Les infections ostéo-articulaires à Staphylococcus aureus sont des pathologies fréquentes dont les conséquences peuvent aller de la simple altération cellulaire à un retard de la réparation osseuse ou une réponse inflammatoire excessive. Afin d’étudier ce phénomène, nous avons, dans un premier temps, développé deux modèles d’infections in vitro faisant interagir Staphylococcus aureus et des cellules osseuses primaires issues d’explants chirurgicaux humains. Ces cellules ont été préalablement cultivées dans un milieu standard ou un milieu ostéogénique afin d’obtenir 2 populations à des stades de maturation différents. L’étude de l’internalisation de Staphylococcus aureus, de la mortalité cellulaire et de la production de médiateurs inflammatoires pour ces 2 populations a permis d’établir si l’impact de Staphylococcus aureus variait en fonction de la maturation cellulaire. Dans un second temps, nous avons étudié l’impact de Staphylococcus aureus sur des cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical. En effet, dans le cadre d’une régénération osseuse en site infecté, les cellules souches mésenchymateuses pourraient être amenées à interagir avec Staphylococcus aureus. Nous avons donc caractérisé la capacité de ces cellules à internaliser Staphylococcus aureus, à survivre face à l’infection et à produire des médiateurs inflammatoires dans notre modèle in vitro d’infection aiguë. Ce projet nous a permis de valider nos modèles d’infection in vitro et de caractériser l’impact de Staphylococcus aureus sur différentes cellules du microenvironnement osseux, donnant ainsi de nouvelles pistes pour le développement de stratégies pour la lutte antibactérienne et l’ingénierie tissulaire osseuse. / Staphylococcus aureus-related bone and joint infections are common diseases whose consequences can range from simple cell damage to delayed bone repair or excessive inflammatory response. To study this phenomenon, we have developed two models of in vitro infection with Staphylococcus aureus and primary bone-forming cells derived from human surgical explants. These cells have been previously cultured in a standard medium or osteogenic medium to obtain two populations at different stages of maturation. The study of Staphylococcus aureus internalization, cell death and production of inflammatory mediators in these 2 populations allowed us to establish whether the impact of Staphylococcus aureus varied depending on cell maturation. We also studied the impact of Staphylococcus aureus on mesenchymal stem cells derived from umbilical cord. In case of bone regeneration in infected site, mesenchymal stem cells may have to interact with Staphylococcus aureus. Therefore, we characterized the ability of these cells to internalize Staphylococcus aureus, to survive against the infection and to produce inflammatory mediators in our in vitro model of acute infection. This project allowed us to validate our in vitro infection models and to characterize the impact of Staphylococcus aureus on different cells in the bone microenvironment, providing new approaches for the development of antibacterial strategies and bone tissue engineering.

Abstract Bone tissue engineering has become a rapidly expanding research area because it offers a promising new approach for bone repair and regeneration. Compared to traditional autograft and allograft procedures, bone tissue engineering techniques based on the use of scaffolding materials in combination with autogenous stem cells can eliminate problems of donor site morbidity associated with the harvest of bone tissue, and its short supply. Clearly, the choices of material as well as a scaffold design that enhance bone regeneration are major challenges in the tissue engineering approach. Fibers in the micro-range in combination with textile-based technologies are consider as potential routes for the production of complex scaffolds since they can be used to generate a wide range of morphological structures and geometrically varied structures with high precision. Therefore in this thesis the specific objects were to: (i) develop a biocompatible composite fiber from poly(lactic acid) (PLA) and hydroxyapatite (HA) by melt spinning, (ii) design a 3D textile scaffold utilizing weaving and (iii) evaluate the scaffolds’ performance as a bone substitute material in vitro. In the present study PLA/HA composite fibers were successfully produced, and found to possess sufficient mechanical strength even at high loading concentrations (i.e. 20wt %), to be useful in a textile process. In addition, the material was shown to be biocompatible and the presence of HA in the PLA composite significantly enhanced the initial cell attachment. In a 3D woven scaffold, bone marrow derived human mesenchymal stem cells (hMSCs) differentiated into osteoblasts and mineralized bone formation in vitro was observed through-the-thickness of the scaffold. Taken together, these results indicate the potential feasibility of PLA/HA composite fiber in a 3D woven scaffold for use as a bone substitute material in tissue engineering applications. / Tiivistelmä Luupuutosten korvaaminen kudosteknologisesti on kehittynyt nopeasti ja tutkimustulokset tarjoavat lupaavia mahdollisuuksia tuottaa uutta luuta luupuutosalueelle. Perinteisiin potilaan omasta luusta tehtyihin luusiirteisiin ja pankkiluusiirteisiin verrattuna potilaan omat kantasolut voivat vähentää ongelmia, joita ovat siirremateriaalin rajallinen saatavuus ja vieraan kudoksen aiheuttamat reaktiot. On tärkeä etsiä hyviä materiaaleja, joista voidaan valmistaa sellaisia kolmiulotteisia (3D) rakenteita, joilla tehostetaan luun paranemista ja uuden luun muodostumista. Kutomalla tuotetut tukirakenteet mahdollistavat kantasolusiirteille kolmiulotteisuuden, jota voidaan säädellä monipuolisesti ja tarkasti. Tämän väitöstutkimuksen tarkoituksena oli: (i) kehittää bioyhteensopiva kuitu maitohappopolymeeristä poly lactic acid (PLA) ja hydroksiapatiitista (HA) kuituekstruusiolla, (ii) suunnitella ja kutoa tästä kuidusta 3D tekstiilirakenne, ja (iii) tutkia sen toimivuus ja ominaisuudet luunmuodostusta tukevana materiaalina soluviljelyolosuhteissa. Tämä tutkimus osoittaa, että PLA kuitua voidaan seostaa hydroksiapatiitilla, ja PLA/HA kuidut ovat mekaanisesti kestäviä sisältäessään jopa 20 painoprosenttia hydroksiapatiittia. Siten kuidut ovat tekstiilin valmistuksessa käyttökelpoisia. Lisäksi materiaali osoittautui bioyhteensopivaksi, ja hydroksiapatiitti paransi solujen tarttumista PLA kuituun viljelyn alkuvaiheessa. Ihmisen luuytimestä peräisin olevat sidekudoksen kantasolut (hMSCs) erilaistuivat soluviljelmässä luuta muodostaviksi soluiksi eli osteoblasteiksi, ja tuottivat mineralisoitunutta luun väliainetta kautta koko kudotun tukirakenteen. Johtopäätöksenä on, että PLA/HA yhdistelmäkuitua voidaan kutoa kolmiulotteiseksi tukirakenteeksi, ja sitä on mahdollista käyttää apuna korvattaessa luupuutoksia kudosteknologian keinoin.

The intervertebral disc (IVD), situated between adjoining vertebrae, consists of the gelatinous nucleus pulposus (NP) in the centre surrounded by the tougher annulus fibrosus (AF). Its main roles are to distribute loads and to act as joints. With aging, degenerative disc disease (DDD) occurs due to an imbalance in anabolic and catabolic events in the IVD, which results in a loss of function. Lower back pain (LBP) affects 84% of people at some point in their lifetime and is strongly associated with DDD. Current LBP treatments have limited long term efficacy and are symptomatic rather than curative. Cell-based therapies are regarded to hold great potential for the treatment of DDD as it has been hypothesised that they could regenerate the damaged tissue and alleviate LBP. A number of natural and synthetic biomaterials have been investigated as NP tissue engineering scaffolds with varying results. In this study, a self assembling peptide hydrogel (SAPH) was investigated for its potential as a cell carrier and/or scaffold for NP tissue engineering. SAPHs display the advantages of natural polymer hydrogels such as biocompatibility and biodegradability whilst combining the advantages of synthetic materials such as controlled structural and mechanical propertiesCharacterisation determined that the SAPH nanofibrous architecture had features that were of similar scale to extracellular matrix (ECM) components of the human NP. The mechanical properties of the SAPH could be optimised to closely match the native tissue. The system could shear thin and self-heal making the system ideally suited to delivery via minimally invasive procedure. The three dimensional (3D) culture of bovine NP cells (bNPCs) in the SAPH demonstrated that the NP phenotype could be restored after de-differentiation during monolayer culture. Gene expression results demonstrated that ‘traditional’ and ‘novel’ NP markers were highly expressed throughout in vitro culture. Cell viability was high, cell population remained stable and bNPCs adopted the characteristic rounded morphology of native NPCs. Finally, type II collagen and aggrecan, the main ECM components of the NP, were deposited with increasing production over culture period. Growth differentiation factor 6 (GDF-6) has been identified as the most promising current growth factor for inducing discogenic differentiation from human bone marrow mesenchymal stem cell (h-BMMSCs). After samples were stimulated with GDF-6, gene expression results confirmed that a NP-like phenotype could be induced with high expression of ‘traditional’ and ‘novel’ NP markers. Cell viability was high, cell population remained stable and NP associated ECM components were deposited with cells displaying a rounded morphology. Interestingly, when h-BMMSCs were cultured without GDF-6, it was strongly suggested that spontaneous discogenic differentiation occurred after culture in the SAPHs as ‘traditional’ and ‘novel’ NP markers were highly expressed, morphology was comparable to native NPCs and type II collagen and aggrecan were deposited extracellularly. If these findings were accurate then this is the first study to demonstrate that a NP-like phenotype could be induced from MSCs without use of an exogenous growth factor or a discogenic bioactive motif. Despite exciting and novel results, further work is required to confirm the potential of SAPHs for NP tissue engineering scaffolds.

Die jährliche Geweihregeneration der Cervidae ist einzigartiges Phänomen unter adulten Säugetieren. Rolf et al. konnten zeigen, dass dieser Prozess unter anderem von STRO-1+ mesenchymalen Stammzellen (MSZ) des Rosenstockperiosts ausgeht, deren Proliferation in der Regenerationsphase aktiviert wird. Ziel dieser Arbeit war es das Proliferationsverhalten dieser STRO-1+- und STRO-1- mesenchymalen Stammzellen/Progenitorzellen (MSZ) näher zu charakterisieren. Außerdem sollte die Expression der Yamanaka-Faktoren (c-Myc, Sox2, Nanog, Klf4, Oct4), welche von großer Bedeutung für die Aufrechterhaltung der stammzelltypischen Eigenschaften sind, untersucht werden. Die Gewebestücke des Rosenstockperiosts wurden parallel in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und Nonhematopoietic-Stem-Cell-Medium (NH-Medium) kultiviert. Bei Erreichen eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen mit Hilfe des Sortiersystems MACs nach dem Oberflächenmarker STRO-1 sortiert. Die Expression der Yamanaka-Faktoren wurde mit Hilfe von RT-PCR und Gelelektrophorese untersucht. Die Oct4-Expression in STRO-1+ MSZ wurde außerdem immunhistochemisch nachgewiesen. Dafür wurden die STRO-1+MSZ nach der Sortierung 24h, 28h, 72h, 96h und 144h kultiviert und das Oct4-Protein mit dem Fluoreszenzfarbstoff immunhistochemisch angefärbt. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt und die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Da Oct4 im Zytosol sowie in langen Zellfortsätzen, die wie Zell-zu-Zellverbindungen imponierten, detektiert wurde, sollte eine mögliche Übertragung von Oct4 untersucht werden. Dazu erfolgte die Ko-Kultivierung von STRO-1+MSZ mit Oct4-GFP-MEF (embryonalen Mausfibroblasten), in denen die GFP an einen Oct4-Promoter gekoppelt ist, und die Überwachung GFP-Expression. Im NH-Medium konnte eine höhere totale Zellzahl (3,5x) sowie eine signifikant höhere tägliche Wachstumsrate und eine höhere totale Anzahl von STRO-1+ MSZ generiert werden. Sowohl STRO-1+- also auch STRO-1 -MSC exprimieren die o.g. Transkriptionsfaktoren medien- und zeitabhängig. Die Fluoreszenzaufnahmen zeigten ein zeitabhängige Oct4-Expression in den STRO-1+ MSZ, insbesondere nach 48h und nach 96h. Zu diesen Zeitpunkten war das Protein nicht nur im Zellkern sondern auch im Zytoplasma und in den Zellfortsätzen bzw. Zell-zu-Zellverbindungen nachweisbar. Im Ko-Kultivierungsversuch stieg die intrazelluläre GFP-Expression sowie die Anzahl der GFP-positiven Zellen im Intervall zischen 24h-48h deutlich an. Die Ergebnisse demonstrieren das hohe Proliferationspotential der STRO-1+ und auch der STRO-1-MSZ, welches über einen langen Zeitraum hinweg aufrechterhalten werden konnte. Die Kultivierung in NH-Medium erwies sich dabei als vorteilhaft. Die Expression der Yamanaka-Faktoren konnte nachgewiesen werden. Die Oct4-positiven STRO-1+ MSZ sind in Lage über einen interzellulären Oct4-Transport die Oct4-GFP-Transkription in den Empfängerzellen zu initiieren. Die Beobachtungen führen zu der Schlussfolgerung, dass es bei der Geweihregeneration ebenfalls zu einer Übertragung von Oct4 von STRO-1+ MSC auf benachbarte Zellen kommen könnte, welches zu einer Dedifferenzierung in der Empfängerzelle führen könnte. Dies würde das schnelle Geweihwachstum erklären. Ob tatsächlich eine endogen induzierte Pluripotenz stattfindet muss jedoch in weiteren Studien untersucht werden.

Perivascular cells of microvascular niches are the prime candidates for being a reservoire of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells in many tissues and organs that could serve as a potential source of cells and a target of novel cell-based therapeutic approaches. In the present study, by utilising typical markers of pericytes (neuronal-glial antigen 2, NG2, a chondroitin sulphate proteoglycan) and those of MSCs (CD146 and CD105) and primitive pluripotent cells (sex-determining region Y-box 2, Sox2), the phenotypic traits and the distribution of murine and rat retinal perivascular cells were investigated in situ. Our findings indicate that retinal microvessels of juvenile rodents are highly covered by NG2-positive branching processes of pericytic (perivascular) cells that are less prominent in mature capillary networks of the adult retina. In the adult rodent retinal vascular bed, NG2 labeling is mainly confined to membranes of the cell body resulting in a pearl-chain-like distribution along the vessels. Retinal pericytes, which were identified by their morphology and NG2 expression, simultaneously express CD146. Furthermore, CD146-positive cells located at small arteriole-tocapillary branching points appear more intensely stained than elsewhere. Evidence for a differential expression of the two markers around capillaries that would hint at a clonal heterogeneity among pericytic cells, however, is lacking. In contrast, the expression of CD105 is exclusively restricted to vascular endothelial cells and Sox2 is detected neither in perivascular nor in endothelial cells. In dissociated retinal cultures, however, simultaneous expression of NG2 and CD105 was observed. Collectively, our data indicate that vascular wall resident retinal pericytes share some phenotypic features (i.e. CD146 expression) with archetypal MSCs, which is even more striking in dissociated retinal cultures (i.e. CD105 expression). These findings might have implications for the treatment of retinal pathologies.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die biologische Charakterisierung neuartiger nanostrukturierter und für die Knochenregeneration geeigneter Calciumphosphatzemente (CPC). Hierzu wurde ein aus α-Tricalciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat, gefälltem Hydroxylapatit und Calciumcarbonat bestehender CPC verwendet, der mit den Biomolekülen Cocarboxylase, Glucuronsäure, Weinsäure, Glucose-1-phosphat, Arginin, Lysin und Asparaginsäure-Natriumsalz modifiziert wurde. Ermittelt wurde dabei der Einfluss der Modifikationen auf die Proteinadsorption und die Biokompatibilität. In Vorversuchen wurden die Zementmodifikationen hinsichtlich ihrer Bindungskapazität für humane Serumproteine und für das knochenspezifische Protein Osteocalcin (OC) sowie hinsichtlich ihrer Eignung für die Adhäsion, Proliferation und osteogene Differenzierung von humanen fötalen Osteoblasten (hFOB 1.19) und humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dabei erwiesen sich die Modifikationen mit Cocarboxylase, Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz als besonders günstig. Mit diesen „Favoriten“ erfolgte eine detailliertere Analyse der Adsorption humaner und boviner Serumproteine sowie der knochen-spezifischen Proteine Osteocalcin, BMP-2 und VEGF. Dabei führte sowohl der Zusatz von Cocarboxylase, als auch der von Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz zu einer erhöhten Adsorption von Serumproteinen. Die Bindungsaffinität des Basiszements gegenüber Osteocalcin, BMP-2 und VEGF konnte durch Funktionalisierung mit Arginin gesteigert werden. Während die Modifizierung mit Cocarboxylase nur die VEGF-Adsorption förderte, bewirkte der Zusatz von Asparaginsäure-Natriumsalz eine Erhöhung der Osteocalcin- und BMP-2-Adsorption. Bedingt durch die größere spezifische Oberfläche der noch nicht abgebundenen Zemente, war die Menge adsorbierter Proteine auf frisch hergestellten Zementproben im Vergleich zu abgebundenen und ausgehärteten Zementen signifikant höher. Die Eignung der ausgewählten Zementvarianten als Knochenersatzmaterialien wurde mithilfe humaner mesenchymaler Stammzellen zweier verschiedener Spender getestet. Bei Verwendung abgebundener und ausgehärteter Zemente waren die hMSC in der Lage, auf allen Modifikationen zu adhärieren, zu proliferieren und in die osteogene Richtung zu differenzieren. Eine vorherige Inkubation der Zementproben mit humanem Serum förderte dabei vor allem die Zelladhäsion. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass hMSC im Gegensatz zu anderen Studien auch auf frisch hergestellten Zementproben adhärieren, proliferieren und differenzieren können. Die Modifizierung des Basiszements mit Cocarboxylase führte hierbei zu einer gegenüber den anderen Modifikationen signifikant erhöhten Zelladhäsion und -vitalität. Neben den verschieden modifizierten Pulver/Flüssigkeitszementen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige ready-to-use Zementpasten untersucht. Diese zeigten allerdings im Vergleich zu den herkömmlichen Zementen eine geringere Proteinbindungsaffinität. HMSC, die auf den Pastenzementen kultiviert wurden, war es wiederum möglich zu adhärieren, zu proliferieren und den osteoblastenspezifischen Marker Alkalische Phosphatase zu exprimieren. Hinsichtlich ihrer Biokompatibilität sind sie damit vergleichbar zu den herkömmlichen Pulver/Flüssigkeitszementen.

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<p>Mesenchymal stem cells have shown potential for success in gene therapy due to their ability to differentiate and their immunomodulatory properties <em>in vivo</em>. Although they have many inherent characteristics that are suitable for use within gene therapy, genetic modification of these cells is more difficult. Since MSCs are available in limited quantities and cannot be expanded indefinitely, the modification technique must ensure efficient expression of the transgene, a high cell survival rate and an intact ability to differentiate to various cell lineages. We optimized electroporation conditions for the genetic engineering of bone marrow-derived and umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. MSCs engineered using electroporation conditions produced more transgene expression than cells engineered with cationic lipids in bone marrow-derived mesenchymal stem cells, but produced similar amounts in umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. Optimal electroporation conditions also expressed more transgene than polymer based transfection reagent in umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. Cell survival after optimal electroporation conditions was 67% in umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. Most importantly, cells maintained their ability to differentiate into osteogenic, chondrogenic and adipogenic cell lineages. Electroporating umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells with a Factor IX containing plasmid lead to the FIX protein being expressed for over 12 days <em>in vitro</em>. This optimized electroporation protocol has created a fast, easy, economic and efficient method for genetically modifying mesenchymal stem cells without altering their ability to differentiate.</p> / Master of Applied Science (MASc)