Die jährliche Geweihregeneration der Cervidae ist einzigartiges Phänomen unter adulten Säugetieren. Rolf et al. konnten zeigen, dass dieser Prozess unter anderem von STRO-1+ mesenchymalen Stammzellen (MSZ) des Rosenstockperiosts ausgeht, deren Proliferation in der Regenerationsphase aktiviert wird. Ziel dieser Arbeit war es das Proliferationsverhalten dieser STRO-1+- und STRO-1- mesenchymalen Stammzellen/Progenitorzellen (MSZ) näher zu charakterisieren. Außerdem sollte die Expression der Yamanaka-Faktoren (c-Myc, Sox2, Nanog, Klf4, Oct4), welche von großer Bedeutung für die Aufrechterhaltung der stammzelltypischen Eigenschaften sind, untersucht werden. Die Gewebestücke des Rosenstockperiosts wurden parallel in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und Nonhematopoietic-Stem-Cell-Medium (NH-Medium) kultiviert. Bei Erreichen eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen mit Hilfe des Sortiersystems MACs nach dem Oberflächenmarker STRO-1 sortiert. Die Expression der Yamanaka-Faktoren wurde mit Hilfe von RT-PCR und Gelelektrophorese untersucht. Die Oct4-Expression in STRO-1+ MSZ wurde außerdem immunhistochemisch nachgewiesen. Dafür wurden die STRO-1+MSZ nach der Sortierung 24h, 28h, 72h, 96h und 144h kultiviert und das Oct4-Protein mit dem Fluoreszenzfarbstoff immunhistochemisch angefärbt. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt und die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Da Oct4 im Zytosol sowie in langen Zellfortsätzen, die wie Zell-zu-Zellverbindungen imponierten, detektiert wurde, sollte eine mögliche Übertragung von Oct4 untersucht werden. Dazu erfolgte die Ko-Kultivierung von STRO-1+MSZ mit Oct4-GFP-MEF (embryonalen Mausfibroblasten), in denen die GFP an einen Oct4-Promoter gekoppelt ist, und die Überwachung GFP-Expression. Im NH-Medium konnte eine höhere totale Zellzahl (3,5x) sowie eine signifikant höhere tägliche Wachstumsrate und eine höhere totale Anzahl von STRO-1+ MSZ generiert werden. Sowohl STRO-1+- also auch STRO-1 -MSC exprimieren die o.g. Transkriptionsfaktoren medien- und zeitabhängig. Die Fluoreszenzaufnahmen zeigten ein zeitabhängige Oct4-Expression in den STRO-1+ MSZ, insbesondere nach 48h und nach 96h. Zu diesen Zeitpunkten war das Protein nicht nur im Zellkern sondern auch im Zytoplasma und in den Zellfortsätzen bzw. Zell-zu-Zellverbindungen nachweisbar. Im Ko-Kultivierungsversuch stieg die intrazelluläre GFP-Expression sowie die Anzahl der GFP-positiven Zellen im Intervall zischen 24h-48h deutlich an. Die Ergebnisse demonstrieren das hohe Proliferationspotential der STRO-1+ und auch der STRO-1-MSZ, welches über einen langen Zeitraum hinweg aufrechterhalten werden konnte. Die Kultivierung in NH-Medium erwies sich dabei als vorteilhaft. Die Expression der Yamanaka-Faktoren konnte nachgewiesen werden. Die Oct4-positiven STRO-1+ MSZ sind in Lage über einen interzellulären Oct4-Transport die Oct4-GFP-Transkription in den Empfängerzellen zu initiieren. Die Beobachtungen führen zu der Schlussfolgerung, dass es bei der Geweihregeneration ebenfalls zu einer Übertragung von Oct4 von STRO-1+ MSC auf benachbarte Zellen kommen könnte, welches zu einer Dedifferenzierung in der Empfängerzelle führen könnte. Dies würde das schnelle Geweihwachstum erklären. Ob tatsächlich eine endogen induzierte Pluripotenz stattfindet muss jedoch in weiteren Studien untersucht werden.

Aims: Limbal stem cell (LSC) deficiency is one of the most challenging ocular surface diseases. The aim of this thesis was to study damaged ocular surface reconstruction. Therefore, a mouse model of limbal transplantation was estab- lished. Furthermore, LSC isolation, transfer of LSCs and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) on nanofiber scaffolds were studied. Material and methods: Syngeneic, allogeneic and xenogeneic (rat) limbal grafts were transplanted orthotopically into BALB/c mice. Graft survival, immune re- sponse and the effect of monoclonal antibodies (mAb) (anti-CD4 and anti-CD8 cells) were analyzed. Mouse LSCs were separated by Percoll gradient; subse- quently, they were analyzed for the presence of LSC and differentiation corneal epithelial cell markers and characteristics using real-time PCR and flow cytom- etry. Nanofiber scaffolds seeded with LSCs and MSCs were transferred onto the damaged ocular surface in mouse and rabbit models. Cell growth on scaffolds, post-operative inflammatory response and survival of transferred cell were ana- lyzed. Results: Limbal allografts were rejected promptly by the Th1-type of immune response (IL-2, IFN-γ) involving CD4+ cells and nitric oxide produced by macro- phages, contrary to the prevailing Th1 and Th2 immune responses (IL-4, IL-10) in...

The prevalence of obesity has already epidemic dimensions. Recently, the obesogens have been identified as the main cause in addition to excessive food intake, the lack of physical activity and the genetic background. These substances damage the metabolic processes, interfere with the hormonal functions and impair the energy balance in behalf of gaining weight and obesity. The theoretical part of this work deals with obesity, adipose tissue, lipid droplet and obesogens. From the obesogens there is closely specified a group of persistent organic pollutants (POP) from which one representative was used in the practical part of this work. The aim of the practical part was to describe the cellular model of differentiation the mesenchymal stem cell into adipocytes and to investigate the effect of one of the most frequently occurring obesogen on the expression genes of lipid metabolism and insulin signalling pathway. The morphological changes were observed in cells during differentiation (at days 0, 4, 10 and 21). The mesenchymal cells of the elongated spindle shape changed into adipocytes filled with lipid droplets. Oil Red O staining was used for quantification of accumulated lipids. The differentiation to adipocytes was confirmed by fluorescence immunocytochemistry using a specific protein FABP4. The...

Alzheimer's disease is a chronic, progressive, neurodegenerative disease. It belongs to the most common type of dementia and worldwide it is statistically the fifth cause of mortality. The most common morphological markers are insoluble β amyloid plaques, hyperphosforylated tau proteins and formation of neurofibrilar tangles. Among the manifestations of the disease is amyloid angiopathy, synaptic transmission disorders and subsequent apoptosis, deterioration of cognitive functions and brain atrophy. Studies have shown that administration of mesenchymal stem cells (MSC) has an immunomodulatory effects and it can reduce the production and storage of β amyloid and thus improve cognitive functions. In preclinical studies, which are conducted in transgenic mice and often use xenografts, administration of immunosuppresion may lead to variety of positive or negative effects which can affect the results of the experiment. The subject of the master's thesis was to determine the effect of immunosuppression on experimental therapy with MSC in various time windows of AD progression (model 3xTg). At which scale and combination of immunosupression will influence the cell therapy's effects, the length of graft survival, mortality of experimental animals and changes at the cellular level. We have also assessed...

Retinal degenerative disease are the leading cause of vision loss in adult patients. Important role in the development of these types of disease play gradual death of retinal cells and an inflammatory reaction that leads to the production of cytokines, formation of inflamasome, increased angiogenesis and scar formation. These pathologies result in irreversible degeneration of retinal cells. Retinal pigmenetd epithelium cells, photoreceptors and ganglion cells are the most frequently damaged cell types in this conditions. The available treatments are currently very limited and effective only at the early stages of the disease. Therefore, the use of stem cell- based therapy could be a promising option. For therapeutic purposes it would be possible to use mesenchymal stem cells (MSCs) which may be isolated for example from bone marrow or adipose tissue. MSCs are capable of production of neuroprotective factors, differentiation into the variety of cells types and regulation of immune response. In this study we tested the therapeutic potential of MSC administered locally to the damaged retina in an experimental model of retinal degeneration. We focused on the protective effect of MSCs on photoreceptor cells, regulation of the local immune response and expression of genes for cytokines involved in...

Perivascular cells of microvascular niches are the prime candidates for being a reservoire of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells in many tissues and organs that could serve as a potential source of cells and a target of novel cell-based therapeutic approaches. In the present study, by utilising typical markers of pericytes (neuronal-glial antigen 2, NG2, a chondroitin sulphate proteoglycan) and those of MSCs (CD146 and CD105) and primitive pluripotent cells (sex-determining region Y-box 2, Sox2), the phenotypic traits and the distribution of murine and rat retinal perivascular cells were investigated in situ. Our findings indicate that retinal microvessels of juvenile rodents are highly covered by NG2-positive branching processes of pericytic (perivascular) cells that are less prominent in mature capillary networks of the adult retina. In the adult rodent retinal vascular bed, NG2 labeling is mainly confined to membranes of the cell body resulting in a pearl-chain-like distribution along the vessels. Retinal pericytes, which were identified by their morphology and NG2 expression, simultaneously express CD146. Furthermore, CD146-positive cells located at small arteriole-tocapillary branching points appear more intensely stained than elsewhere. Evidence for a differential expression of the two markers around capillaries that would hint at a clonal heterogeneity among pericytic cells, however, is lacking. In contrast, the expression of CD105 is exclusively restricted to vascular endothelial cells and Sox2 is detected neither in perivascular nor in endothelial cells. In dissociated retinal cultures, however, simultaneous expression of NG2 and CD105 was observed. Collectively, our data indicate that vascular wall resident retinal pericytes share some phenotypic features (i.e. CD146 expression) with archetypal MSCs, which is even more striking in dissociated retinal cultures (i.e. CD105 expression). These findings might have implications for the treatment of retinal pathologies.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die biologische Charakterisierung neuartiger nanostrukturierter und für die Knochenregeneration geeigneter Calciumphosphatzemente (CPC). Hierzu wurde ein aus α-Tricalciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat, gefälltem Hydroxylapatit und Calciumcarbonat bestehender CPC verwendet, der mit den Biomolekülen Cocarboxylase, Glucuronsäure, Weinsäure, Glucose-1-phosphat, Arginin, Lysin und Asparaginsäure-Natriumsalz modifiziert wurde. Ermittelt wurde dabei der Einfluss der Modifikationen auf die Proteinadsorption und die Biokompatibilität. In Vorversuchen wurden die Zementmodifikationen hinsichtlich ihrer Bindungskapazität für humane Serumproteine und für das knochenspezifische Protein Osteocalcin (OC) sowie hinsichtlich ihrer Eignung für die Adhäsion, Proliferation und osteogene Differenzierung von humanen fötalen Osteoblasten (hFOB 1.19) und humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dabei erwiesen sich die Modifikationen mit Cocarboxylase, Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz als besonders günstig. Mit diesen „Favoriten“ erfolgte eine detailliertere Analyse der Adsorption humaner und boviner Serumproteine sowie der knochen-spezifischen Proteine Osteocalcin, BMP-2 und VEGF. Dabei führte sowohl der Zusatz von Cocarboxylase, als auch der von Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz zu einer erhöhten Adsorption von Serumproteinen. Die Bindungsaffinität des Basiszements gegenüber Osteocalcin, BMP-2 und VEGF konnte durch Funktionalisierung mit Arginin gesteigert werden. Während die Modifizierung mit Cocarboxylase nur die VEGF-Adsorption förderte, bewirkte der Zusatz von Asparaginsäure-Natriumsalz eine Erhöhung der Osteocalcin- und BMP-2-Adsorption. Bedingt durch die größere spezifische Oberfläche der noch nicht abgebundenen Zemente, war die Menge adsorbierter Proteine auf frisch hergestellten Zementproben im Vergleich zu abgebundenen und ausgehärteten Zementen signifikant höher. Die Eignung der ausgewählten Zementvarianten als Knochenersatzmaterialien wurde mithilfe humaner mesenchymaler Stammzellen zweier verschiedener Spender getestet. Bei Verwendung abgebundener und ausgehärteter Zemente waren die hMSC in der Lage, auf allen Modifikationen zu adhärieren, zu proliferieren und in die osteogene Richtung zu differenzieren. Eine vorherige Inkubation der Zementproben mit humanem Serum förderte dabei vor allem die Zelladhäsion. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass hMSC im Gegensatz zu anderen Studien auch auf frisch hergestellten Zementproben adhärieren, proliferieren und differenzieren können. Die Modifizierung des Basiszements mit Cocarboxylase führte hierbei zu einer gegenüber den anderen Modifikationen signifikant erhöhten Zelladhäsion und -vitalität. Neben den verschieden modifizierten Pulver/Flüssigkeitszementen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige ready-to-use Zementpasten untersucht. Diese zeigten allerdings im Vergleich zu den herkömmlichen Zementen eine geringere Proteinbindungsaffinität. HMSC, die auf den Pastenzementen kultiviert wurden, war es wiederum möglich zu adhärieren, zu proliferieren und den osteoblastenspezifischen Marker Alkalische Phosphatase zu exprimieren. Hinsichtlich ihrer Biokompatibilität sind sie damit vergleichbar zu den herkömmlichen Pulver/Flüssigkeitszementen.

Sepsis is the most common cause of death in the intensive care units worldwide. Despite the undeniable progress in pre- and clinical research, the effective causal therapeutic strategy still does not exist. Given to extremely complex and heterogenic host response to presence of infection, the paradigm "one disease, one drug" is obviously flawed and combination of multiple targets that involves early immunomodulation and cellular protection are needed. Cellular therapy using mesenchymal stem cells represents strategy that brought positive results in experiments with rodent septic models. Part of this thesis is dedicated to evaluation of safety and efficacy of stem cells intravenous administration to well-established large animal model of progressive peritoneal sepsis. Affecting of the neuroinflammatory reflex through the vagus nerve stimulation showed potential to attenuate sepsis in rodents. Rest of the text is dedicated to evaluation of vagus nerve stimulation effectivity in our model. KEYWORDS Sepsis, sepsis-associated acute kidney injury, mesenchymal stem cells, vagus nerve stimulation

As previously shown, transplantation of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in the experimental model of spinal cord injury leads to the motor and sensory functions improvement, supports neuroregeneration, angiogenesis and provides immunomodulation. On the other hand, these cells have limited migration and survival capacity, and their therapeutic effect is mediated mostly by their secretome. Therefore, application of mesenchymal stem cells derived conditioned medium is studied as an alternative option for cell therapy. In this thesis, therapeutic effect of repeated intrathecal delivery of human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells and their conditioned media in the treatment of spinal cord injury was compared. After induction of a balloon ischemic compression lesion, stem cells or conditioned media were administered weekly in three doses. Behavioral analyses were carried out up to nine weeks after spinal cord injury and revealed significant improvement of both treated groups compared to the untreated saline control. Application of stem cells and conditioned media also resulted in a higher amount of spared tissue and enhanced expression of genes related to neuroregeneration, although the size of glial scar was not reduced. Compared to application of stem cells, application of...

Modification of nanofibers is an actual trend in tissue engineering. Polyvinylacohol (PVA) is nontoxic and biodegradable polymer suitable for preparation of submicron fibers by electrospinning. Main disadvantage of PVA fibers is rapid degradation in aqueous environment. On the other hand surface of fibers contains free hydroxyl group that could be chemically modified. In recent work, chemical modification of PVA nanofibers prepared by needleless electrospinning was investigated. Polyethylenglykol (PEG) linker was introduced to the fiber surface by acylation (PVA-PEG) and further modified by biotin (PVA-PEG-b) as a function agent. Process of chemical modification does not affected fibrous morphology of samples. Interestingly, linkage of PEG-b linker promoted stability of PVA in aqueous environment. PVA-PEG-b sample was stable for 41 days. Stability of samples was strongly dependent on amount of introduced PEG-b linker, thus proposed method of modification allows to prepare nanofibers of different solubility. Additionally, biocompatibility of chemically modified nanofibers with both mesenchymal stem cells (MSC) and chondrocytes was determined. Proliferation of both cell types was not sufficient and number of cells decreased in time, probably because of high hydrophility of modified PVA scaffold. To...