El trasplante de membrana amniótica (TMA) ha demostrado en los últimos años ser eficaz en el tratamiento de distintas patologías de la superficie ocular. Sin embargo, los trabajos publicados recogen series cortas de pacientes y con periodos de seguimiento breves. Hemos analizado los resultados obtenidos en todos los casos intervenidos por el autor mediante TMA durante los años 1999 y 2000, incluyendo estudios histológicos tras el trasplante en algunos de los receptores.El primer trabajo analiza los resultados obtenidos con el TMA en 53 casos de patología corneal y conjuntival, utilizando distintas formas de implante y con un periodo de seguimiento medio de 32 meses (rango 24-48 meses). Tras la resección de lesiones conjuntivales extensas el injerto de membrana amniótica (MA) consiguió la epitelización completa, con mínima formación de cicatrices residuales, en el 100% de los casos. En las úlceras corneales tróficas, degeneraciones estromales cálcicas, y los defectos epiteliales el TMA se mostró como un procedimiento terapéutico eficaz y una alternativa quirúrgica útil en aquellos casos en los que el tratamiento médico fracasa. Los resultados obtenidos fueron estables durante el periodo de seguimiento realizado. En ninguno de los casos intervenidos se observaron complicaciones intraoperatorias ni postoperatorias. En el segundo trabajo se analiza la eficacia y seguridad del recubrimiento con MA en el tratamiento de los defectos epiteliales persistentes sin respuesta al tratamiento médico. El recubrimiento con MA se mostró muy eficaz cuando el implante se mantuvo en la superficie corneal durante dos o más semanas, siendo el principal problema en estos pacientes el desprendimiento precoz de la membrana. De entre los distintos tipos de implante ensayados el recubrimiento de la córnea asociado a una lente de contacto terapéutica fue el que mantuvo durante más tiempo el implante. En el tercer estudio se describen los hallazgos histológicos encontrados tras el injerto de membrana amniótica en la córnea de dos pacientes que varios meses después del TMA precisaron de un trasplante de córnea. En ambos casos la membrana amniótica consiguió una epitelización completa y de características histológicas normales y, tras su reabsorción, el espacio ocupado inicialmente por la membrana fue sustituido por un estroma neoformado de características fibróticas. En la córnea avascular no se evidenció ningún tipo de reacción inflamatoria ni de rechazo alrededor del injerto y el proceso de reabsorción fue lento, probablemente a expensas de los queratocitos activados. En presencia de neovascularización estromal y de inflamación crónica subyacente la reabsorción se produjo de manera más rápida por la abundante presencia de células inflamatorias en la zona. En el cuarto trabajo se demuestra como el injerto de MA puede conseguir la regeneración de zonas extensas de conjuntiva incluso sobre un lecho escleral severamente isquémico. / In recent years amniotic membrane transplantation (AMT) has shown to be effective in the treatment of different patologies of the ocular surface. Nevertheless, the published articles usually consist of short series of patients with brief follow-up periods. We have reviewed the results obtained in all the cases operated on by the author with AMT during the year 1999 and 2000, including histological studies after the transplantation in some of the patients.The first paper analyzes the results obtained with the AMT in 53 cases of corneal and conjuntival pathology, using different forms of implantation with a mean follow-up of 32 months (range 24-48 months). After the resection of extensive conjunctival lesions the amniotic membrane (AM) graft achieved complete epithelialization, with minimal scarring, in 100 % of the cases. In the eyes with neurotrophic corneal ulcer, calcific degeneration, and persistent epithelial defects, the AMT appears to be an effective procedure and represents an aditional therapeutic alternative when conservative medical treatments fail. The obtained results were stable during the follow-up period. No intraoperative or postoperative complications ocurred in any of the 53 cases operated.The second paper analyzes the efficacy and safety of the AM patch in the treatment of persistent epithelial defects without response to the medical treatment. The AM patch proved to be effective when the implant was maintained on the corneal surface for two or more weeks, being the main problem in these patients the early detachment of the membrane. Among the different types of implantation tested, the technic of covering the entire cornea associated with a therapeutic contact lens achieved longer duration of the AM.The third study describes the histopathologic findings in the cornea of two patients who required a corneal transplantation several months after an AM graft. In both cases a complete epithelialization was observed over the basement membrane of the AM. In the cornea with avascular stroma no inflammatory reaction or graft rejection was seen. In this case the process of reabsorption was slow, probably at the expense of the activated keratocytes. In the cornea with stromal neovascularization the AM was rapidly reabsorbed because of the presence of abundant inflammatory cells. Once reabsorbed, the AM was replaced by a new fibrotic stroma, which was different to that found in the rest of the cornea but which helped to maintain corneal thickness.The fourth paper demonstrates that AM graft can be useful even in the regeneration of conjunctiva over large areas of ischemic sclera.

En el área médico-odontológica, se han realizado diversas investigaciones en la búsqueda de sustancias naturales o sintéticas que sustituyan los tejidos perdidos del cuerpo, ya sean estos tejidos blandos o duros. La regeneración ósea guiada (ROG), se fundamenta en la utilización de sistemas de barrera mediante membranas que aíslan un determinado defecto óseo con la intención de evitar el crecimiento de tejidos con capacidad de reparación rápida, como el tejido conectivo, que interfieren con el potencial osteogénico del defecto. El presente estudio tuvo como objetivo determinar el efecto del injerto óseo humano liofilizado particulado mineralizado en combinación con la Membrana Amniótica Humana Liofilizada en la regeneración ósea en tibias de conejos. Se utilizaron 10 Conejos raza Nueva Zelanda de 6 a 9 meses de edad aproximadamente, hembras y machos en buen estado, de 3.5 Kg-4 Kg. de peso en los que se crearon defectos óseos circulares de 4mm de diámetro en la cara ventral de las tibias de los conejos. Se formaron 2 grupos, un grupo control (se colocó solamente membrana amniótica humana liofilizada) y el grupo de estudio (se colocó hueso humano liofilizado particulado mineralizado en combinación con la membrana amniótica humana liofilizada como barrera). Los animales fueron sacrificados a las 16 semanas de la cirugía, realizándose un análisis clínico e histológico de la zona donde se crearon los defectos óseos. Se concluyó que la regeneración ósea fue significativamente mayor en los defectos cubiertos con hueso humano liofilizado particulado miineralizado en combinación con la membrana amniótica humana liofilizada comparada con las muestras del grupo control en los cuales se colocó solamente membrana amniótica humana liofilizada como barrera. / In the medical-dental area, have conducted research in the search for natural or synthetic substances that replace lost body tissues, whether they are soft or hard tissues. The guided bone regeneration (GBR), is based on the use of barrier systems using membranes that isolate a particular bone defect with intent to prevent the growth of tissues with fast serviceability, as connective tissue, which interfere with the potential osteogenic defect. The present study aimed to determine the effect of human lyophilized bone graft particulate mineralized in combination with Lyophilized Human Amniotic Membrane in bone regeneration in rabbit tibias. 10 New Zealand white rabbits were used for 6 to 9 months of age, males and females in good condition, 3.5 Kg-4 Kg. Of weight in which circular bone defects of 4mm diameter were created on the ventral side of the tibiae of rabbits. Formed 2 groups, a control group (only placed lyophilized human amniotic membrane) and study group (lyophilized human bone was placed mineralized particulate in combination with lyophilized human amniotic membrane as a barrier). The animals were sacrificed at 16 weeks of surgery, performed a clinical and histological analysis of the area where the bone defects were created. It was concluded that bone regeneration was significantly higher in the defects covered with lyophilized human bone particulate miineralizado in combination with human amniotic membrane lyophilized samples compared to control group in which only lyophilized human amniotic membrane as a barrier was placed. Keywords: Guided bone regeneration, amniotic membrane, lyophilized human bone mineralized particulate.

A membrana amniótica tem se consolidado no tratamento das afecções da superfície ocular. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade e a eficácia do implante de MA eqüina, preservada em glicerina a 98%, na reparação de ceratoplastias lamelares em cães, por meio do estudo da avaliação clínica pós-operatória dos animais, do tempo de cicatrização, da reconstrução da arquitetura da córnea, da resposta inflamatória, e da composição colágena do estroma corneal no local do implante. Foram selecionados 12 cães, sem raça definida, machos ou fêmeas, divididos em quatro grupos de três, que tiveram tempos de observação distintos: 2, 7, 21 e 40 dias. Foi realizada ceratoplastia lamelar de 5 mm de diâmetro em um dos olhos de cada animal, seguida da aplicação do implante de membrana amniótica eqüina de 6 mm. Durante o período de observação, exame clínico oftalmológico foi realizado nos cães, com intervalos de 48 horas e ao final deste período, foram submetidos á eutanásia. Os olhos em estudo foram enucleados e fixados para posterior análise. Foram utilizados três métodos de coloração para o estudo histológico do tecido implantado: hematoxilina-eosina (HE), ácido periódico de Schiff (PAS) e picrossirius. Além disso, procedeu-se a imunomarcação para colágenos tipo I, III, e V, com uso de pepsina para digestão das fibras colágenas heterotípicas exposição dos epítopos. Clinicamente os implantes foram completamente epitelizados em aproximadamente 10 dias, os neovasos apresentaram involução progressiva a partir dos 20 dias de pós-operatório, estando ausentes ao final dos 40 dias de observação, restando apenas uma nébula no local da lesão. À microscopia óptica, observou-se resposta inflamatória moderada, presença de epitélio pavimentoso estratificado aos sete dias e epitelização completa aos 21 dias. Aos 40 dias a membrana basal do epitélio apresentou-se reconstituída. O colágeno tipo I teve sua expressão no estroma intensificada aos 21 dias de pós- operatório. O colágeno tipo III está presente na membrana amniótica, sua a ausência no local do implante, aos 21 dias, mostrou remodelamento do tecido implantado. O colágeno tipo V, presente no estroma da córnea, teve sua expressão aumentada aos 7 e 21 dias, retornando à distribuição normal aos 40 dias de pós-operatório. Assim concluí-se que: a membrana amniótica eqüina é viável como implante em córnea de cão, sendo incorporada ao estroma, resultando em restabelecimento parcial da transparência no local de implante; o colágeno do tecido implantado é remodelado e substituído já aos 21 dias de pós-operatório; a pepsina foi eficiente na digestão das fibras e exposição dos epítopos dos colágenos nas fibras heterotípicas / The amniotic membrane has consecrated itself in the treatment of ocular surface diseases. The objective of this study was to evaluate the efficiency and viability of the equine amniotic membrane graft, preserved in glycerin at 98%, in the lamellar keroplasty recovery in dogs. Evaluation was based on clinical post-surgical exam, healing time, corneal architectural reconstruction, inflammatory response and collagen composition of the corneal stroma at the graft site. Twelve mixed-breed, male and female dogs were divided into four groups of three dogs. Each group was submitted to different observation periods of 2, 7, 21 and 40 days. Each dog was submitted to a 5 mm lamellar keratoplasty in one eye, followed by a 6 mm equine amniotic membrane graft. Each animal was submitted to clinical ophthalmologic exam every 48 hours. At the end of the evaluation period, the animal was euthanized and the grafted eye was removed and fixated for posterior analysis. For the histological study of the tissue graft, three methods of coloration were used: hematoxylin eosin (HE), periodic acid of Schiff (PAS) and picrosirius. Immunolocalization for the collagen types I, III and V using pepsin for fiber digestion of heterotypic fibrils and epitope exposure, was made. Clinically, the grafts were completely epithelized in approximately 10 days and neovascularization regressed progressively 20 days after surgery, being completely absent after 40 days, when only a nebula remained at the graft site. Optic microscopy revealed mild inflammatory response and presence of stratified pavement epithelium after 7 days and complete epithelization 21 days after surgery. At the end of 40 days the basal membrane was reconstituted. Type I collagen had its expression in the stroma intensified 21 days after the surgery. By day 21 the absence of collagen III in the corneal stroma showed graft remodeling, since this was formerly present in the amniotic membrane. The expression of type V fiber in the corneal stroma showed a mildly intensified expression at 7 and 21 days of observation, but returned to its normal distribution 40 days after surgery. Conclusion was that the equine amniotic membrane is a viable graft for the dog\'s cornea as it is incorporated to the stroma, resulting in partial transparency at the site of the graft. Twenty-one days after surgery, collagen from the graft is already remodeled and substituted. Pepsin is efficient for fiber digestion and collagen epitope exposure in heterotypical fibers.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-14Bitstream added on 2014-06-13T20:36:41Z : No. of bitstreams: 1 lima_gmg_me_sjc.pdf: 1308761 bytes, checksum: 875892b788a8646e4697b66e3953bb98 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A presente dissertação objetivou a análise dos efeitos da membrana amniótica homógena associada ao laser arseneto de gálio-alumínio sobre a mucosite oral induzida em ratos sob uso do quimioterápico 5-fluoruracila (5-FU). Foram estudados 100 ratos Wistar, divididos em 5 grupos (20 ratos cada grupo); sendo um grupo controle, um grupo tratado com 5- fluoruracila, grupo tratado com 5-FU+membrana amniótica homógena (MAH), grupo 5-FU+laser arseneto de gálio-alumínio, grupo 5- FU+MAH+laser arseneto de gálio-alumínio.Cada grupo foi subdividido em 4 para sacrifício e obtenção dos cortes histológicos, sendo analisados os períodos de 3, 7, 14 e 21 dias após indução da mucosite. Os cortes histológicos foram corados com hematoxilina-eosina para a análise histomorfológica e histomorfométrica. Para a análise imunohistoquímica foi usado o método indireto com sistema de amplificação (Peroxidase, Biotina e Estreptavidina) e as lâminas foram incubadas nos anticorpos primários anti-rato: CD-4, CD-8, VEGF e PCNA e anticorpo secundário LSAB+Sys-HRP. A contra coloração foi feita com Hematoxilina de Mayer. As células imunomarcadas foram contadas na região mediana da lâmina própria, em uma área de aproximadamente 2.41 mm2, usando o programa Axiovision 4.7. Os resultados da histomorfometria foram avaliados de forma descritiva, enquanto para a análise imunohistoquímica usou-se análise de variância (One Way ANOVA) e ao teste de Tukey (GraphPad Prisma 5 for Windows , GraphPad Software, San Diego, California, USA). O nível de significância adotada foi de p< 0.05. Concluiu-se que a MAH apresentou biocompatibilidade, acelerando o processo de reparação das mucosites e que a laserterapia teve efeito antiinflamatório, principalmente nas fases iniciais da mucosite / The objective of this dissertation was to analise the effects of association between amniotic homogen membrane (AHM) and gallium-aluminum arsenide laser on 5-fluoruracil (5-FU) induced oral mucositis healing process in rats. 100 Wistar rats were divided in 5 groups (20 rats each group): control group, group 5-FU (treated with 5- fluoruracil), 5FU+AHM group (trated with 5-FU+AHM), Laser group (treated wuith 5-FU+laser) and 5-FU+MAH+Laser group (trated with 5FU+AHM+laser). Each group were subdivided in fourth according to sacrifice period (3, 7, 14 and 21 days), after mucositis induction. Histological slices were stained with hematoxilin-eosine for histomological analisis. For immunohistochemical and histomorfometric analisis, the indirect method with amplification system (Peroxidase, Biotin and Streptavidin) were used and glasses were incubated with anti-rat antibodies CD-4, CD-8, VEGF and PCNA and secondary antibody LSAB+Sys-HRP. Mayer Hematoxilin was used as couterstain and immunostained cells were counted on middle region of lamina propria, with 2.41 mm2 using Axiovision 4.7 Imaging System. Histomorfometry results were decribed and immunohistochemistry were analised with ANOVA one-way and Tukey test (GraphPad Prisma 5 for Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, USA). Significance level was p< 0.05. AHM presented biocompatibility acelerating mucositis healing process and lasertherapy had anti-inflamatory effect, specially on begining phases of healing process

Orientador: Mônica Fernandes Gomes / Banca: Karem Lopes Ortega / Banca: Ana Sueli Rodrigues Cavalcante / Resumo: A presente dissertação objetivou a análise dos efeitos da membrana amniótica homógena associada ao laser arseneto de gálio-alumínio sobre a mucosite oral induzida em ratos sob uso do quimioterápico 5-fluoruracila (5-FU). Foram estudados 100 ratos Wistar, divididos em 5 grupos (20 ratos cada grupo); sendo um grupo controle, um grupo tratado com 5- fluoruracila, grupo tratado com 5-FU+membrana amniótica homógena (MAH), grupo 5-FU+laser arseneto de gálio-alumínio, grupo 5- FU+MAH+laser arseneto de gálio-alumínio.Cada grupo foi subdividido em 4 para sacrifício e obtenção dos cortes histológicos, sendo analisados os períodos de 3, 7, 14 e 21 dias após indução da mucosite. Os cortes histológicos foram corados com hematoxilina-eosina para a análise histomorfológica e histomorfométrica. Para a análise imunohistoquímica foi usado o método indireto com sistema de amplificação (Peroxidase, Biotina e Estreptavidina) e as lâminas foram incubadas nos anticorpos primários anti-rato: CD-4, CD-8, VEGF e PCNA e anticorpo secundário LSAB+Sys-HRP. A contra coloração foi feita com Hematoxilina de Mayer. As células imunomarcadas foram contadas na região mediana da lâmina própria, em uma área de aproximadamente 2.41 mm2, usando o programa Axiovision 4.7. Os resultados da histomorfometria foram avaliados de forma descritiva, enquanto para a análise imunohistoquímica usou-se análise de variância (One Way ANOVA) e ao teste de Tukey (GraphPad Prisma 5 for Windows , GraphPad Software, San Diego, California, USA). O nível de significância adotada foi de p< 0.05. Concluiu-se que a MAH apresentou biocompatibilidade, acelerando o processo de reparação das mucosites e que a laserterapia teve efeito antiinflamatório, principalmente nas fases iniciais da mucosite / Abstract: The objective of this dissertation was to analise the effects of association between amniotic homogen membrane (AHM) and gallium-aluminum arsenide laser on 5-fluoruracil (5-FU) induced oral mucositis healing process in rats. 100 Wistar rats were divided in 5 groups (20 rats each group): control group, group 5-FU (treated with 5- fluoruracil), 5FU+AHM group (trated with 5-FU+AHM), Laser group (treated wuith 5-FU+laser) and 5-FU+MAH+Laser group (trated with 5FU+AHM+laser). Each group were subdivided in fourth according to sacrifice period (3, 7, 14 and 21 days), after mucositis induction. Histological slices were stained with hematoxilin-eosine for histomological analisis. For immunohistochemical and histomorfometric analisis, the indirect method with amplification system (Peroxidase, Biotin and Streptavidin) were used and glasses were incubated with anti-rat antibodies CD-4, CD-8, VEGF and PCNA and secondary antibody LSAB+Sys-HRP. Mayer Hematoxilin was used as couterstain and immunostained cells were counted on middle region of lamina propria, with 2.41 mm2 using Axiovision 4.7 Imaging System. Histomorfometry results were decribed and immunohistochemistry were analised with ANOVA one-way and Tukey test (GraphPad Prisma 5 for Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, USA). Significance level was p< 0.05. AHM presented biocompatibility acelerating mucositis healing process and lasertherapy had anti-inflamatory effect, specially on begining phases of healing process / Mestre

A membrana amniótica tem se consolidado no tratamento das afecções da superfície ocular. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade e a eficácia do implante de MA eqüina, preservada em glicerina a 98%, na reparação de ceratoplastias lamelares em cães, por meio do estudo da avaliação clínica pós-operatória dos animais, do tempo de cicatrização, da reconstrução da arquitetura da córnea, da resposta inflamatória, e da composição colágena do estroma corneal no local do implante. Foram selecionados 12 cães, sem raça definida, machos ou fêmeas, divididos em quatro grupos de três, que tiveram tempos de observação distintos: 2, 7, 21 e 40 dias. Foi realizada ceratoplastia lamelar de 5 mm de diâmetro em um dos olhos de cada animal, seguida da aplicação do implante de membrana amniótica eqüina de 6 mm. Durante o período de observação, exame clínico oftalmológico foi realizado nos cães, com intervalos de 48 horas e ao final deste período, foram submetidos á eutanásia. Os olhos em estudo foram enucleados e fixados para posterior análise. Foram utilizados três métodos de coloração para o estudo histológico do tecido implantado: hematoxilina-eosina (HE), ácido periódico de Schiff (PAS) e picrossirius. Além disso, procedeu-se a imunomarcação para colágenos tipo I, III, e V, com uso de pepsina para digestão das fibras colágenas heterotípicas exposição dos epítopos. Clinicamente os implantes foram completamente epitelizados em aproximadamente 10 dias, os neovasos apresentaram involução progressiva a partir dos 20 dias de pós-operatório, estando ausentes ao final dos 40 dias de observação, restando apenas uma nébula no local da lesão. À microscopia óptica, observou-se resposta inflamatória moderada, presença de epitélio pavimentoso estratificado aos sete dias e epitelização completa aos 21 dias. Aos 40 dias a membrana basal do epitélio apresentou-se reconstituída. O colágeno tipo I teve sua expressão no estroma intensificada aos 21 dias de pós- operatório. O colágeno tipo III está presente na membrana amniótica, sua a ausência no local do implante, aos 21 dias, mostrou remodelamento do tecido implantado. O colágeno tipo V, presente no estroma da córnea, teve sua expressão aumentada aos 7 e 21 dias, retornando à distribuição normal aos 40 dias de pós-operatório. Assim concluí-se que: a membrana amniótica eqüina é viável como implante em córnea de cão, sendo incorporada ao estroma, resultando em restabelecimento parcial da transparência no local de implante; o colágeno do tecido implantado é remodelado e substituído já aos 21 dias de pós-operatório; a pepsina foi eficiente na digestão das fibras e exposição dos epítopos dos colágenos nas fibras heterotípicas / The amniotic membrane has consecrated itself in the treatment of ocular surface diseases. The objective of this study was to evaluate the efficiency and viability of the equine amniotic membrane graft, preserved in glycerin at 98%, in the lamellar keroplasty recovery in dogs. Evaluation was based on clinical post-surgical exam, healing time, corneal architectural reconstruction, inflammatory response and collagen composition of the corneal stroma at the graft site. Twelve mixed-breed, male and female dogs were divided into four groups of three dogs. Each group was submitted to different observation periods of 2, 7, 21 and 40 days. Each dog was submitted to a 5 mm lamellar keratoplasty in one eye, followed by a 6 mm equine amniotic membrane graft. Each animal was submitted to clinical ophthalmologic exam every 48 hours. At the end of the evaluation period, the animal was euthanized and the grafted eye was removed and fixated for posterior analysis. For the histological study of the tissue graft, three methods of coloration were used: hematoxylin eosin (HE), periodic acid of Schiff (PAS) and picrosirius. Immunolocalization for the collagen types I, III and V using pepsin for fiber digestion of heterotypic fibrils and epitope exposure, was made. Clinically, the grafts were completely epithelized in approximately 10 days and neovascularization regressed progressively 20 days after surgery, being completely absent after 40 days, when only a nebula remained at the graft site. Optic microscopy revealed mild inflammatory response and presence of stratified pavement epithelium after 7 days and complete epithelization 21 days after surgery. At the end of 40 days the basal membrane was reconstituted. Type I collagen had its expression in the stroma intensified 21 days after the surgery. By day 21 the absence of collagen III in the corneal stroma showed graft remodeling, since this was formerly present in the amniotic membrane. The expression of type V fiber in the corneal stroma showed a mildly intensified expression at 7 and 21 days of observation, but returned to its normal distribution 40 days after surgery. Conclusion was that the equine amniotic membrane is a viable graft for the dog\'s cornea as it is incorporated to the stroma, resulting in partial transparency at the site of the graft. Twenty-one days after surgery, collagen from the graft is already remodeled and substituted. Pepsin is efficient for fiber digestion and collagen epitope exposure in heterotypical fibers.

A membrana amniótica é uma membrana translucida sendo a membrana mais interna da cavidade amniótica, formada por uma monocamada de células epiteliais disposta sobre uma membrana basal. Com o crescente interesse na utilização de células-tronco provenientes de anexos fetais, esta se torna uma promissora fonte de células-tronco. Sendo assim em trabalho anterior realizado pelo nosso grupo tivemos como objetivo, o estabelecimento da cultura celular e caracterização das células-tronco fetais de membrana amniótica de cão para verificar se a mesma pudesse ser uma nova fonte celular a ser usada nos protocolos de terapia celular, uma vez que os cães têm sido considerados modelos animais atraentes para avaliar novas drogas ou realizar ensaios pré-clínicos. As células de membrana amniótica obtidas a partir do trabalho anterior foram caracterizadas in vitro, observando-se características semelhantes a outras células-tronco mesenquimais. Porém, quando foi analisado o seu o seu potencial carcinogênico observamos a formação de um tumor de crescimento rápido, aproximadamente um mês, após o inóculo dessas células em 10 camundongos imunossuprimidos nude, sendo o tumor identificado histologicamente como um carcinoma embrionário. Diante deste comportamento acreditamos ser de extrema importância analisar células provenientes de novas coletas verificando se a mesmas podem se comportar como as anteriormente estudadas. Com isso, temos como objetivo deste trabalho estabelecer e caracterizar as células provenientes de duas novas coletas em diferentes períodos gestacionais visando verificar se estas células se comportam da mesma que as anteriores isso é se quando inoculadas nos animais formam tumor e assim poder ter certeza de que essas células são ou não, boas alternativas para terapia celular. As células obtidas nestas novas coletas têm características de células-tronco mesenquimais expressando alguns marcadores, tem curva de crescimento semelhante às células-tronco mesenquimais, se aderem ao plástico e se diferenciaram em adipócitos. Diferentemente das células obtidas no estudo anterior estas células não geraram tumor quando injetadas em camundongos imunossuprimidos, nude em até 60 dias após inoculação. / Amniotic membrane is a membrane translucent with the inner membrane of the amniotic cavity, formed by a monolayer of epithelial cells disposed on a basal membrane. With the growing interest in the use of stem cells from fetal membranes, this becomes a promising source of stem cells. So in a previous study conducted by our group we aim, the establishment of cell culture and characterization of fetal stem cells from amniotic membrane from dog to see if it could be a new source cell to be used in cell therapy protocols, Once the dogs have been considered attractive animal models to evaluate new drugs or performing pre-clinical tests. The cells from amniotic membrane obtained from previous work were characterized in vitro, observing characteristics similar to other mesenchymal stem cells. But when it was analyzed its its carcinogenic potential observed the formation of a fast-growing tumor, approximately one month after inoculation of these cells into immunocompromised nude mice 10, and the tumor identified histologically as embryonal carcinoma. Given this behavior we believe is extremely important to analyze cells from new collections by checking if the same can behave like those previously studied. With this, we aim of this work to establish and characterize the cells from two new collections at different gestational periods to verify whether these cells behave the same as the previous ones is that when inoculated into animals form tumor and thus be able to make sure that these cells are either not good alternatives for cell therapy. The cells obtained in these new collections has characteristics of mesenchymal stem cells expressing some markers, growth curve is similar to mesenchymal stem cells, adhere to plastic and differentiated into adipocytes. Unlike the cells obtained in the previous study these cells did not generate tumors when injected into immunocompromised mice, nude within 60 days after inoculation.

A membrana amniótica humana vem assumindo um papel de extrema importância na medicina regenerativa nos últimos anos, principalmente na área de dermatologia e oftalmologia, sendo seu uso promissor no tratamento de doenças cuja terapêutica atual é pouco eficaz. Além disso, na membrana amniótica humana encontram-se células-tronco mesenquimais, que apresentam plasticidade e vem sendo aplicadas para a regeneração de tecidos. Entretanto, muito pouco se sabe sobre a capacidade plástica e o uso de células-tronco de membrana amniótica de animais, já que a literatura a este respeito, não é tão ampla quanto à de humanos. Neste projeto estabelecemos a cultura de células-tronco de membrana amniótica (MA) de fetos caninos, caracterizando as células in vitro e in vivo. As células de MA foram obtidas a partir de um procedimento cirúrgico de histerectomia em cadelas prenhas, durante campanhas de castração da prefeitura da cidade de São Paulo. As células de MA foram caracterizadas in vitro, observando-se características semelhantes a outras células-tronco mesenquimais. Porém, quando foi analisado o seu comportamento in vivo, observamos a formação de um tumor de crescimento rápido, aproximadamente um mês, após o inóculo dessas células em 10 camundongos imunossuprimidos nude, sendo o tumor identificado histologicamente como um carcinoma embrionário. Diante do comportamento biológico formando um tumor in vivo, inferimos que células-tronco provenientes de membrana amniótica de cães não devem ser usadas para aplicação com objetivos terapêuticos em animais, pelo menos até que novas coletas sejam realizadas para que se possa confirmar ou não este comportamento. / The human amniotic membrane has taken an extremely important role in regenerative medicine in recent years, especially in dermatology and ophthalmology, and its promising use in treating diseases for which current therapy is ineffective. In addition, the amniotic membrane has human mesenchymal stem cells, which exhibit plasticity and have been applied to tissue regeneration. However, very little is known about the plastic capacity and the use of stem cells from amniotic membrane of animals, since the literature in this regard, it is not as broad as those of humans. In this project we established a culture of amniotic stem cells of dog, characterizing these cells in vitro and in vivo. The cells were obtained from a surgical procedure for hysterectomy in pregnant bitches, during castration\'s campaigns of the São Paulo\'s municipality. The cells were characterized in vitro, observing characteristics similar to other mesenchymal stem cells. In spite of their behavior, in vivo we observed the formation of a fast-growing tumor about a month after the inoculation of these cells in 10 immunosuppressed mice, being the tumor identified histologically as an embryonic carcinoma. Considering the biological behavior of forming a tumor in vivo, we infer that stem cells from amniotic membrane of dogs should not be used for application for therapeutic purposes in animals, at least until other collections are carried out so that it can be confirmed or not.

A membrana amniótica é a camada interna das membranas fetais (placenta), amplamente utilizada em transplantes por ser um tecido que combina propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas e antifibróticas, além da limitada capacidade de provocar reações imunológicas. O uso da membrana fresca tem algumas limitações, como a necessidade de rápida utilização e a impossibilidade de obter total segurança diante de certas infecções. Qualquer tecido biológico utilizado para transplante deve ser estéril. A radioesterilização é uma alternativa para garantir a qualidade e segurança dos tecidos usados em transplantes e outras aplicações clínicas, a fim de minimizar os riscos de contaminação do receptor do tecido, porém a mesma pode causar alterações indesejáveis no tecido. No presente trabalho, foram testadas doses de 10, 15, 25 e 35 kGy, utilizando duas fontes de radiação ionizante: raios gama proveniente de fonte de Cobalto-60 e feixe de elétrons. Na análise qualitativa visual e táctil foi observado que, nas doses mais elevadas (a partir de 25 kGy) para ambas as fontes de radiação, as membranas irradiadas sofreram maior alteração de cor, tornando-se mais amareladas e com diminuição da elasticidade, deixando-as mais rígidas. A colorimetria sólida possibilitou minimizar a subjetividade da análise visual e a microscopia óptica foi essencial para avaliar as alterações histológicas comprovando, respectivamente, que a alteração de cor da membrana e o grau de degradação das camadas subjacentes do tecido tem relação direta com a dose de radiação empregada. Desse modo, as doses de 10-35 kGy podem ser aplicadas nas membranas amnióticas para sua utilização como bandagem biológica, porém, para as doses a partir de 25 kGy deve-se levar em consideração a alteração de coloração e condensação das camadas da membrana se estas forem destinadas para o uso oftálmico ou como substrato transportador para transplante de tecido cultivado in vitro. Com as técnicas de OCT, TG e ensaio de tração não foi possível avaliar as alterações biomecânicas encontradas na análise qualitativa, nas condições experimentais realizadas devido aos desvios-padrão obtidos para as cinco membranas testadas. / The amniotic membrane is the inner layer of the fetal membranes (placenta), widely used in transplantation as it is a tissue that combines properties anti-inflammatory and antifibrotic antimicrobial, and limited ability to induce immune reactions. The use of fresh membrane has some limitations such as the need for rapid deployment and not being completely safe against of certain infections. Any biological tissue used for transplantation should be sterile. The radiosterilization is an alternative to ensure the quality and safety of tissues used in transplants, and other clinical applications to minimize the risk of contamination of the tissue´s receptor, but it can cause undesirable changes in the tissue. In this study, we tested doses of 10, 15, 25 and 35 kGy, using two sources of ionizing radiation: gamma rays from cobalt-60 source and electron beam. In qualitative, visual and tactile analysis it has been observed that higher doses (25 kGy and up, to both sources of radiation) irradiated membranes had a greater color change, becoming yellowed and decreased elasticity, becoming more rigid. The solid colorimetry minimized the subjectivity of visual analysis and optical microscopy was essential to evaluate the histological changes showing, respectively, the color change of the membrane and the degree of degradation of the underlying layers of tissue is directly related to the dose of radiation employed. Thus, doses of 10-35 kGy can be applied in the amniotic membranes for application as a biological bandage, however doses from 25 kGy and up should take into account the changes in color and condensation of the layers of the membrane for ophthalmic use or as a carrier substrate for transplantation of cultured tissue in vitro. With the techniques of OCT, TG and tensile testing was not possible to evaluate the biomechanical findings in the qualitative analysis, the experimental conditions due to the standard-deviations obtained for the five membranes tested.

A Ceratoconjuntivite Seca (KCS Keratoconjunctivitis Sicca) é uma desordem imunomediada e resulta de alterações do componente aquoso do filme lacrimal e da deficiência dos componentes lipídicos e mucoso.Seu diagnóstico é baseado no Teste Lacrimal de Schirmer (TLS) e no Teste de Ruptura do Filme Lacrimal (TRFL) e tem como sinais clínicos: secreção mucopurulenta, hiperemia conjuntival, blefaroespasmos, fotofobia, incômodo, dor, vascularização, opacidade corneana e pigmentação, além de cegueira em casos avançados. O tratamento convencional consiste em aplicações diárias de Ciclosporina 0,2% ou Tacrolimus 0,03% (pomada ou colírio oftálmicos), que apesar de controlar a doença, são custosos, não curativos e exigem alto comprometimento da interação paciente-proprietário. A terapia celular usando células-tronco (CT) traz uma nova esperança para doenças sem tratamento efetivo. Neste trabalho utilizamos CT mesenquimais (CTM) obtidas a partir de membrana amniótica (CTMA) de cães obtidas a partir do descarte destes tecidos em campanhas de castrações em diferentes tempos gestacionais, sem formação tumoral quando submetidas ao teste tumorigênico durante 60 dias. Dois animais com KCS crônica foram tratados com duas injeções de CTMA com intervalo de 30 dias, sendo a primeira de 0,5x106 células e a segunda de 1x106 células em cada glândula. Na segunda semana após a terapia foi observado aumento da TLS sugerindo um benéficio da terapia que foi diminuindo com o passar das semanas. O TRFL oscilou durante os testes e não apresentou diferenças significativas. A terapia celular utilizando CTMA de cães melhorou a condição ocular nos dois casos em momentos e parâmetros variados, com repercussão na melhoria da superfície, mas não houve regressão do quadro clínico. Investigações futuras em estágios menos avançados da doença podem ajudar a elucidar os mecanismos pelos quais esse efeito foi obtido / Keratoconjunctivitis Sicca (KCS) is an immune-mediated disorder and results from changes in the aqueous component of the tear film and also from the impairment of lipid and mucous components. Diagnosis is based on Lacrimal Schirmer Test (LST) and Tear Film Break Test (TFBT) and its clinical signs: purulent discharge, conjunctival hyperemia, blefaroespasmos, photophobia, discomfort, pain, vascularization, corneal opacity and pigmentation, addition of blindness in advanced cases. The standard treatment consists of daily applications of 0.2% cyclosporin or tacrolimus 0.03% (ophthalmic ointment or drops), that in spite of controlling the disease are expensive, require the patient does not curative and and require greater involvement of the patient-owner interaction. Cell therapy using stem cells (SC) brings new hope for diseases without effective treatment. In this work we used CT mesenchymal cells (MSCs) obtained from dogs amniotic membrane (AMSC) in the capanhas of castration at different times gestacionai without tumor formation tumorigenic when subjected to the test during 60 days. Two animals with chronic KCS were treated with two injections of CTMA with 30-day intervals, the first of which 0,5x106 cells and the second of 1x106 cells in each gland. In the second week after therapy was an increase in LST that has been decreasing over the weeks. The BTTF fluctuated during testing and no significant differences. Cell therapy using AMSC dogs improved the eye condition in both cases at times and different parameters, with consequent improvement in ocular surface but there was no regression of the clinical picture. Future research in less advanced stages of the disease may help to elucidate the mechanisms by which this effect was obtained