Orientador: Sara Terezinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T08:46:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_PauloRobertoMoura_D.pdf: 4111332 bytes, checksum: 7243dfc06daf8a58f41c137629b12750 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A esferocitose é um tipo comum de anemia hemolítica hereditária cujo primeiro defeito molecular foi caracterizado em 1992. A proteína banda 3, codificada pelo gene AE1, foi a primeira isoforma clonada de uma famma de genes de trocadores de ânions "Anion Exchanger-AE gene family" e é a mais abundante das proteínas integrais da membrana eritrocitária. Alterações moleculares neste polipeptídeo estão associadas à formação de esferócitos. Hemácias esferocíticas são osmoticamente frágeis, estando mais sujeitas à lise e ao sequestramento pelo baço, o que encurta seu tempo de vida. A proteína banda 3 também é expressa nos rins, na membrana basolateral de células alfa intercaladas do tubo coletor cortical, onde é responsável pela reabsorção de bicarbonato, compensando a secreção de ácidos pela H+ ATPase vacuolar apical, e participando da regulação fina do equilíbrio ácido-básico. Tanto a banda 3 eritrocitária como a renal são isoformas de um mesmo gene que através de um promotor tecido específico, diferem quanto à transcrição. O mRNA da banda 3 renal não apresenta os três primeiros exons observados na forma eritróide. O presente estudo teve o objetivo de investigar as alterações moleculares e regulação do gene da banda 3 na esferocitose hereditária em 5 pacientes com deficiência de banda 3, e investigar possíveis alterações neste gene em cinco pacientes com acidose renal tubular distal. Este estudo foi baseado no rastreamento de mutações e polimorfismos no gene mencionado, incluindo a região promotora, que também pode estar envolvida na fisiopatologia da doença. Para detecção das alterações moleculares foram utilizadas as técnicas de PCR, análise de polimorfismo de conformação em fita simples, subclonagem e sequenciamento. O estudo do cDNA foi realizado após a transcrição reversa do mRNA extraído de reticulócitos por RT-PCR. Outro objetivo foi investigar as alterações renais de pacientes com esferocitose hereditária e deficiência de banda 3, uma vez que esta proteína também é expressa nos rins. Os estudos renais foram realizados através da avaliação da capacidade de acidificação tubular distal e obtenção de medidas de bicarbonatúria, pH urinário, acidez titulável e excreção de amônia no período basal e após estímulo com furosemida. Também foi avaliado o contratransporte de sódio e lítio em hemácias de pacientes com esferocitose hereditária, uma vez que esta é uma medida indireta do contra-transporte Na+/H+, envolvido na regulação do pH intracelular do eritrócito e na homeostase ácido-básica do organismo, por secretar ácido e reabsorver Na+ em epitélio renal. Nossos resultados caracterizaram duas novas mutações no gene AEI. O estudo da Banda 3 Campinas, uma mutação no sítio doador de clivagem no intron 8, demonstrou a perda de bicarbonato pela urina dos pacientes afetados e um aumento na atividade de contra-transporte de sódio e lítio nas hemácias. A Banda 3 Pinhal, uma substituição de um resíduo de arginina altamente conservado, por histidina no domínio transmembrana, é a segunda mutação afetando o codon 490 da banda 3, e pode ser um "hot spot" para mutações no gene AEI. As hemácias destes pacientes apresentaram menor número de sítios para o inibidor DIDS. Outra mutação caracterizada foi a Banda 3 MODtefiore, previamente descrita. O estudo dos pacientes com acidose renal tubular distal revelou uma nova mutação na região promotora renal em um paciente com acidose renal tubular distal incompleta, que pode estar associada com o defeito na reabsorção de bicarbonato pelos rins. O estudo da acidose também caracterizou um novo polimorfismo no intron 3, a deleção da adenina 1233, com frequência alélica de 0,34 em 120 cromossomos analisados. Um conflito de sequência (quatro guaninas no lugar de três nt. 1272-1274) também foi verificado em todos indivíduos estudados. O polimorfismo Asp38-7Ala (Darmstad) foi encontrado em uma paciente com acidose, mas parece não estar relacionado com a doença. Finalmente concluímos que mutações no gene da banda 3 podem estar associadas com a esferocitose hereditária e com a acidose renal tubular distal incompleta, pois isoformas da proteína são expressas nas hemácias e nas células a-intercaladas. Sugerimos que em casos onde há perda de ânions pelos rins, mecanismos de compensação podem estar ativados, como o aumento da atividade excretora de prótons pela Na+/H+, ou pela H+-ATPase vacuolar apical. A fim de realizar estudos de interações protéicas, foi subclonado o domínio citoplasmático completo da fosfolípide scramblase dos seguintes tecidos humanos: cérebro, testículos e baço. A sequência do cDNA da enzima scramblase usada no ensaio duplo-híbrido resultou no fenômeno de auto-ativação, que é uma razão comum da falha do rastreamento pelo método duplo-híbrido / Abstract: Hereditary spherocytosis is a common type of hemolytic anemia. The first molecular defect in the band 3 gene associated with spherocytosis was characterized in 1992. Band 3, codified by the AEl gene, was the first isoform to be c10ned of a family of genes of anion exchangers (Anion Exchanger-AE gene family) and is the most abundant of the integral proteins of the erythrocyte membrane. The molecular alterations in this polypeptide are associated to spherocyte formation. Spherocytic red cells have osmotic fragility , and are more liable to undergo lise and splenic sequestration, which decreases their life span. Band 3 protein is also expressed in the kidney, in the basolateral membrane of the cortical collecting duct intercalated alpha cells, where it is responsible for the bicarbonate reabsorption, compensating the acid secretion at apical membrane by the H+ ATPase vacuolar, and taking part in the fine regulation of the acid-base equilibrium. Both erythrocyte and renal band 3 are isoforms of the same gene, which differ in transcription due to a tissue-specific promoter. The first three exons are not present in the erythroid form of renal band 3 rnRNA. The aim of this study was to investigate the molecular alterations and gene regulation, of band 3 in hereditary spherocytosis in 5 families with band 3 deficiency. This study was based on the screening of mutations and polymorphisms of the gene formerly mentioned, inc1uding the promoter region, which might be involved in the pathophysiology of the disease. In order to detect the molecular alterations, PCR technique, single strand conformation polymorphism analysis, subc10nning and sequencing were used. The cDNA study was performed afier the reverse transcription of the rnRNA extracted from the reticulocytes using RT-PCR. Another aim was to investigate the renal alterations of patients with hereditary spherocytosis and band 3 deficiency, as this protein is also expressed in the kidneys. Renal studies were performed using urinary acidification tests and measures of. bicarbonate, urinary pH, acid titration and ammonia excretion during the basal period and afier furosemide stimulation. The sodiumllithium countertransport activity in the red blood cells of patients with hereditary spherocytosis was also assessed, as it is an indirect measure of the Na + /Ir countertransport, which is involved in the intracellular pH regulation of the erythrocyte and in the acid-base homeostasis of the organism, secreting acid and reabsorbing Na + in the renal epithelium. Our results caracterized two novel mutations in the AEI gene. The study of Band 3 campinas, a mutation at the splice donor site in the intron 8, revealed a bicarbonate loss by the urine from patients and an increase in the sodiumllithium countertransport activity of their red blood cells. The Band 3 Pinhal is a highly conserved arginine to histidine substitution in the transmembrane domain. This is the second mutation affecting the codon 490 of band 3, and could represent a hot spot for mutations in the AEI gene. The red blood cells of these patients showed a reduced number of sites for DIDS, the band 3 anion exchange inhibitor. Another mutation found was the Band 3 Montefiore, previously described. The study of the patient's tubular acidosis revealed a new mutation neighboring the kidney promoter in a child presenting incomplete distal renal tubular acidosis, which might be associated with the kidney bicarbonate reabsorption defect. The acidosis study also caracterized a novel polymorphysm in intron 3, the adenine 1233 deletion, with an allele frequency of 0.34 in the 120 chromossomes analyzed. A sequence conflict (four guanines in the place of three nt.1272-1274) was also verified in all subjects studied. The polymorphysm Asp38-7Ala (Darmstad) was found in one patient with acidosis, but was not related with the disease. Finally, we conc1uded that mutations in the band 3 gene may be associated with hereditary spherocytosis and with incomplete distal renal tubular acidosis, as the band 3 isoforms are expressed in the red cells and in the renal {X-intercalated cells. We suggest that the proton excretion mechanisms, as the Na+/H+ exchanger or the vacuolar Ir-ATPase, might be activated to compensate the basal bicarbonate loss by the kidney. In order to perform protein interaction studies, we have subc10ned the entire cytoplasmic domain inc1uding part of the transmembrane segment of phospholipid scramblase from the following human cDNA tissues: brain, testis and spleen. The cDNA sequence of phospholipid scramblase used in the two-hybrids system caused auto-activation, a common reason for failure of two-hybrid screens / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sonia Valeria P. Malheiros Marques Fernandes, Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:19:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_CleytonCrepaldi_M.pdf: 4439591 bytes, checksum: 806cbfd68fabc115f2daee1adf79c396 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: No processo de solubilização de lipídios e proteínas de membrana a escolha do surfatante é um passo fundamental. Um conhecimento detalhado das propriedades do surfatante se faz necessário na sua utilização em membranas biológicas. Neste trabalho determinamos algumas propriedades físico-químicas de dois novos surfatantes zwiteriônicos do tipo amidosulfobetaína, ASB-14 e ASB-16, e avaliamos seus efeitos sobre a solubilização de membranas eritrocitárias e suas proteínas. O ASB-16 por apresentar maior cauda hidrofóbica apresentou valor de CMC (concentração micelar crítica) cerca de 10 vezes menor que seu análogo ASB-14 nas condições estudadas (em água e em tampão PBS 5 mM, pH 7,4 a 25°C). Aplicando-se o tratamento clássico de Lichtenberg aos testes hemolíticos encontramos que o ASB-16 possui maior afinidade pelo ambiente membranar e seu efeito de solubulização sobre membranas eritrocitárias ocorre, portanto, em baixas razões surfatante/lipídio. O maior valor de partição e menor valor de CMC obtidos para o ASB-16 justificam seu efeito hemolítico superior. Além disso, ASB-14 e ASB-16 apresentaram efeitos hemolíticos superiores ao clássico Triton X-100. Dessa forma, esses resultados demonstraram que o comportamento agregativo e a interação hidrofóbica estão fortemente relacionados ao processo de solubilização. A solubilização das proteínas da membrana eritrocitária promovida pelo uso dos surfatantes ASB-14, ASB-16, CHAPS e Triton X-100 foi avaliada através da técnica de eletroforese bidimensional. Apesar do CHAPS solubilizar o maior número de proteínas que os demais surfatantes utilizados, o ASB-14 e ASB-16 mostraram-se capazes de solubilizar proteínas diferentes além de promoverem um aumento da solubilização de algumas proteínas. Portanto, nas condições experimentais utilizadas, a diferença entre o perfil de solubilização das proteínas e o efeito hemolítico induzido pelos surfatantes sugere que o fenômeno de hemólise não ocorre proporcionalmente à saída de proteínas da membrana. Os resultados obtidos nesse estudo sugerem que o uso de ASB-14 e ASB-16 em processos de solubilização de membranas e suas proteínas pode ser promissor e mais estudos sobre eles devem ser realizados / Abstract: The choice of a surfactant is one of the most important steps for lipid and membrane proteins solubilization. A detailed knowledge of the surfactant properties is very useful for its application into membrane studies. In this work, we determined physicochemical properties of two novel zwitterionic amidosulfobetaine surfactants, ASB14 and ASB-16, and their solubilization properties on erythrocyte membrane's lipids and proteins. For ASB-16, with a longer hydrophobic tail, the value of CMC (critica I micelle concentration) was about ten times smaller than that of ASB-14, both in water and in 5 mM PBS, pH 7.4, at 25°C. By applying a classical treatment for the interpretation of the hemolytic tests, we found that ASB-16 presents higher affinity for the membrane environment, 50 that, its effect on the erythrocyte membrane solubilization occurs at a small surfactant/lipid molar ratio. The higher partition coefficient value and lower CMC value obtained for ASB-16 explain its higher hemolytic effect, in comparison to ASB-14. Furthermore, ASB-14 and ASB-16 showed higher hemolytic activity than Triton X-100, a classic surfactant. These results showed that the aggregative phenomenon and hydrophobic interaction are strongly involved in the membrane solubilization process. The solubilization of erythrocyte membrane associated proteins, using ASB-14, ASB-16, CHAPS and Triton X-100, was evaluated through two-dimensional electrophoresis. Although CHAPS have solubilized more proteins than the others surfactants, ASB-14 and ASB-16 increased the solubilization of some proteins and different spots were observed. In the experimental conditions studied, the difference between the protein solubilization and the Iytic effect induced by surfactants suggest that the hemolytic phenomenon does not occur proportionally with the proteins release from the membrane. The results obtained in this study suggest that the use of ASB-14 and ASB-16 on biomembranes and their protein solubilization can be promising and further studies about them should be carried out / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Eneida de Paula / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T20:44:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prete_PauloSergioCastilho_D.pdf: 3376950 bytes, checksum: fd06e65f64531668e35cf4a9cb817913 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Surfatantes ou detergentes são compostos anfifílicos que, na presença de água, têm a característica de formar agregados micelares. Surfatantes induzem a desestruturação de outros agregados como bicamadas sendo, por isso, usados para ruptura celular ou solubilização de lipídios e proteínas de membrana. A capacidade lítica dos surfatantes resulta de sua estrutura química, que determina o modo de interação dos mesmos com as membranas. Em concentrações mais altas (acima da concentração micelar crítica), os surfatantes desestabilizam as bicamadas lipídicas, levando à formação de micelas-mistas. Ensaios hemolíticos são bons modelos para estudo do efeito lítico de surfatantes em biomembranas. Aplicando em eritrócitos humanos o tratamento quantitativo proposto por Lichtenberg (1985) para estudo da solubilização de bicamadas lipídicas mensurou-se, neste trabalho, as concentrações para início (Csat) e 100% de hemólise (Csol), induzidas por 25 surfatantes clássicos, pertencentes a cinco diferentes famílias. A variação dos valores de Csat, Csol determinada com diferentes hematócritos permitiu o cálculo da constante de ligação surfatante/membrana e da razão surfatante/lipídio de membrana (Re) para início e 100% de hemólise. O parâmetro Re foi usado para classificar os detergentes como fortes, médios ou fracos agentes solubilizantes, com boa correlação com dados da literatura o que nos permitiu propor seu uso para descrever o efeito lítico de surfatantes, como uma alternativa simples e aplicável as membranas biológicas. As transições durante o processo hemolítico foram acompanhadas pela técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica, com uso marcador de spin 5 doxil-estearato (incorporado a 1 mol% nas membranas de eritrócito) e lise induzida pelo surfatante não iônico Triton X100. Concomitante ao aparecimento de hemoglobina e fosfato livres no sobrenadante - indicadores da ruptura da membrana, medidas do parâmetro de ordem daquele marcador de spin permitiram estudar as transições que acontecem durante (membrana:membrana mista) e após (membrana mista:micela mista) a hemólise / Abstract: Surfactants or detergents are amphiphilic compounds that form micellar aggregates in the presence of excess water. Surfactants are able to induce disruption of lamellar aggregates, justifying their use for cell lysis or in the extraction of membrane constituents such as lipids and proteins. The lytic capacity of a given surfactant is determined by its chemical structure, that rules its interaction with the membranes. At high concentration (above the critic micelle concentration), surfactants destabilize lipid bilayer leading to mixed micelle formation. Hemolytic assays are a good model to study the lytic effect of surfactants on biomembranes. In this study we have applied to human erythrocytes the quantitative treatment proposed by Lichtenberg (1985) to describe the solubilization of model lipid membranes. The concentration for onset (Csat) and complete (Csol) hemolysis induced by 25 classic surfactants from five different families were measured. Changes in Csat and Csol values at different hematocrits allowed the determination of the surfactant/membrane lipid molar ratio (Re) for beginning and 100% lysis. The Re arameter was used to classify the surfactants as strong, medium or weak membrane solubilizers. The classification was in good correlation with data in the literature, allowing us to recommend the use of Re parameter to describe the lyric effect of surfactants on biomembranes. The transitions in the hemolytic process were accompanied by Electron Paramagnetic Resonance, using the 5-doxyl-stearate spin-probe (1 mol%, incorporated in the erythrocyte membrane) and the non-ionic surfactant Triton X100. Simultaneously to the appearance of hemoglobin and phosphate released in the supernatant, measurements of the order parameter of the spin probe were used to characterize the transitions that take place during (membrane :mixed membrane) and after (mixed: membrane: mixed micelle) hemolysis / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular