients were excluded from the analysis. Four patients died and two have recurred at the time of the study with a 90% overall survival rate and 85% disease free survival in 44 months. CONCLUSIONS: Our findings shows that IMRT treatment leads to a low rate of serious hearing loss even with a longer follow-up, which is consistent with others trials. We believe that is safe to contour only the cochlea and that a median dose to it should be kept below 42Gy. Cisplatin chemotherapy continues to have an important role in treatment, however doses should not exceed 375 mg/m². Survival rates were impressing in this trial given the fact that 21 (51.2%) patients were classified as high risk

O meduloblastoma (MB) é o tumor maligno cerebral mais frequente em crianças e adolescentes. Trata-se de uma doença heterogênea sob o aspecto genético, sendo reconhecido ao menos 12 subgrupos genético-moleculares, com impacto na apresentação clínicopatológica. Pacientes do subgrupo SHH apresentam mutação somática em genes da via Hedgehog, incluindo PTCH1, SUFU, SMO e ativação dos genes GLI1 e GLI2. Mutações no gene TP53 também podem estar presentes, particularmente em crianças acima de 3 anos, e conferem um pior prognóstico. O trióxido de arsênio (ATO) possui ação inibitória sobre os genes da via SHH, mas pouco se sabe sobre sua ação no MB. O presente estudo objetivou avaliar os potenciais efeitos citotóxicos e radiossensibilizantes do ATO sobre as linhagens de MB pediátrico grupo SHH (ONS-76: TP53-selvagem; DAOY: TP53-mutado c.725G>T e UW402, TP53-mutado c.464C>A). Foram comparadas as taxas de proliferação celular, clonogenicidade e apoptose nas linhagem de MB antes e após o tratamento com ATO. Também foi avaliada a clonogenicidade da associação droga e irradiação. Foram investigadas proteínas responsáveis pelo reparo dos danos causados ao DNA (Rad51 e Ku86) através de Western Blot. Foi realizada análise da expressão gênica relativa por QPCR e estudados genes que integram a via SHH, assim como efetores finais desta via de sinalização. A viabilidade celular foi monitorada nos tempos de 24 à 120 horas pelo ensaio de resazurina. A taxa de apoptose foi mensurada por meio de marcação com anexina e iodeto de propídio e avaliada por citometria de fluxo. Os ensaios foram realizados em triplicata e analisados por One Way e Two Way ANOVA, utilizando o pós-teste Bonferroni, e sendo considerados resultados significativos valores de p<0,05. Foi possível observar uma diminuição na viabilidade celular após tratamento com ATO nas três linhagens estudadas. Além disso, houve uma diminuição significativa na capacidade clonogênica. Observou-se também um aumento nas taxas de apoptose nas linhagens, sendo acima de 70% de morte celular para a linhagem DAOY. Foi observado que o tratamento com ATO radiossensibilizou a linhagem UW402, TP53-mutado. Não foi encontrada associação com proteínas de reparo no tempo e dose estudados. O estudo de expressões relativas dos genes estudados demonstrou inibição, principalmente nas linhagens de interesse DAOY e UW402 -(SHH TP53) mutado. Estes achados in vitro apontam para um efeito citotóxico do ATO sobre as linhagens de MB pediátrico, podendo apresentar efeito radiossenssibilizante. O ATO deve ser melhor explorado como droga alvo para MB SHH+, em caráter experimental. / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in children and adolescents. It is a heterogeneous disease under the genetic aspect, with at least 12 geneticmolecular subgroups being recognized, with impact on the clinical-pathological presentation. Patients of the SHH subgroup present somatic mutation in genes of the Hedgehog pathway, including PTCH1, SUFU, SMO and activation of the genes GLI1 and GLI2. Mutations in the TP53 gene may also be present, particularly in children over 3 years, and confer a worse prognosis. The arsenic trioxide (ATO) has an inhibitory action on SHH pathway genes, but little is known about its action. The present study aimed to evaluate the potential cytotoxic and radiosensitizing effects of ATO on the pediatric MB cells of SHH group (ONS-76: TP53- wild type; DAOY: TP53-mutated c.725GT and UW402 TP53-mutated c.464C>A). Cell proliferation, clonogenicity and apoptosis were compared in the MB strains following ATO treatment. The clonogenicity assay of ATO combined with irradiation was also evaluated. We investigated proteins responsible for repairing DNA damage and performed Western blotting of the Rad51 and Ku86 proteins. Gene expression analysis was performed using the real-time PCR. Selected genes integrating the SHH pathway as well as final effectors of signaling were also assesed. Cell viability was monitored at endpoints from 24 to 120h by the resazurin assay. The rate of apoptosis was measured by labeling with annexin and propidium iodide, as assessed by flow cytometry. The assays were performed in triplicate and analyzed by One Way and Two Way ANOVA, using the Bonferroni post-test, and being considered significant results a p value less than 0.05. It was possible to observe a decrease in cell viability in the three studied strains. In addition, there was a significant decrease in clonogenic capacity. There was also an increase in the apoptosis rates in the lineages, being above 70% of cell death for the DAOY lineage. It was found that the ATO treatment radiosensitized the UW402 strain - TP53-mutated. No association with time and dose of ATO and irradiation on the repair proteins was found. The study of the relative expressions of the studied genes demonstrated inhibition, mainly in the mutant line of interest DAOY and UW-402, a SHHTP53 mutated cell-line. These in vitro findings point to a cytotoxic effect of ATO on pediatric medulloblastoma lines, with a potential radiosensitizing effect. This study offers rationale for further assesment of ATO on SHH-MB, either alone or along with radiotherapy as a preclinical drug.