Les rétinol déshydrogénases ou RDHs sont des oxydoréductases inhérentes à l’accomplissement de la fonction visuelle de la rétine. Elles sont en effet impliquées dans le cycle visuel rétinien. Suite à l’absorption de la lumière par le pigment visuel des photorécepteurs, la rhodopsine, la RDH8 est la première enzyme qui va intervenir dans le cycle visuel après la libération du chromophore de la rhodopsine, le tout-trans rétinal. Ainsi, la RDH8 détoxifie les photorécepteurs car le tout-trans rétinal est une espèce très réactive qui peut induire des dommages à la rétine. La RDH11, quant à elle, agit de concert avec la RDH5 au niveau de la dernière étape du cycle visuel dans l’épithélium pigmentaire rétinien en transformant le 11-cis rétinol en 11-cis rétinal, qui sera réacheminé vers les photorécepteurs pour régénérer le pigment visuel. Toutefois, la structure tertiaire des RDHs n’a encore jamais été résolue. Ces enzymes sont néanmoins reconnues pour être associées aux membranes cellulaires par leur segment N- et/ou C-terminal. Nous avons alors entrepris ce travail afin de caractériser la structure de ces enzymes et mieux comprendre leur interaction avec les membranes. Nous avons étudié dans un premier temps différentes portions du segment N- et C-terminal de la RDH11 et la RDH8 respectivement, par différentes méthodes spectroscopiques. Nous avons alors observé que les segments de ces deux enzymes agissent par deux modes d’action totalement différents. La RDH11 ferait appel à un segment N-terminal transmembranaire qui adopte une conformation hélicale peu importe sa longueur, alors que la RDH8 utiliserait un segment C-terminal qui adopte une structure secondaire variable selon la longueur et dont la liaison est périphérique à la membrane. En plus, la liaison de la RDH8 par son segment C-terminal serait potentiellement facilitée par une ou plusieurs acylations situées au niveau de certaines cystéines. Les mesures de pression d’insertion maximale ont permis de comparer les interactions entre des segments de longueur variable en N-terminal de la RDH11 et en C-terminal de la RDH8 avec des monocouches de différents phospholipides. Ainsi, nous avons déterminé les interactions les plus favorables pour chacun de ces segments. Nous nous sommes focalisés par la suite sur l’étude de l’enzyme RDH8 et la comparaison de ses propriétés structurales, de stabilité et de liaison membranaire avec celles de sa forme tronquée RDH8t, dépourvue de son segment en C-terminal. Notons que nous avons mis au point un protocole adapté pour surexprimer et purifier la RDH8 et sa forme tronquée. À notre connaissance, il s’agit ici des premiers travaux de recherche rapportant la surexpression et la purification d’une RDH8 (bovine) complète dans un système procaryote (E. coli). Nous avons alors constaté que les deux formes de la RDH8, complète et tronquée, comprenaient majoritairement des hélices α en plus de la présence de feuillets β, en accord avec le motif de Rossmann fold suggéré dans la littérature pour cette famille d’enzymes. Il s’est avéré également que le segment C-terminal a un impact sur la stabilité de la RDH8 comme démontré par les mesures du contenu en structure secondaire de ces protéines en fonction des conditions de stockage et dans les expérimentations de dénaturation thermique. Enfin, les mesures de pression d’insertion maximale (PIM) et de synergie ont démontré que le segment C-terminal facilitait la liaison membranaire de la forme complète par rapport à la forme tronquée, notamment dans le contexte de phospholipides portant une tête polaire chargée négativement. L’interaction membranaire de la RDH8 pourrait donc impliquer des interactions électrostatiques. Des expériences de spectroscopie de fluorescence ont permis de confirmer l’implication du segment C-terminal dans la liaison de la RDH8 avec des bicouches lipidiques grâce à la présence de deux résidus tryptophanes uniquement dans son segment C-terminal. / In the retina, retinol dehydrogenases (RDHs) play a crucial role in the visual cycle allowing a good vision. The first step of the visual cycle is taking place in photoreceptors where RDH8 is located and then in the retinal pigmented epithelium (RPE) where RDH11 can be found. RDH11 is likely anchored to membranes by means of its N-terminal segment whereas RDH8 has been postulated to be membrane bound via its C-terminal segment. So, to better evaluate the role of the N-terminal segment of RDH11 and the C-terminal segment of RDH8 in the membrane binding of these proteins, different variants (Long and Short) of the aforementioned segments have been studied. In addition, mutations of the C-terminal segment of RDH8 have been introduced to monitor their interaction with lipid monolayers or bilayers. We have thus analyzed the secondary structure content of these segments by conventional spectroscopic methods such as circular dichroism (CD) and attenuated total reflectance (ATR) infrared spectroscopy whereas their interaction with phospholipids have been mainly monitored by surface pressure measurements when using monolayers and fluorescence spectroscopy for bilayers. Overall, we found that the N-terminal segment of RDH11 adopts an α-helix conformation acting as a transmembrane domain. Values of maximum insertion pressure (MIP) and synergy suggested a preferential binding of the RDH11 Long-peptide to phosphoethanolamine, which are abundant in the RPE. In the case of RDH8, our findings suggest an important role of the long C-terminal segment in membrane binding, which is supported by its helical content and the larger values of MIP and synergy. We also compared the behavior of RDH8 and its truncated form (RDH8t, without its C-terminal segment) to better understand the involvement of this segment in membrane binding. Thus, both enzymes have been expressed in E. coli, purified by affinity chromatography and studied by the spectroscopic methods mentioned above and by using MIP and synergy measurements. RDH8 and RDH8t display a secondary structure content in agreement with their predicted Rossmann fold. Interestingly, the removal of the C-terminal segment decreased the temporal and thermal stability of these enzymes. In addition, this segment contributes to protein-lipid interaction especially in presence of negatively charged phospholipids likely through electrostatic interactions. The involvement of the C-terminal segment of the RDH8 in its membrane anchoring has been further confirmed by fluorescence measurements of its two Trp residues located in this segment. The present characterization of RDH8 is a first step paving the way for the elucidation of its structural and functional features to gain a better understanding of its role within the visual cycle and investigating mechanisms of retinal pathogenesis.

La recoverine est impliquée dans la cascade de la phototransduction. C’est une neuroprotéine sensible aux ions calcium. Cette famille de protéines comprend quatorze membres qui ont des caractéristiques structurales communes comme la présence de quatre motifs EF-hand, la liaison du calcium et la N-myristoylation. Le phénomène de calcium-myristoyl switch a été démontré sans ambiguïté uniquement pour la recoverine; il s’agit d’un changement de structure tertiaire qui est modulé par la concentration en calcium. Ainsi, en absence de calcium, la recoverine est dans une conformation cytosolique avec son groupement myristoyle enfoui dans une poche hydrophobe. À concentration élevée en calcium, la recoverine lie deux ions calcium, ce qui résulte en l’extrusion du groupement myristoyle de sa poche hydrophobe et lui permet d’être recrutée à l’interface membranaire. La recoverine est donc une protéine périphérique de la membrane des disques du segment externe des bâtonnets dont la composition lipidique est unique. En effet, cette membrane possède le plus haut contenu en chaînes acyle polyinsaturées parmi tous les lipides du corps humain. De plus, les lipides sont majoritairement zwitterioniques avec la phosphatidylcholine et la phosphatidyléthanolamine. Aussi, il existe un faible pourcentage de lipides chargés négativement, notamment la phosphatidylsérine, qui jouent un rôle dans l’interaction membranaire de la recoverine. L’utilisation de systèmes lipidiques modèles, tels que les vésicules multilamellaires et les bicouches lipidiques orientées mécaniquement, permet de cibler l’influence de chacune des composantes de la membrane. L’objectif général de ce projet de thèse, divisé en quatre objectifs spécifiques, était de déterminer l’influence de la présence du calcium, de la myristoylation de la recoverine et de la composition lipidique sur l’interaction membranaire de la recoverine. Le premier objectif spécifique consistait à déterminer la stabilité structurale de la recoverine myristoylée ou non myristoylée en absence et présence de calcium. La spectroscopie infrarouge a permis de constater que la recoverine est stable structuralement à la température ambiante et corporelle. La présence de calcium audessus d’un certain ratio avec la recoverine assure sa stabilité structurale jusqu’à une température de 65 °C; l’agrégation de la recoverine est observée au-dessus de cette température. La myristoylation de la recoverine augmente sa stabilité thermique. Le deuxième objectif spécifique était de comprendre le rôle des lipides chargés négativement sur l’interaction membranaire de la recoverine. Nous avons ainsi démontré que la recoverine nécessite un minimum de calcium pour conserver sa stabilité thermique en présence de phosphatidylglycérol qui lie aussi le calcium et réduit ainsi la quantité disponible pour la recoverine. La fonte des complexes entre le calcium et le phosphatidylglycérol favorise l’interaction membranaire avec la recoverine en augmentant davantage la température de transition de phase de ces lipides. Le troisième objectif spécifique consistait à caractériser l’effet de la fluidité membranaire sur l’immobilisation de la recoverine en utilisant différentes chaînes acyle de la phosphatidylcholine. La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire à l’état solide du deutérium a été employée en utilisant un groupement myristoyle perdeutéré. Nous avons ainsi confirmé le phénomène de calcium-myristoyl switch de la recoverine selon la concentration en calcium. De plus, nous avons aussi montré qu’une fluidité membranaire optimale est nécessaire pour l’immobilisation membranaire du groupement myristoyle. Le quatrième objectif spécifique était d’analyser l’interaction membranaire de la recoverine avec la dioléoylphosphatidylcholine. La spectroscopie infrarouge a montré que la recoverine reste stable thermiquement en présence de ces lipides et ne perturbe pas leur organisation. La recoverine non myristoylée augmente légèrement l’hydratation des lipides qui est corrélée avec une hausse de la diffusion latérale des lipides tel que déterminée par la technique de centerband-only detection of exchange (CODEX) en spectroscopie de résonance magnétique à l’état solide du phosphore-31. La spectroscopie de résonance magnétique du fluor-19 a permis d’observer le calcium-myristoyl switch et l’immobilisation du groupement myristoyle de la recoverine dans la membrane en présence de calcium, ainsi que deux environnements différents pour le groupement myristoyle en absence de calcium. En conclusion, le calcium permet l’interaction membranaire et de conserver la recoverine stable thermiquement. La myristoylation de la recoverine permet son ancrage dans la membrane et augmente l’interaction avec les phosphatidylglycérols. Finalement, une fluidité membranaire optimale est nécessaire à l’ancrage de la recoverine dans la membrane et la charge négative des lipides augmente l’interaction membranaire de la recoverine. / Recoverin is evolved in the phototransduction cascade. It is a neuronal calcium sensor. This protein family of fourteen members shares common structural characteristics such as the presence of four EF-Hand motifs, the binding of calcium and the N-myristoylation. The phenomenon of calcium-myristoyl switch has been demonstrated without ambiguity only for recoverin; it is a change in tertiary structure which is triggered by calcium concentration. So, in the absence of calcium, recoverin is in a cytosolic form with its myristoyl moiety hidden in a hydrophobic pocket. At high calcium concentration, recoverin binds two calcium ions which in turn leads to the extrusion of its myristoyl moiety from the hydrophobic pocket and to its recruitment at the membrane. Recoverin is closely bound to rod outer segment disk membranes which present a unique lipid membrane composition. Indeed, this membrane displays the highest content of polyunsaturated lipid acyl chains in the human body. Moreover, the lipid polar headgroup is in majority zwitterionic with phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. Also, a small amount of the negatively charged phosphatidylserine is present, which seems to play a role in the membrane interaction of recoverin. Using lipid model systems such as multilamellar vesicles and mechanically oriented lipid bilayers allows to more properly characterize the role of each membrane component. The aim of this thesis project, divided in four specific objectives, was to gain information on recoverin membrane interaction by studying the influence of the presence of calcium, of recoverin myristoylation and of membrane composition. The first specific objective was to determine the structural stability of myristoylated or non myristoylated recoverin in the absence and presence of calcium. Recoverin is structurally stable at ambient and body temperature as shown by infrared spectroscopy. The presence of calcium beyond a specific calcium:recoverin ratio allows protein structural stability up to 65 °C, recoverin aggregation is observed above this temperature. The second specific objective was to understand the role of negatively charged lipids on recoverin membrane interaction. We have demonstrated that recoverin needs a minimal amount of bound calcium to preserve its thermal stability since phosphatidylglycerol binds calcium, which reduces the concentration of calcium available for recoverin. The melting of complexes between calcium and phosphatidylglycerol favors membrane interaction of recoverin by further increasing the lipid phase transition temperature. The third specific objective was to investigate the effect of membrane fluidity on the recoverin immobilization using phosphatidylcholine bearing different lipid acyl chains. Deuterium solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy was used with a perdeuterated myristoyl moiety on recoverin. We have thus confirmed the dependence of the calcium-myristoyl switch phenomenon on calcium concentration. Moreover, we have shown that an optimal membrane fluidity is required for the membrane immobilization of the myristoyl moiety of recoverin. The fourth specific objective was to study the recoverin membrane interaction with dioleoylphosphatidylcholine. Infrared spectroscopy has shown that recoverin does not perturb lipid bilayer organization and remains thermally stable in the presence of these lipids. Non myristoylated recoverin increases slightly lipid hydration that is correlated to an increase in lipid lateral diffusion as seen with centerband-only detection of exchange (CODEX) pulse sequences by phosphorus-31 solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. 19-Fluorine nuclear magnetic resonance spectroscopy allows the observation of the calcium-myristoyl switch and of recoverin myristoyl moiety membrane immobilization in the presence of calcium as well as two different environments for the recoverin myristoyl moiety in the absence of calcium. In conclusion, calcium allows recoverin membrane interaction and thermal stability of recoverin. Recoverin myristoylation allows its anchorage in the membrane and increases interaction with phosphatidylglycerol. Finally, an optimal membrane fluidity is required for recoverin membrane anchorage and negatively charged lipids increase recoverin membrane interaction.

Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle indispensable dans la survie des cellules et 20 à 30% des cadres de lectures ouverts codent pour cette classe de protéines. La majorité des protéines membranaires se trouvant sur la Protein Data Bank n’ont pas une orientation et une insertion connue. L’orientation, l’insertion et la conformation que les protéines membranaires ont lorsqu’elles interagissent avec une bicouche lipidique sont importantes pour la compréhension de leur fonction, mais ce sont des caractéristiques difficiles à obtenir par des méthodes expérimentales. Des méthodes computationnelles peuvent réduire le temps et le coût de l'identification des caractéristiques des protéines membranaires. Dans le cadre de ce projet de maîtrise, nous proposons une nouvelle méthode computationnelle qui prédit l’orientation et l’insertion d’une protéine dans une membrane. La méthode est basée sur les potentiels de force moyenne de l’insertion membranaire des chaînes latérales des acides aminés dans une membrane modèle composèe de dioléoylphosphatidylcholine. / Integral membrane proteins play many important roles, and account for 20 to 30% of the open reading frames code for this class of proteins. Most of the membrane proteins found on the Protein Data Bank do not have a known membrane orientation and insertion, and such information is not available from the standard PDB format. The orientation, insertion and conformation that the membrane proteins have when interacting with a lipid bilayer are important for understanding their functions, but they are difficult characteristics to obtain experimentally. Computational methods can help reduce the cost and time allocated to determine the characteristics of a membrane protein. In this project, we propose a new computational method that predicts the orientation and the insertion of a protein in a lipid bilayer. The method is based on the potential mean force of the insertion of the amino acid side chain analogs in a dioleoylphosphatidylcholine lipid bilayer.

Les protéines appartenant à la famille S100 et les annexines interviennent lors de différents mécanismes membranaires vitaux. En effet, le complexe protéique S100A10-annexine A2 permettrait le recrutement d'une partie du C-terminal de la protéine AHNAK à la membrane en présence de calcium, avant de former une plateforme qui initierait la réparation membranaire. Cependant, aucune donnée moléculaire n'est à ce jour disponible sur la liaison membranaire de la S100A10 et du segment C-terminal d'AHNAK de ce complexe. Leur liaison membranaire doit donc être étudiée afin de mieux comprendre leurs rôles lors du processus de réparation membranaire. Afin de combler le manque de données sur le rendement et la quantité de S100A10 solubilisée et purifiée parmi la littérature existante, le protocole de surexpression et purification de la S100A10 a été optimisé dans un premier temps. La protéine a été identifiée par spectrométrie de masse et la stabilité de sa structure secondaire a été analysée par dichroïsme circulaire à différentes températures au cours du temps. La S100A10 obtenue est stable pendant au moins 60 jours à plusieurs températures, dont 20 °C, permettant d'effectuer des expériences biophysiques à température ambiante avec la protéine non-dénaturée. En parallèle, le segment peptidique C-terminal d'AHNAK (pAHNAK) a été synthétisé commercialement. L'étude par spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée (ATR) montre que sa structure secondaire ne subit pas de changement majeur en présence et en absence de lipides. Deux modèles membranaires ont été choisis dans nos études. D'abord, celui des monocouches de Langmuir a été utilisé pour mimer les membranes cellulaires afin de caractériser l'interaction des protéines avec différents phospholipides composant les membranes. Les études de la liaison membranaire de ces protéines ont été effectuées avec ce modèle en le couplant avec la tensiométrie de surface. Ces travaux ont démontré que le pAHNAK interagissait plus fortement avec les lipides insaturés, en particulier les lipides monoinsaturés, qu'avec les lipides saturés. De plus, le pAHNAK interagit préférentiellement avec la tête polaire des phospholipides de type phosphatidylsérine (PS), qui sont chargées négativement, puis avec ceux de type phosphatidyléthanolamine (PE) et enfin avec ceux de type phosphatidylcholine (PC). Avec le même modèle, la profondeur d'insertion des protéines dans des monocouches lipidiques a été déterminée par ellipsométrie. Les expériences avec des phospholipides monoinsaturés démontrent que la profondeur d'insertion du pAHNAK suit la même tendance (PS˃PE˃PC). Le deuxième modèle employé est celui des bicouches lipidiques avec lequel l'affinité de ces protéines pour les têtes polaires des phospholipides a spécifiquement été évaluée par résonance magnétique nucléaire (RMN) du ³¹P à l'état solide. Ces études de RMN confirment la tendance de préférence du pAHNAK pour les différents types de phospholipide à 37 °C observée précédemment. La liaison membranaire de la S100A10 a ensuite été étudiée selon la même stratégie que pour le pAHNAK. Les résultats de la tensiométrie montrent que la S100A10 préfère interagir avec les phospholipides insaturés avec des têtes polaires PE ou PS, et surtout les phospholipides polyinsaturés contenant de longues chaînes acyles. Les expériences d'ellipsométrie suggèrent que la S100A10 suit l'ordre d'insertion PC > PE > PS, ce qui pourrait être expliqué par un changement d'orientation de la protéine. De plus, les résultats de RMN suggèrent qu'à 20 °C et à 37 °C, la S100A10 pourrait s'insérer partiellement dans la membrane près des têtes polaires PS. L'ensemble de nos travaux de recherche démontrent que, dans un environnement physiologique à 37 °C, le pAHNAK et la S100A10 peuvent probablement interagir avec des phospholipides monoinsaturés ayant une tête polaire chargée négativement. Cependant, le pAHNAK aura tendance à s'insérer dans les chaînes acyles alors que la S100A10 s'insérerait partiellement près des têtes polaires. Ce projet a ainsi permis de développer les connaissances sur la liaison membranaire de la protéine S100A10 et du pAHNAK et d'émettre de nouvelles hypothèses quant au rôle des PS dans la réparation membranaire. De plus, la poursuite de ces travaux mènera à l'identification potentielle des conditions conduisant à une modification de leur liaison membranaire, et éventuellement à une perte de fonction. Ainsi, les connaissances développées dans cette thèse permettent de mieux comprendre la liaison membranaire de la S100A10 et du C-terminal d'AHNAK afin de mieux déterminer leurs rôles dans la réparation membranaire, ainsi que dans les autres mécanismes physiologiques auxquels ces protéines participent. / Proteins belonging to S100 family proteins and annexins are involved in various vital membrane mechanisms. The S100A10-annexin A2 protein complex was postulated to recruit part of the C-terminal segment of the AHNAK protein to the membrane in the presence of calcium, before forming a platform which can initiate membrane repair. However, no molecular data is currently available on the membrane binding of S100A10 and of the C-terminal segment of AHNAK of this complex. Their membrane binding should therefore be studied in order to better understand their roles during the membrane repair process. In order to fill the lack of data on the yield and the quantity of purified and solubilized S100A10 in the existing literature, the protocol for the overexpression and purification of S100A10 was first optimized. The protein was identified by mass spectrometry and its secondary structure stability was analyzed by circular dichroism at different temperatures over time. The S100A10 obtained is stable for at least 60 days at several temperatures, including 20 °C, allowing to perform biophysical experiments at room temperature with a non-denatured protein. In parallel, the C-terminal peptide segment of AHNAK (pAHNAK) was commercially synthesized. Attenuated total reflection infrared spectroscopy (ATR) study shows that its secondary structure does not undergo major changes in the presence and absence of lipids. Two membrane models were chosen in our studies. First, the Langmuir monolayers model was used to mimic cell membranes in order to characterize the interaction of proteins with the different phospholipids found in membranes. Membrane binding studies of these proteins were carried out with this model by coupling it with surface tensiometry. This work demonstrated that pAHNAK interact more strongly with unsaturated lipids, in particular monounsaturated lipids, than with saturated lipids. In addition, pAHNAK preferentially interacts with the phosphatidylserine (PS) polar head group which is negatively charged, then with phosphatidylethanolamine (PE) and finally with phosphatidylcholine (PC). With the same model, the insertion depth of pAHNAK into lipid monolayers was determined by ellipsometry. Experiments with monounsaturated phospholipids demonstrate that the insertion depth of pAHNAK follows the same trend (PS˃PE˃PC). The second model membrane used is lipid bilayers with which the affinity of pAHNAK for phospholipid polar head groups has specifically been evaluated by solid state ³¹P nuclear magnetic resonance (NMR). These NMR studies confirm the previously observed preference trend of pAHNAK at 37 °C for the different polar head groups. The membrane binding of S100A10 was then studied according to the same strategy as pAHNAK. The results of the tensiometry show that S100A10 prefers to interact with unsaturated phospholipids bearing PE or PS polar head groups, and especially polyunsaturated ones containing long fatty acyl chains. Ellipsometric experiments suggest that S100A10 follows the order of insertion PC> PE> PS, which could be explained by a change in orientation of the protein. Moreover, NMR results suggest that, at 20 and 37 °C, S100A10 could partially insert into the membrane near the PS polar head group. All of our research demonstrates that, in a physiological environment of 37 °C, pAHNAK and S100A10 can probably interact with monounsaturated phospholipids containing a negatively charged polar head group. However, pAHNAK will tend to insert into the acyl chains while S100A10 would insert partially near the polar head group of phospholipids. This project has thus made it possible to develop knowledge on the membrane binding of the S100A10 protein and of pAHNAK as well as to provide new hypotheses regarding the role of PS in membrane repair. In addition, the continuation of this work will lead to potentially identify the conditions leading to a modification of the membrane binding of these proteins, and possibly to a loss of function. Thus, the knowledge developed in this thesis allows to improve our understanding of the membrane binding of S100A10 as well as of the C-terminal segment of AHNAK in order to better determine their roles in membrane repair, as well as in other physiological mechanisms in which these proteins are involved.

Ce mémoire de maîtrise se focalise sur l'influence du cholestérol sur l'interaction de la protéine S100A10 avec les membranes cellulaires, dans le contexte de la macropinocytose. Ce processus, essentiel à la survie cellulaire, permet l'ingestion de liquides extracellulaires et joue un rôle clé dans la régulation de fonctions cellulaires critiques telles que l'immunité, la migration cellulaire et la signalisation. Il est caractérisé par sa capacité à permettre aux cellules de s'adapter rapidement aux changements environnementaux en ingérant des nutriments et en répondant à des stimuli variés. Ce mémoire s'est concentré à décortiquer le rôle spécifique du cholestérol sur la liaison membranaire de la protéine S100A10. L'accent a, dans un premier temps, été mis sur l'optimisation de la surexpression et la purification de cette protéine, par le biais d'approches méthodologiques rigoureuses. Ces efforts ont permis de sonder en profondeur les interactions entre cette protéine et différents constituants des membranes cellulaires. La technique de la tensiométrie de surface a été particulièrement révélatrice, dévoilant l'influence significative de la présence et de la concentration du cholestérol sur la liaison de la S100A10 avec divers phospholipides membranaires. En complément, les isothermes de compression ont permis de dévoiler comment le cholestérol modifie la compressibilité et la stabilité des monocouches lipidiques. Ces données ont mis en évidence l'importance de l'architecture membranaire dans les mécanismes cellulaires impliquant la protéine S100A10. En somme, ce mémoire révèle que la modulation des interactions entre la S100A10 et les phospholipides par le cholestérol est un processus complexe, pouvant avoir des répercussions directes sur la macropinocytose. Les résultats de cette étude apportent une contribution significative à la compréhension des mécanismes régissant le comportement des membranes biologiques. / This master's thesis is centered on the influence of cholesterol on the interaction of the S100A10 protein with cellular membranes, in the context of macropinocytosis. This process, essential for cellular survival, allows the ingestion of extracellular fluids and plays a key role in regulating critical cellular functions such as immunity, cell migration, and signaling. It is characterized by its ability to allow cells to quickly adapt to environmental changes by ingesting nutrients and responding to various stimuli. This master's thesis focused on dissecting the specific role of the cholesterol in the membrane binding of the S100A10 protein. Initially, the priority was placed on optimizing the overexpression and purification of this protein, using rigorous methodological approaches. These efforts enabled an in-depth probing of the interactions between this protein and different constituents of cellular membranes. The technique of surface tensiometry was particularly revealing, uncovering the significant influence of the presence and concentration of cholesterol on the binding of S100A10 to various membrane phospholipids. Additionally, compression isotherms revealed how cholesterol modifies the compressibility and stability of lipid monolayers. These findings highlighted the importance of membrane architecture in cellular mechanisms involving the S100A10 protein. In summary, this thesis reveals that the modulation of interactions between S100A10 and phospholipids by cholesterol is a complex process, which can have direct repercussions on macropinocytosis. The results of this study make a significant contribution to understanding the mechanisms governing the behavior of biological membranes.

Développer de nouvelles méthodes pour l'étude des interactions entre les membranes cellulaires et diverses molécules bioactives telles que des peptides, des protéines ou des médicaments est d’une grande importance. Ces interactions sont primordiales dans l’activité de ces composés et leur meilleure compréhension pourrait permettre, entre autres, la mise au point de nouveaux médicaments, l’amélioration de leur efficacité et la diminution de leur toxicité. La spectroscopie RMN des solides est une technique de choix pour l’étude de telles interactions. Plus spécifiquement, l’utilisation de sondes membranaires est courante et permet d’accéder à de nouvelles expériences. Le projet de thèse principal porte sur la synthèse et l’étude de phospholipides monofluorés pour leur validation comme sonde membranaire modèle en RMN des solides. Le fluor possède de nombreuses caractéristiques chimiques et spectroscopiques d’intérêt pour son utilisation pour l’étude de complexes de biomolécules en spectroscopie RMN. La présente thèse rapporte d’abord les travaux de synthèse de trois nouveaux analogues monofluorés de la dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), ayant un atome de fluor sur la chaîne acyle en position 2 du glycérol, dans le but de mimer les membranes eucaryotes. L’étude des propriétés de ces trois nouveaux F-DMPC, ainsi que de trois dérivés synthétisés antérieurement, réalisée principalement en spectroscopie infrarouge et en RMN des solides, est aussi présentée. Dans l’ensemble, les résultats ont montré que l’incorporation d’un atome de fluor à la DMPC induit des perturbations significatives, mais que des mélanges F-DMPC/DMPC composés d’au maximum 25% de phospholipides monofluorés se comportent de façon similaire aux membranes de DMPC. Afin de valider ce nouveau modèle, l’orientation de deux peptides antimicrobiens au comportement connu a été estimée dans des membranes contenant 25% de F-DMPC. Pour tous les F-DMPC, la RMN de l’azote-15 a montré que l’orientation des peptides n’était pas affectée par la présence de DMPC monofluorée. De tels mélanges pourraient ainsi être utilisés comme sonde membranaire pour l’étude d’interactions entre ces membranes et différentes molécules bioactives par RMN des solides. La thèse présente aussi le développement d’une méthodologie de synthèse flexible de phosphatidylglycérols. Puisque des chaînes acyle identiques ou différentes et de longueur variée peuvent être incorporées, cette méthodologie permettra d’accéder aux F-DMPG en vue de mimer les cellules procaryotes. Le second projet de thèse porte sur l’étude de nouveaux peptides modèles afin de mettre au point un outil pour évaluer l’épaisseur des membranes biologiques. Une série de peptides analogues au peptide antimicrobien synthétique MSI-103 ayant différentes longueurs, appelés KIAn, a d’abord été synthétisée et étudiée afin d’étudier l’importance du concept de décalage hydrophobe dans la formation de pores transmembranaires et l’activité des peptides. Cette étude a démontré que la longueur est un facteur clé dans l’activité de ces peptides : ils doivent être suffisamment longs pour traverser l’épaisseur hydrophobe des bicouches lipidiques. Toutefois, dans le design de la série KIAn, les peptides plus longs sont davantage chargés et ce facteur peut aussi affecter la tendance observée. Cette thèse rapporte donc les travaux menés afin de vérifier l’influence de la charge cationique des peptides KIAn dans leur activité. Deux nouvelles séries de peptides de longueur variable (14 à 28 acides aminés) et de charge globale constante (+7), appelées KIA(7)n et KIXAn, ont été synthétisées et analysées par différentes techniques (dichroïsme circulaire, tests biologiques, spectroscopie de fluorescence, RMN de l’azote-15). Cette étude a permis de confirmer l’importance du principe de décalage hydrophobe et l’absence d’effet dû à la charge des peptides dans leur activité. Elle a ainsi permis de valider l’utilisation de ces peptides comme règle moléculaire afin d’estimer l’épaisseur des bicouches lipidiques. / The development of new methodologies to investigate interactions between cell membranes and various bioactive molecules such as peptides, proteins or drugs is of primary importance. These interactions are essential for the activity of those compounds and a better understanding would allow, among others, the development of new drugs, the improvement of their efficiency and the reduction of their toxicity. Solid-state NMR spectroscopy is a method of choice to study membranes – molecules interactions. Specifically, using membrane probes is common and allows to access new experiments. The main project within this thesis focuses on the synthesis and study of monofluorinated phospholipids for their validation as model membranes probe in solid-state NMR. Fluorine possesses numerous chemical and spectroscopic characteristics of interest for its use to study biomolecule complexes in NMR spectroscopy. This thesis reports the synthesis of three new monofluorinated analogs of dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), having one fluorine atom located on the acyl chain at position 2 of the glycerol, with the goal of mimicking eukaryotic membranes. Property studies of these three new F-DMPCs and of three previously synthesized derivatives are also presented. Overall, the results have shown that the incorporation of a fluorine atom into DMPC perturbs significantly the membrane properties, but that F-DMPC/DMPC mixtures containing 25% F-DMPC or less behave in a similar way to DMPC membranes. To validate this new model, the orientation of two antimicrobial peptides having a known behaviour in the presence of DMPC membranes has been estimated in F-DMPC/DMPC (1/3) membranes. For all F-DMPC, 15N NMR has shown that peptide orientation is not affected by the presence of monofluorinated DMPC. Such mixtures can therefore be used as membrane probes to study interactions between them and various bioactive molecules with solid-state NMR. This thesis also presents the development of a new and flexible synthetic methodology of phosphatidylglycerols. As identical or different acyl chains with various lengths can be incorporated, this methodology will allow access to F-DMPG in order to mimic prokaryotic cell membranes. The second thesis project focuses on the study of new model peptides in order to develop a new tool to evaluate biological membrane thickness. A series of peptides analogues to the antimicrobial synthetic peptide MSI-103, having various lengths and called KIAn, have first been synthesized and studied to investigate the importance of the hydrophobic mismatch in the formation of pores and in the activity of these peptides. This study showed that peptide length is a key factor in their activity: the length must be sufficient to span the hydrophobic thickness of the lipid bilayers. However, the design of KIAn peptides implies that longer peptides are more charged and this factor can also influence the observed tendency. Therefore, this thesis reports our study aimed at verifying the influence of global cationic charge of KIAn peptides on their activity. Two new peptide series of various lengths (14 to 28 amino acids) and of constant global charge (+7), called KIA(7)n and KIXAn, have been synthesized and analyzed with several techniques (circular dichroism, biological tests, fluorescence spectroscopy and 15N NMR). This study confirmed the importance of hydrophobic mismatch and the absence of charge effect in the activity of these peptides. It also validated the use of these peptides as molecular rulers to estimate the hydrophobic thickness of lipid bilayers.

Depuis la vulgarisation de certains concepts comme la globalisation ou la mondialisation, le secteur agroalimentaire a connu une expansion fulgurante et un engouement incessant pour la commercialisation d’aliments entre les peuples à travers le monde. Ce phénomène, contribuant significativement à l’accroissement économique des marchés, n’est toutefois pas sans risque. Pendant ce temps, les dangers de sources microbiologiques, notamment les pathogènes, sont véhiculés par des matrices alimentaires et voyagent d’un pays à l’autre, ce qui augmente le risque de contamination pour les consommateurs. Conséquemment, on assiste à une augmentation des cas d’allergies alimentaires, d’intoxications ou de toxi-infections alimentaires dont les agents étiologiques peuvent venir des quatre coins du monde. À cet effet, les organismes réglementaires comme l’Agence canadienne d’inspection des aliments (ACIA), Santé Canada, la Food and Drug Administration (USFDA) américaine ou d’autres autorités internationales compétentes comme l’Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture(FAO) et l’Organisation mondiale de la santé (OMS) multiplient leurs efforts afin de mettre en place des normes et politiques réglementaires pour aider l’industrie agroalimentaire à renforcer les contrôles depuis la fabrication jusqu’à la commercialisation des aliments. Les dangers microbiologiques venant de pathogènes comme Bacillus cereus demeurent un risque de santé publique majeur qu’il faut maîtriser afin d’assurer la protection des consommateurs. Bien que de nombreuses techniques de contrôle (e.g., additifs alimentaires, haute pression hydrostatique, rayonnements ionisants, procédés thermiques, etc.) ont été développées et utilisées pour assurer la salubrité et l’innocuité des aliments, dans certains cas cela n’a pas permis de produire des aliments totalement exempts de bactéries responsables de la dégradation/altération des aliments et de pathogènes causant des intoxications alimentaires comme c’est le cas avec B. cereus. En effet, cette bactérie pathogène est ubiquitaire, aérobie et anaérobie facultative. Elle est capable de produire dans une grande variété d’aliments et d’ingrédients comme les épices des spores très résistantes ainsi que différents types de toxines pouvant causer la diarrhée, la nausée, le vomissement et même la mort. Dans cette optique, et vue la grande difficulté à maitriser la contamination des aliments causée par ce pathogène, l’objectif général de cette recherche a été d’utiliser la technologie d’électro-activation, une branche appliquée de l’électrochimie qui s’intéresse notamment à la réactivité des solutions aqueuses, comme méthode alternative et potentiellement efficace pour lutter contre B. cereus afin de produire des aliments plus sécuritaires avec une grande valeur nutritionnelle et organoleptique. Pour y parvenir, des solutions aqueuses de sels d’acides organiques de lactate de calcium, d’ascorbate de calcium et de leur mélange équimolaire ont été électro-activées dans un réacteur soumis à un courant électrique continu avec des intensités de l’ordre de 250, 500 et 750 mA pendant un maximum de temps de 30 minutes afin de produire les acides organiques conjugués respectifs; de l’acide lactique et de l’acide ascorbique. Dans la première partie de ce travail de recherche, les caractéristiques physicochimiques (e.g., pH, acidité titrable, pKa) des solutions électro-activées (SÉA) ont été étudiées et leurs profils moléculaires comparés à ceux d’acides standards respectifs en utilisant différentes techniques (e.g., FTIR, HPLC, DSC, DPPH), ce qui a permis de confirmer la production d’acides organiques conjugués respectifs des sels utilisés. Ces SÉA avaient un pH très bas, une acidité titrable élevée, notamment pour l’ascorbate de calcium et le mélange. En plus, une activité antioxydante élevée a été observée pour la solution électro-activée d’ascorbate de calcium et du mélange. Dans la deuxième partie de l’étude, les SÉA traitées à 250, 500 et 750 mA pendant 10, 20 et 30 min ont été retenues pour être mises en contact avec des cellules végétatives de Bacillus cereus ATCC 14579 en conditions modèles (contact direct) afin d’évaluer leurs effets antimicrobiens sur ce pathogène. Les cellules ont été testées en contact direct avec les SÉA pendant 5, 30 et 60 secondes. Le même traitement a été également réalisé par contact direct avec des acides organiques standards (lactique, ascorbique) pendant 5, 30, 60, et 120 secondes afin de faire des comparaisons. Les SÉA et les acides organiques standards correspondants avaient les mêmes valeurs d’acidité titrable. Par la suite, les cellules ont été observées au microscope (coloration au bleu de méthylène et fluorescence) afin d’évaluer les effets inhibiteurs/destructeurs de ces solutions. Également, les SÉA ont été diluées avec de l’eau distillée pour obtenir des solutions possédant 10 à 90% de l’acidité titrable (force) initiale pour être ensuite testées contre les cellules de B. cereus. Les résultats ont démontré que toutes les SÉA avaient une grande efficacité contre les cellules végétatives de B. cereus. Également, même à des taux de dilution représentant en moyenne 20% de la force initiale des SÉA, l’effet antimicrobien était très élevé pour les différentes solutions. L’observation de B. cereus au microscope a permis de confirmer les effets létaux des SÉA. Dans ce volet avec des cellules végétatives de B. cereus, l’efficacité des SÉA a été estimée à une réduction de 4–7 log UFC/mL. En plus, il a été démontré que le pouvoir antibactérien des SÉA était nettement plus élevé que celui des acides lactiques et ascorbiques standards (conventionnels). Dans la troisième partie de cette étude, des solutions électro-activées de lactate de calcium, d’ascorbate de calcium et de leur mélange équimolaire à 750 mA pendant 30 minutes ont été retenues et utilisées contre des spores de Bacillus cereus ATCC 14579 en conditions modèles et dans du saumon Atlantique frais. Les spores traitées ont été analysées à l’aide de microscopes électroniques à balayage et à transmission pour évaluer les effets sporicides des SÉA. Les résultats obtenus ont clairement montré un grand pouvoir sporicide des SÉA utilisées sur les spores de B. cereus avec une réduction de 7 à 9 log en utilisant une population initiale de spores de 10⁹ UFC/mL, dépendamment des conditions évaluées; à savoir : en contact direct (2–30 min), dans du saumon utilisé comme matrice alimentaire(2–7 min), ainsi qu’en combinaison avec de la chaleur modérée de 60, 70, 80 et 90 °C pendant 0.5–2 min. Également, il a été observé que la capacité sporicide des SÉA augmentait avec la température et le temps de contact. La microscopie électronique à balayage et à transmission a permis de constater que les SÉA pouvaient provoquer la destruction totale des cellules de B. cereus, et notamment la perforation de la membrane (cortex et manteau), ainsi que le reflux de différentes composantes de la structure des spores de B. cereus. Tenant compte des résultats obtenus dans cette étude, nous pouvons conclure que les solutions électro-activées à base de lactate de calcium, ascorbate de calcium et leur mélange, notamment celles électro-activées à 750 mA–30 min, pourraient être d’une grande contribution afin de renforcer la capacité de l’industrie alimentaire à lutter contre B. cereus ATCC 14579 et de produire des aliments plus sécuritaires pour le consommateur. / Since the popularization of concepts like globalization, the agri-food sector has experienced a huge expansion and a ceaseless craze for the marketing of food between the peoples worldwide. This phenomenon, contributing significantly to the economic growth of the markets, is not without risk, however. Meanwhile, microbiological hazards, including pathogens, are carried through food matrices and travel from one country to another, increasing the risk of contamination for consumers. Consequently, we are also witnessing an increase in cases of food allergies, foodborne illnesses and outbreaks, with etiological agents coming from all over the world. Thus, regulatory organisms such as Canadian Food Inspection Agency (CFIA), Health Canada, United States Food and Drug Administration (USFDA) or competent international authorities like Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) and World Health Organization (WHO) are stepping up efforts to put in place regulatory standards and policies in order to help the food industry to strengthen controls from the processing to the marketing of foods. Microbiological hazards from pathogens like Bacillus cereus remain a major public health risk that must be controlled in order to ensure consumers protection. Although many techniques of control (e.g., food additives, high hydrostatic pressure, ionizing radiation, thermal processes, etc.) have been developed and used to ensure the safety and security of foods, in some instance this has not allowed to produce food products that are completely free of bacteria responsible for degradation/spoilage of food and pathogens causing food poisoning as is the case with B. cereus. Indeed, this pathogenic bacterium is ubiquitous, aerobic and facultative anaerobic. It is able to produce, in a wide variety of foods and ingredients such as spices, highly resistant spores as well as different types of toxins that can cause diarrhea, nausea, vomiting, and even death. In this context, and given the great difficulty in controlling the contamination of food caused by this pathogen, the general objective of this research was to use the electro-activation technology, an applied branch of electrochemistry which is particularly interested in the reactivity of aqueous solutions, as an alternative and potentially effective method to fight against B. cereus in order to produce safer foods with high nutritional and organoleptic values. To achieve this, aqueous solutions of organic acid salts of calcium lactate, calcium ascorbate and their equimolar mixture were electroactivated in a reactor subjected to a direct electric current with intensities of 250, 500 and 750 mA for a maximum time of 30 minutes in a bid to produce the respective conjugated organic acids, lactic acid and ascorbic acid. In the first part of this research work, the physicochemical characteristics (e.g.,pH, titratable acidity, pKa) of the electro-activated solutions (EAS) were studied and their molecular profiles compared to those of respective standard acids using different techniques (e.g., FTIR, HPLC, DSC, DPPH), which helped to confirm the production of conjugated organic acids from the respective salts used. These EAS had a very low pH, a high titratable acidity, particularly for the calcium ascorbate and the mixture. In addition, a high antioxidant activity was observed for the electro-activated calcium ascorbate solution and the mixture. In the second part of the study, the EAS treated at 250, 500 and 750 mA for 10,20 and 30 min were selected to be brought into contact with vegetative cells of Bacilluscereus ATCC 14579 under model conditions (direct contact) in order to evaluate their antimicrobial effects on this pathogen. The cells were tested in direct contact with the EAS for 5, 30 and 60 seconds. The same treatment was also carried out by direct contact with standard organic acids (lactic, ascorbic) for 5, 30, 60, and 120 seconds in order to make comparisons. The EAS and the corresponding standard organic acids had the same titratable acidity values. There after, the cells were observed under microscope (Methylene blue and fluorescence) to evaluate the inhibitory / destructive effects of these solutions. Also, the EAS were diluted with distilled water to obtain solutions with 10 to 90% of the initial titratable acidity (strength) to be tested against B. cereus cells. The results demonstrated that all the EAS made were highly effective against the vegetative cells of B.cereus. Also, even at dilution rates averaging 20% of the EAS initial strength, the antimicrobial effect was very high for the different solutions. In addition, the microscopic observation of B. cereus has confirmed the lethal effects of EAS. In this part with the vegetative B. cereus cells, the efficacy of the EAS was estimated to a reduction of 4–7 log CFU/mL. In addition, the antibacterial power of the EAS has been shown to be significantly higher than that of the standard (conventional) lactic and ascorbic acids. In the third part of the study, electro-activated solutions of calcium lactate, calcium ascorbate and their equimolar mixture at 750 mA for 30 min were selected and used against the spores of Bacillus cereus ATCC 14579 under model conditions and in fresh Atlantic salmon. The treated spores were analyzed using scanning and transmission electron microscopes to evaluate the sporicidal effects of EAS. The results obtained clearly showed a great sporicidal power of the EAS used on B. cereus spores with a reduction of 7 to 9 log using an initial spore population of 10⁹ CFU/mL, depending on the conditions assessed; namely: in direct contact (2–30 min), in salmon used as a food matrix (2–7 min), as well as in combination with moderate heat of 60, 70, 80 and 90 ℃ for 0.5–2 min. Also, it was observed that the sporicidal capacity of the EAS increased with temperature and contact time. Scanning and transmission electron microscopy showed that the EAS could cause the total destruction of B. cereus cells, including perforation of the membranes (cortex and coat), as well as the reflux of different components of the structure of B. cereus spores. Taking into account the results obtained in this study, we can conclude that the electro-activated solutions made with calcium lactate, calcium ascorbate and their mixture, especially those electro-activated at 750 mA–30 min, could be of a great contribution to reinforce the capacity of the food industry to control B. cereus ATCC 14579 and produces safer foods for the consumer.

La transfection est le processus de transfert de gènes (ADN) dans des cellules. L'utilisation des plasmas froids à la pression atmosphérique est un excellent vecteur pour la transfection de gènes. Cela peut conduire à une perméabilisation temporaire de la membrane cellulaire permettant ainsi le processus de transfection de gènes, dans lequel l'ADN et les cellules sont exposées aux flux des espèces actives du plasma (électrons, ions et radicaux neutres). Cependant beaucoup de questions restent sans réponse notamment sur les mécanismes de transfection par plasma, en particulier de formation de pores et de perméabilisation de la membrane par interactions avec les espèces actives du plasma. Ainsi, nous avons développé un modèle Monte Carlo simulant la formation de pores de quelques nm de largeur sous l'effet d'un microplasma d'air. Ce model nécessite a priori des données d'entrées sur la densité des espèces chargées et la température du gaz et des électrons. C'est pourquoi nous avons aussi effectué une caractérisation expérimentale par spectroscopie d'émission optique OES de la micro décharge couronne. On a estimé les températures rotationnelles de plusieurs espèces variant entre (700K-2350K) même si dans nos conditions de plasma hors équilibre la température du gaz demeure ~300K. Les variations spatiales de la température vibrationnelle Tvib et des électrons Te le long de l'espace inter-électrode (de la pointe vers l'électrode de masse) ont aussi été estimées (Tvib:3000K-6500K et Te:6.75 eV-3.4eV). Les densités des ions et des électrons ont été déterminées et valent environ 1015 cm-3. Par ailleurs, sachant qu'il n'existe dans la littérature aucune modélisation consacrée à la perméabilisation de la membrane et la formation de pore par interactions avec les espèces actives du plasma, nous avons développé pour la première fois dans la littérature un modèle spécifique de simulation Monte Carlo pour la poration. Chaque espèce du plasma (électrons, ions, neutres radicaux) est considérée comme une macro-espèce (ou super-particule) représentant un grand nombre de particules. La proportion des espèces du plasma arrivant sur la membrane est estimée à partir de leurs flux, calculés à l'aide d'un modèle de cinétique réactionnelle et par mesures spectroscopiques. La membrane est supposée comme une simple structure multicouche de phospholipides et protéines. Les interactions avec les couches membranaires sont considérées comme étant des super-processus (recombinaison, réflexion, activation, ouverture). Une probabilité d'occurrence de chacun de ces super-processus est assignée à chaque super-particule sur la base d'une étude paramétrique. Le but est d'évaluer les effets des paramètres de simulation initiaux ainsi que l'effet des probabilités d'occurrence de chaque processus sur la formation de pores. Plusieurs résultats importants ont été obtenus. Les électrons jouent un rôle principal sur l'activation et l'ouverture des sites dus à leur forte anisotropie dans la direction avant. Malgré les faibles énergies, proche de celle du gaz, des ions et des radicaux, leur processus de réflexion est déterminant pour élargir et approfondir les dimensions des pores. Il a été montré que le nombre initial de particules NP est le paramètre qui contrôle le plus efficacement la formation de pores. De plus, nous avons observé une corrélation directe entre NP et la durée d'exposition de la membrane cellulaire au plasma. Dans les conditions actuelles de simulation, on a obtenu une dynamique de formation de pores avec des dimensions (diamètres~10nm) compatibles pour la transfection de gènes. Les résultats de simulation Monte Carlo ont été qualitativement validés par une comparaison préliminaire avec les mesures des taux de transfection d'ADN et de survie de cellules fibroblaste de souries. La méthode de Monte Carlo développée dans ce travail représente un outil très prometteur pour une meilleure compréhension des mécanismes de transfection de gènes par plasma. / Gene transfection is a technique of deliberately introducing DNA into cells through the membrane. The cold atmospheric plasma CAP is potentially a new alternative, safe and damage-free technique. It can lead to a transient permeabilization of the cell membrane allowing processes of gene transfection in which DNA and cells are both exposed to fluxes of active plasma species (electrons, ions, and neutral radicals). The mechanisms of more particularly membrane poration are far to be clear and controlled. Therefore, the aim of this thesis is to numerically study the mechanisms of plasma-induced membrane permeabilization using a specific micro-air plasma. More precisely, is to develop and exploit a specific Monte Carlo poration model. This model is aimed to simulate the pore formation of few nm of width through cell membranes when irradiated by micro-air plasma. This developed model requires a prior input data on the density of charged particles and the temperature of gas and electrons. Thus, an experimental characterisation by OES of the micro-air corona discharge is performed. Rotation temperature was determined (between 700K to 2350K) even though under our non-equilibrium conditions Tg remains ~300K. OES also has given the space variation from the high voltage tip to the grounded plate of vibration temperatures (between 3000K up to about 6500K) and Te (about 6.75 eV down to 3.4 eV near the plate). A magnitude around 1015cm-3 for the electron and ion densities have been also determined. Moreover, knowing that there are no literature simulations devoted to membrane permeabilization and pore formation when impacted by plasma actives species, we developed for the first time in literature a specific Monte Carlo poration model. In this framework, we assumed each plasma species (electrons, ions, and neutral radicals) as a super-particle grouping a large number of particles. The species fluxes were estimated from a plasma reaction kinetic model and OES study. The membrane layers were assumed as a simple membrane model superposing four layers of phospholipids and proteins. Each layer was constituted by a succession of super-sites subjected to specific super-processes (recombination, reflection, activation of a site, opening, etc). For an accurate exploitation of our model, the estimation of the probability of occurrence of the whole considered super-processes is absolutely necessary. Thus, a large parametric study is conducted. The aim is to evaluate the effects of the initial simulation parameters as well as the magnitude of the occurrence probabilities of each reaction process on pore formation.

No description available.