Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_versao final_Luiz Augusto de Souza.pdf: 2211023 bytes, checksum: 4268860b6e9c6dbe550f450cb335653d (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Most tendon injuries are related to trauma and involve partial or complete tendon section due to the action of cutting or sharp objects or laceration. Recently, medical advances have shown a growing interest in the use of cell therapy for the treatment of chronic and degenerative diseases with slow and ineffective healing. The aim of this study was to establish a protocol for mononuclear cells isolation from bone marrow (BM) of rabbits, followed by purification using negative depletion with the monoclonal antibody CD45 for separation of mesenchymal stem cells (MSCs), with further cultivation in MesenCult ® medium. After that, it was evaluated the effects of allogeneic transplantation of MSCs with or without collagen extracellular matrix (CEM) on wound healing of the common calcaneal tendon in rabbits after partial tenectomy. Clinical, physical, macroscopic, histological and electron microscopy evaluations of tendon fibers were conducted. It was concluded that the collection, isolation, purification and rapid expansion of MSCs obtained from the mononuclear fraction of BM can be achieved using the density gradient Ficoll-paque®, negative depletion of haematopoietic cells in immunomagnetic base and MesenCult® medium. Furthermore, it was noticed that the number of passages exerts a negative influence on the morphology of the cells. Regarding treatment of tendinous injuries, the group treated with MSCs from bone marrow cultured in MesenCult® soaked in collagen sponge showed better results in terms of progress and quality of healing with deposition of collagen fibers in longitudinal orientation. / A maioria das lesões tendíneas está relacionada a traumas, e envolvem secção parcial ou completa do tendão, devido à ação de objetos cortantes ou agudos, ou laceração. Recentemente, os avanços médicos têm demonstrado crescente interesse na utilização de terapia celular em tratamentos de doenças crônicas e degenerativas com cicatrização lenta e ineficaz. Com este estudo objetivou-se estabelecer um protocolo de isolamento das células mononucleares da medula óssea (MO) de coelhos, seguido de purificação por depleção negativa com o anticorpo monoclonal CD45 para separação das células-tronco mesenquimais (CTMs) com posterior cultivo em meio de cultura MesenCult®. Em seguida, foram avaliados os efeitos do transplante alógeno de CTMs com ou sem matriz extracelular (MEC) de colágeno na cicatrização de lesões do tendão calcanear comum de coelhos após tenectomia parcial. Foram realizadas avaliações clínicas, físicas, macroscópicas, histológicas e por microscopia eletrônica das fibras tendíneas. Concluiu-se que a obtenção, isolamento, purificação e a rápida expansão de CTMs obtidas da fração mononuclear da MO podem ser alcançados utilizando o gradiente de densidade Ficoll-paque®, a depleção negativa das células hematopoiéticas em base imunomagnética e o meio de cultura MesenCult®. Além disso, pôde-se observar que o número de passagens exerce influência negativa sobre as características morfológicas das células. Em relação ao tratamento das lesões tendíneas, o grupo tratado com CTMs da medula óssea cultivadas em MesenCult® associadas a esponja de colágeno apresentou melhores resultados em termos de progresso e qualidade da cicatrização com deposição de fibras colágenas em orientação longitudinal.

Este estudo avaliou a influência da fototerapia a laser (FTL) na proliferação e diferenciação de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCs; do inglês, Dental Pulp Stem Cells ) encapsuladas em carreador injetável e termoresponsivo (PL; Pluronic® F-127, Sigma-Aldrich, MO, EUA) com incorporação de proteína morfogenética óssea 4 recombinante humana (rhBMP4) (sistema PL/rhBMP4). O biomaterial foi caracterizado de acordo com seus perfis de embebição e dissolução, liberação de rhBMP4 e sua estrutura morfológica. DPSCs foram isoladas, caracterizadas e encapsuladas em PL para confirmar sua viabilidade e seu potencial de diferenciação (adipo e osteogênico) em comparação com células-tronco mesenquimais de medula óssea (BMMSCs; do inglês, Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells). Quando encapsuladas no sistema PL/rhBMP4, DPSCs foram irradiadas com duas densidades de energia diferentes utilizando laser de diodo de fosfeto de índio-gálio-alumínio (InGaAlP), modos contínuo, pontual e em contato [660 nm, 0,028 cm2, 20 mW, 0,71 W/cm2, 3 J/cm2 (4 s) ou 5 J/cm2 (7 s)]. Os ensaios de PKH26 (do inglês, Red Fluorescent Cell Linker), CFU-F (do inglês, Coloning Forming Units - Fibroblastic), e MTT (do inglês, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)) foram utilizados para avaliar adesão/proliferação, diferenças na capacidade formadora de colônias e viabilidade das DPSCs (neste último caso sob estresse nutricional), respectivamente. Finalmente, a diferenciação odonto/osteogênica foi analisada por qRT-PCR e confirmada por ensaio de vermelho de alizarina. O biomaterial embebeu e dissolveu rapidamente; densa rede tubular e reticular com poros interconectados foi observada. DPSCs e BMMSCs apresentaram alta viabilidade celular quando encapsuladas em PL. Ambas as linhagens celulares tiveram êxito em se diferenciar em tecidos adiposo e ósseo. De acordo com o PKH26, DPSCs puderam aderir e proliferar no sistema PL/rhBMP4. DPSCs irradiadas encapsuladas tanto em PL como em PL/rhBMP4 formaram mais CFU-F que os controles não irradiados. Sob estresse nutricional, DPSCs semeadas no PL e irradiadas com 5 J/cm2 exibiram maior taxa de viabilidade celular em relação aos grupos não irradiados e irradiados com 3 J/cm2. Na presença de rhBMP4, os grupos irradiados tanto com 3 J/cm2 quanto com 5 J/cm2 apresentaram deposição mineral precoce quando comparados aos grupos não irradiados. Ainda, após 21 dias de diferenciação odonto/osteogênica, DPSCs irradiadas produziram maior quantidade de nódulos mineralizados. A irradiação com 5 J/cm2 levou ao aumento significativo da expressão de genes envolvidos na diferenciação odonto/osteogênica, como colágeno tipo I (COL1A1), osteocalcina (OCN), proteína da matriz dentinária 1 (DMP1), sialofosfoproteina dentinária (DSPP) e proteína heat shock 27 kDa (HSPB1). A associação entre rhBMP4 e FTL promove proliferação e diferenciação odonto/osteogênica de DPSCs acelerando e aumentando notavelmente a formação de tecido mineralizado, em especial quando a densidade de energia de 5 J/cm2 é aplicada. / This study evaluated the influence of laser phototherapy (LPT) on dental pulp stem cells (DPSCs) proliferation and differentiation upon encapsulation in an injectable and thermo-responsive cell carrier (PL; Pluronic® F-127, Sigma-Aldrich, MO, USA) loaded with human recombinant bone morphogenetic protein 4 (rhBMP4)(PL/rhBMP4 system). The biomaterial was characterized according to its swelling and dissolution profiles, release of rhBMP4 and morphological structure. DPSCs were isolated, characterized and encapsulated in PL to confirm their viability and multilineage differentiation potential (adipo and osteogenic) in comparison to bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs). When encapsulated in the PL/rhBMP4 system, DPSCs were irradiated with two different energy densities using a continuous-wave indium-gallium-aluminum-phosphide (InGaAlP) diode laser [660 nm, 0.028 cm2, 20 mW, 0.71 W/cm2, 3 J/cm2 (4 s) or 5 J/cm2 (7 s)] in punctual and contact modes. The PKH26 (Red Fluorescent Cell Linker), the CFU-F (Coloning Forming Units - Fibroblastic), and the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] assays were used to assess differences in cell adhesion/proliferation, colony forming units formation ability, and cell viability of DPSCs (in this case under nutritional stress), respectively. Then, alizarin red and qRT-PCR analyzes were used to evaluate odonto/osteogenic differentiation. The biomaterial swelled and dissolved rapidly; dense tubular and reticular network morphology with well-interconnected pores was observed. DPSCs and BMMSCs presented high cell viability when encapsulated in PL. Both cell lineages successfully differentiated into bone or adipose tissues. According to PKH26, DPSCs were able to adhere and proliferate in the PL/rhBMP4 system. Irradiated DPSCs encapsulated in either PL or PL/rhBMP4 system formed more CFU-F than non-irradiated controls. Under nutritional stress, DPSCs encapsulated in the hydrogels with no rhBMP4 and irradiated at 5 J/cm2 exhibited higher cell viability than the other groups. In the presence of rhBMP4, the groups irradiated both at 3 and 5 J/cm2 energy densities displayed earlier mineral deposition than the non-irradiated groups. Moreover, after 21 days of odonto/osteogenic differentiation, irradiated DPSCs produced greater nodule formation than the control groups. At the energy density of 5 J/cm2, there were significant upregulation of genes involved in odonto/osteoblast differentiation, such as type I collagen (COL1A1), osteocalcin (OCN), dentin matrix protein 1 (DMP1), dentin sialophosphoprotein (DSPP) and heat shock protein 27 kDa (HSPB1). The association between rhBMP4 and LPT promotes cell proliferation and odonto/osteogenic differentiation of DPSCs accelerating and increasing the formation of mineralized tissue, in particular when the energy density of 5 J/cm2 is applied.

O crescimento, desenvolvimento e manutenção do tecido ósseo são processos altamente regulados. Diversas proteínas como hormônios, fatores de crescimento e citocinas estão envolvidas nestes processos e exercem atividade direta sobre células osteoblástica e osteoclástica, atuando em sua diferenciação e ativação metabólica. O processo de regeneração óssea é iniciado por fatores estimuladores locais como as proteínas morfogenética óssea (BMP Bone Morphogenetic Proteins). As BMPs são um produto do metabolismo dos osteoblastos, odontoblastos e de várias células tumorais, sendo armazenadas na forma de concentrados no osso, dentina e em células neoplásicas do osteossarcoma e de certos tumores odontogênicos, tais como: fibroma cementificante, cementoblastoma benigno, dentinoma, fibroma odontogênico e odontoma. Esclarecer os mecanismos que controlam a remodelação óssea é uma questão bastante relevante. Nesse sentido, as células-tronco mesenquimais têm despertado grande interesse devido ao seu potencial envolvimento no processo de reparo tissular. A obtenção de osteoblastos funcionais a partir de células-tronco mesenquimais tem sido utilizada na engenharia de tecidos e terapia celular. Desse modo, no presente trabalho foi realizada uma análise proteômica das proteínas envolvidas nas diversas fases de diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais de medula óssea de rato Wistar e humana, no sentido de obter maiores informações sobre a diferenciação celular e a biologia do tecido ósseo. Células-tronco mesenquimais obtidas de medula óssea foram cultivadas em meio osteogênico por diferentes períodos para obter células em diversas fases da diferenciação osteoblástica. Para análise proteômica foram utilizadas ferramentas como a estratégia de shotgun proteomics e quantificação relativa (iTRAQ - Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation) para separação de proteínas e a espectrometria de massas para a identificação e quantificação relativa de proteínas e peptídeos. Neste contexto, os nossos resultados nos levam a concluir que: as CTMs de medula óssea de rato Wistar expressam genes que estão envolvidos na diferenciação osteogênica quando estimuladas in vitro formando matriz óssea no período de 14 dias, ou seja, o fator estimulante no microambiente é de fundamental importância; as CTMs de medula óssea humana apresentaram resultados semelhantes com as CTMs de ratos em nível genômico durante a diferenciação osteogênica, entretanto quando estimuladas in vitro formaram a matriz óssea no período de 21 dias; utilizando duas abordagens proteômicas, foi possível identificar proteínas importantes que estão envolvidas no processo de diferenciação. Mas cabe salientar que, embora tenham sido detectados genes que parecem envolvidos no processo de diferenciação, isso não teve reflexo no proteoma dessas células nos períodos de 7 e 14 dias da indução de diferenciação à osteogênese, o que indica que a maior parte da funcionalidade dessas células quanto aos outros processos biológicos estão preservados, como por exemplo a proliferação celular permaneceu sem grandes alterações. Isso indica que manipulações de isolamento, cultivo e indução da diferenciação dessas células não afetaram o proteoma, com aspectos positivos para a utilização de células-tronco mesenquimais em terapia celular. Do ponto de vista metodológico, esse trabalho abre perspectivas da utilização de estratégias proteômicas baseadas na marcação por isóbaros em combinação com separação de proteínas por eletroforese unidimensional SDS-PAGE para a análise de amostras biologicamente complexas e de quantidades limitadas de obtenção como células-tronco mesenquimais. O estudo da expressão de proteínas durante as fases de diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais de medula óssea deve refletir seu estado funcional e contribuir para o entendimento das diversas vias envolvidas no processo de diferenciação. / The growth, development and maintenance of bone tissue are highly regulated processes. Several proteins such as hormones, growth factors and cytokines are actively involved in these processes and exert direct activity on osteoblastic and osteoclastic cells, acting in their differentiation and metabolic activation. The process of bone regeneration is initiated by local stimulating factors as bone morphogenetic proteins (BMP). BMPs are a product of the metabolism of osteoblasts, odontoblasts and various tumor cells and is stored in the form of concentrates in bone, dentin and neoplastic cells of osteosarcoma and certain odontogenic tumors such as fibroma cementifying, cementoblastoma benign dentinoma, odontogenic fibroma and odontoma. Clarify the mechanisms that control bone remodeling is a very relevant issue. Accordingly, the mesenchymal stem cells have attracted great interest because of its potential involvement in the process of tissue repair. Obtaining functional osteoblasts from mesenchymal stem cells has been used in tissue engineering and cell therapy. Thus, this present work performed a proteomic analysis of proteins involved in various stages of osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow of Wistar rat and human, in order to obtain more information on the biology of cell differentiation and bone tissue. Mesenchymal stem cells obtained from bone marrow were cultured in osteogenic medium for different periods to obtain cells at different stages of osteoblast differentiation. For proteomics analysis tools were used as the strategy of shotgun proteomics and relative quantification (iTRAQ - isobaric Tag for Relative and Absolute quantitation) for protein separation and mass spectrometry to identify proteins. In this context, our results take us to conclude that the MSCs of Wistar rat bone marrow express genes that are involved in osteogenic differentiation in vitro when stimulated to form bone matrix during the 14 days, ie stimulating factor in the microenvironment is of fundamental importance, the MSCs from human bone marrow showed similar results with rat MSCs at the genomic level during osteogenic differentiation, however, when stimulated in vitro formed bone matrix within 21 days, using two proteomic approaches, we could identify proteins important that are involved in the process of differentiation. But it should be noted that although it has been identified genes that seem involved in the process of differentiation, it was not reflected in the proteome of these cells at 7 and 14 days after induction of the osteogenic differentiation, indicating that most of the functionality of these cells and other biological processes are preserved, such as cell proliferation remained without major changes. This indicates that manipulations of isolation, culture and induction of differentiation of these cells did not affect the proteome, with positive aspects to the use of mesenchymal stem cells in cell therapy. From the methodological point of view, this work opens up the use of proteomic strategies based on the score for isobars in combination with protein separation by electrophoresis, one-dimensional SDS-PAGE for the analysis of complex biological samples and limited quantities of production as mesenchymal stem cells. The study of protein expression during stages of osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow should reflect their functional status and contribute to the understanding of pathways involved in the process of differentiation.

As Distrofias Musculares Progressivas (DMPs) constituem um grupo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Dentre as diferentes abordagens terapêuticas propostas para esse grupo de doenças, a terapia celular com células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido um foco importante de pesquisas. Muitos tipos de CTMs já foram descritas com o intuito de reconhecer qual o tipo ideal a ser usado em uma possível terapia celular para DMPs. Neste trabalho comparamos o potencial terapêutico de células-tronco de diferentes fontes obtidas de um mesmo doador. Escolhemos as células de pericito (CP) como ferramenta de estudo, uma vez que elas estão presentes em todos os tecidos irrigados por vasculatura. Isolamos pericitos de 4 tecidos da mesma doadora (endométrio, trompa, tecido adiposo e músculo). Em seguida, injetamos 1 milhão dessas células intraperitonialmente em camundongos Utrntm1KedDmdmdx/J (duplo knockout para o gene da distrofina e utrofina) semanalmente, por 8 semanas, e avaliamos a clínica e a sobrevida desses animais. Observamos que nas condições experimentais desse estudo, o potencial miogênico dessas células é insuficiente para ser utilizado como terapia regenerativa. Entretanto, apesar dos testes padronizados não detectarem nenhuma melhora clínica aparente, os animais tratado com pericitos de gordura mostraram uma curva de sobrevivência significativamente maior do que os controles não tratados. Como não houve diferenciação miogênica, esses resultados sugerem que os efeitos benéficos ocorreram através de liberação de fatores tróficos e imunoreguladores (efeito parácrino). É digno de nota que apesar das células serem todas derivadas de pericito e de uma mesma doadora o aumento de sobrevida só foi observado com células do tecido adiposo. Esses resultados indicam que o potencial terapêutico de CP difere de acordo com sua origem e que essa diferença não depende do genoma do doador. Esses resultados constituem um passo inicial, porém, valioso na compreensão do potencial de utilização dessas células em terapias / Progressive Muscular Disorders (PMDs) are a group of heterogeneous genetic diseases characterized by an irreversible degeneration of the muscle tissue due to mutation or absence of a protein. Among the many different available therapeutic approaches to treat PMDs, cell therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the most studied ones. There are many types of MCSs described to date and the need to identify the best one suited to treat PMDs has yet to be addressed. In this thesis, we compared the therapeutic potential of different types of stem cells derived from the same donor. First, we chose pericytes as a tool of comparison, as this cell is unequivocally present in all vascularized tissues. We isolated pericytes of 4 different tissues from the same donor (endometrium, fallopian tubes, adipose tissue and muscle). We injected 1 million of these cells intraperitonially in Utrntm1KedDmdmdx/J mice (knockout for the dystrophin and utrophin gene) weekly for 8 weeks evaluating the clinical features and survival curve of these mice. We observed that, in the experimental conditions of this study, the myogenic potential of these cells is insufficient to be harnessed as therapy for regenerative purposes. However, despite the fact that the standardized tests did not detect any apparent clinical improvement, mice treated with pericytes derived from adipose tissue had a survival curve greater than control treated mice. As we could not observe any myogenic differentiation or cell engraftment, this results suggests that the beneficial effect observed could be due to the releasing of trophic and immune modulator factors (paracrine effect). It is noteworthy that despite all cells being derived from the same donor, the increase in life expectancy was only observed in pericytes derived from the adipose tissue. These results indicate that the therapeutic potential of pericytes differs according to their tissue of origin and the difference is not due to genetic differences. This is still preliminary data but it is valuable in understanding the therapeutic potential of these cells

As doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de morte, principalmente aquelas decorrentes do infarto do miocárdio (IM). A terapia com células-tronco tem mostrado resultados promissores após o IM em estudos clínicos e experimentais, especialmente as células-tronco mesenquimais (MSC), por apresentarem notável potencial pró-angiogênico, anti-fibrosante e imunomodulador. Entretanto, nenhum estudo foi realizado quanto à variabilidade da frequência cardíaca (VFC), tono autonômico e sensibilidade do barorreflexo, que são considerados fatores de risco apreciáveis, e se encontram atenuados na insuficiência cardíaca (IC) induzida pelo IM. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi examinar o efeito do transplante de MSC de medula óssea sobre a modulação autonômica e a sensibilidade do barorreflexo em ratos com IC, induzida pelo IM. Para isso, foi realizada a ligadura da artéria coronária esquerda em ratos Wistar machos (220-360g), e após dois a três dias foi feita a avaliação da área infartada pelo SPECT. As MSCs foram injetadas, intravenosamente, sete dias pós-IM. A função cardíaca foi analisada pela ventriculografia, antes e um mês após o transplante. Após a reavaliação da ventriculografia, os animais foram submetidos a registros eletrocardiográficos, após receberem eletrodos implantados subcutaneamente no dorso, e cânula na veia jugular esquerda para determinação farmacológica do tono autonômico. Também, foi implantada cânula na artéria femoral para registro da pressão arterial, e análise da sensibilidade do barorreflexo. Logo após os registros, os animais foram sacrificados para coleta do coração e análise histopatológica. Para a infusão, as MSCs foram caracterizadas, segundo critérios da Sociedade Internacional de Terapia Celular. A área de lesão induzida logo após a ligadura da artéria foi semelhante entre os animais. Um mês após o tratamento, o tamanho do infarto foi reduzido no grupo tratado com MSC. Verificou-se redução da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) após a ligadura coronariana, e previamente ao tratamento nos animais com IC. Um mês após a terapia com MSC, ou injeção de salina, não houve melhora da FEVE em ambos os grupos com IC. Os intervalos QT e QTc foram alongados pelo IM, enquanto as MSCs não tiveram efeito nestes parâmetros. A VFC mostrou redução do desvio padrão de valores sucessivos (SDNN) do intervalo RR (iRR) e a raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças de valores sucessivos (RMSSD) do iRR pós-IM, enquanto as MSCs preveniram essa redução. Na análise espectral, os espectros do iRR, após o infarto, mostraram potências menores, em unidades absolutas, das bandas de baixa frequência, LF, e alta frequência, HF, enquanto que as MSCs promoveram um aumento destes parâmetros. Os métodos não-lineares da VFC mostraram redução na entropia, e aumento da análise de flutuação depurada de tendência (DFA) do iRR pós-IM. A terapia com MSC preveniu a alteração da entropia e, também, protegeu o DFA. A frequência cardíaca foi semelhante entre os grupos; entretanto, a frequência intrínseca de marca-passo apresentou-se reduzida no grupo IC, enquanto o tratamento com MSC preservou esta atenuação. Foi observado menor tono vagal no grupo IC não tratado, enquanto o tratamento com MSC aumentou o tono vagal. O tono simpático não apresentou diferença entre os grupos. A sensibilidade do barorreflexo à bradicardia foi reduzida na IC, enquanto que as MSC preveniram essa redução. O colágeno intersticial apresentou-se aumentado na IC, mas não no grupo tratado com MSC. A pressão arterial (PA) sistólica, a PA média e os parâmetros da variabilidade da PA: SDNN e LF encontraram-se reduzidas nos grupos com IC, tratados ou não com MSC. Em conjunto, esses dados demonstram que a terapia com MSC reduziu a extensão do infarto e a fibrose intersticial no miocárdio remanescente do ventrículo esquerdo. Além disso, melhorou a modulação autonômica colinérgica do coração, a VFC e a sensibilidade barorreflexa. / Cardiovascular diseases are among the leading causes of death, especially those resulting from myocardial infarction (MI). Stem cell therapy has shown promising results after MI in both patients and experimental animals, especially those using mesenchymal stem cells (MSC), which present potential pro-angiogenic, anti-fibrotic and immunomodulatory. However, no studies have been conducted on the heart rate variability (HRV), autonomic tone and baroreflex sensitivity, which are considered risk factors and are attenuated in heart failure (HF) induced by MI. Thus, the main of this study was to examine the effect of bone marrow MSC transplantation on autonomic modulation and baroreflex sensitivity in rats with HF, induced by MI. Therefore, it was performed ligation of the left coronary artery of male Wistar rats (220-360g) and after two to three days, assessment was made of the area infarcted by SPECT. MSC were injected intravenously seven days post-MI. Cardiac function was assessed by ventriculography before and one month after transplantation. After reassessing the ventriculography, the animals underwent electrocardiographic recordings after receiving electrodes implanted subcutaneously on the back, and cannula in the left jugular vein for drug determination of autonomic tone. Also, cannula was implanted in the femoral artery for blood pressure recording and analysis of baroreflex sensitivity. Soon after the records, the animals were sacrificed for collection of the heart and histopathological analysis. For infusion, the MSC were characterized according to the criteria of the International Society for Cellular Therapy. The lesion area induced soon after artery ligation was similar among animals. One month after treatment, infarct size was reduced in the group treated with MSC. A reduction was observed in left ventricular ejection fraction (LVEF) after coronary ligation, and prior to treatment in HF animals. One month after the MSC therapy, or saline injection, there was no improvement in LVEF in both groups with HF. The QT and corrected QT intervals were lengthened by IM, while the MSC had no effect on these parameters. HRV showed a reduction in the standard deviation of successive values (SDNN) of the RR interval (RRi), and the root mean square of the successive (RMSSD) RRi after MI, while the MSC prevented this reduction. In spectral analysis, the RRi spectra, after infarction, showed lower power, in absolute units, of the low frequency, LF, and high frequency band, HF, while MSCs promoted an increase in these parameters. Nonlinear methods of HRV showed a reduction in entropy, and increased detrended fluctuation analysis (DFA) of RRi, post-MI. The MSC therapy prevented the change of entropy and also protected DFA. Heart rate was similar in both groups; however, the intrinsic heart rate was reduced in HF group, while treatment with MSC preserved this attenuation. A lower vagal tone was observed in HF untreated group, while treatment with MSC increased vagal tone. The sympathetic tone did not differ between groups. The baroreflex sensitivity to bradycardia was reduced in HF, while the MSC prevented this reduction. The interstitial collagen was increased in HF, but not in the group treated with MSC. Systolic blood pressure (BP), the mean BP and parameters of BP variability: SDNN and LF were reduced in the groups with HF, treated or not with MSC. Together, these data demonstrate that MSC therapy reduced the infarct size and interstitial fibrosis in the remaining myocardium of the left ventricle. In addition, the cells improved cholinergic autonomic modulation of the heart, heart rate variability and baroreflex sensitivity.

A menopausa é provocada pela falência da produção de hormônios ovarianos e tem como consequências alterações desfavoráveis no metabolismo e perda de massa óssea. O declínio da produção de estrógeno é considerado um grande fator de risco para o desenvolvimento da osteoporose em mulheres e como tratamento faz-se o uso da Terapia de Reposição Hormonal. No entanto, esta terapia tem trazido riscos á saúde de alguns grupos de mulheres. Como alternativa ao tratamento tradicional, tem-se os fitoestrógenos, e com eles as isoflavonas, encontradas principalmente na soja, Trifolium pratense e Cimicifuga racemosa. Este estudo teve como objetivo comparar a capacidade de estimular a osteogênese in vitro, a partir de cultura de osteoblastos derivados de células tronco mesenquimais, em duas preparações de fitoestrógenos: O extrato de soja biotransformado pelo fungo Aspergillus awamori (ESBF), e o Menoflavon® 40mg (Melbrosin International) composto pela isoflavona Trifolium pratense. Para este objetivo foram realizadas: a) Avaliação do crescimento e proliferação celular b) Viabilidade e crescimento das culturas de osteoblastos. c) Dosagem de proteína total das culturas de osteoblastos. d) Determinação da atividade específica da enzima fosfatase alcalina. e) Formação da matriz mineralizada. O Menoflavon® foi testado nas concentrações de 28,75 nM de daidzeína (D) + 7,5 nM de genisteína (G) (0,5 ?g/mL de Menoflavon®); 57,5 nM de D + 15 nM de G (1 ?g/mL de Menoflavon®); e 230 nM de D + 60 nM de G (4 ?g/mL de Menoflavon®); controle padrão de 57,5 nM de D + 15 nM de G comercial e controle de dimetilsulfóxido (DMSO). O ESBF foi testado nas concentrações de 1,181 nM de D + 0,922 nM de G (0,5 ?g/mL de ESBF); 2,361 nM de D + 1,845 nM de G (1 ?g/mL de ESBF); 9,445 nM de D + 7,379 nM de G (4 ?g/mL de ESBF); controle padrão de 2,361 nM de D + 1,845 nM de G comercial e controle de DMSO. Com a metodologia do MTT (3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-brometo difenil tetrazolium) e da Resazurina comprovamos que não houve morte celular nas concentrações testadas com as duas formulações. A dosagem de proteínas totais manteve-se constante com as duas formulações e a formação de matriz mineralizada também manteve-se constante em relação ao controle para ambos. A atividade específica da fosfatase alcalina teve um decréscimo significativo ao 14º dia com todas as concentrações testadas e ao 21º dia com algumas concentrações de Menoflavon e com o ESBF decresceu em alguns dias, no entanto manteve-se estável no restante do teste. O ESBF mostrou ser melhor que o Menoflavon®, já que obtivemos resultados semelhantes e sua concentração é 24 vezes menor. No entanto, o estudo realizado mostrou que tanto o ESBF quanto o Menoflavon® não são capazes de estimular a osteogênese in vitro, a partir de cultura de osteoblastos derivados de células tronco mesenquimais. / Menopause is caused by failure in the production of ovarian hormones and its consequences are unfavorable changes in metabolism and bone loss. The decline in estrogen production is considered a major risk factor for the development of osteoporosis in women, and the Hormone Replacement Therapy is used as treatment. However, this therapy has brought some risks to the health of some groups of women. As an alternative to the traditional treatment, phytoestrogens as isoflavones, found mainly in soy, Trifolium pratense, Cimicifuga racemosa and rye can be used. This study aimed to compare the ability of two preparations of phytoestrogens to stimulate osteogenesis in vitro (from cultures of osteoblasts derived from mesenchymal stem cells): soy extract biotransformed by the fungus Aspergillus awamori (ESBF), and Menoflavon® 40mg (Melbrosin International) composed by the isoflavone Trifolium pratense. With this objective, were used: a) Evaluation of cell growth and proliferation; b) Viability of the cultures of osteoblasts; c) Determination of total protein from the cultures of osteoblasts; d) Determination of the specific activity of the enzyme alkaline phosphatase; e) Formation of mineralized matrix. Menoflavon® was tested at the concentrations of 28.75 nM of daidzein (D) + 7.5 nM of genistein (G) (Menoflavon® 0.5 ?g/mL); 57.5 nM D + 15 nM G (Menoflavon® 1 ?g/mL); and 230 nM D + 60 nM G (Menoflavon® 4 ?g/mL); standard control of commercial 57.5 nM D + 15 nM G and DMSO control. ESBF was tested at the concentrations of 1.181 nM D + 0.922 nM G (ESBF 0.5 ?g/mL); 2.361 nM D + 1.845 nM G (ESBF 1 ?g/mL); 9.445 nM D + 7.379 nM G (ESBF 4 ?g/mL); standard control of commercial 2.361 nM D + 1.845 nM G and dimetilsulfoxide (DMSO) control. With the MTT and Resazurin methods we verified that there was no cell death for all concentrations tested with the two formulations. The amount of total protein remained constant with the two formulations, and the formation of mineralized matrix also were the same as the control. The specific activity of alkaline phosphatase decreased significantly on day 14 for all concentrations tested, and at day 21 for some concentrations of Menoflavon®, with the ESBF decreased some days, however remained constant in the other tests. Therefore, ESBF proved better than Menoflavon®, since we obtained similar results for both, but the concentration of ESBF is 24 times smaller than the concentration of Menoflavon®. However, both the ESBF and the Menoflavon® were not capable of stimulating osteogenesis in vitro from cultures of osteoblasts derived from mesenchymal stem cells.

Células tronco mesenquimais (CTm) apresentam potencial para tratamento da doença renal pela possibilidade de promover regeneração tecidual e recuperação funcional, possivelmente por seus efeitos parácrinos. Na última década, o líquido amniótico foi descrito como uma fonte promissora de extração e isolamento de CTm. Alguns estudos mostraram o efeito renoprotetor das CTm derivadas do líquido amniótico (CTmLA) na doença renal aguda e crônica, quando inoculadas precocemente. Entretanto, ainda não foi estudado o efeito da administração de CTmLA em modelo experimental de doença renal crônica (DRC) com a lesão já estabelecida, situação esta que reproduz melhor a apresentação clínica da doença nos pacientes. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar o efeito da inoculação de CTmLA na região subcapsular renal no modelo de DRC já estabelecido. As CTmLA foram obtidas de pacientes no segundo trimestre de gestação e isoladas através da sua capacidade de aderência ao plástico. A caracterização das CTm foi feita por citometria de fluxo e pela diferenciação celular in vitro. O modelo de DRC utilizado foi o de nefrectomia 5/6 (Nx) que, pela perda de massa renal, evolui com hipertensão arterial, proteinúria, glomeruloesclerose, fibrose intersticial e perda progressiva da função renal. Quinze dias após a indução do modelo, estas alterações já são marcantes e agravam-se com 30 dias. Foram realizados 2 protocolos experimentais: no protocolo I, os animais Nx com DRC estabelecida receberam dose única de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal e foram acompanhados por 30 e 60 dias de experimento. No protocolo II, os animais Nx com DRC estabelecida receberam duas doses de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal, no 15° e 30° dia após a nefrectomia 5/6, e foram acompanhados por 30 dias, totalizando 60 dias de experimento. Os animais foram subdivididos nos grupos: Sham, ratos submetidos à cirurgia fictícia; Sham+CTmLA, ratos submetidos à Sham que receberam CTmLA; Nx, ratos submetidos à nefrectomia 5/6; Nx+CTmLA, ratos Nx que receberam CTmLA. Para verificar a localização das CTmLA no tecido renal foi realizada a hibridização in situ para cromossomo XY. Foram realizadas análises dos parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, PCR em tempo real e multiplex. Resultados: as CTmLA cultivadas mostraram grande capacidade de aderência, crescimento em colônia e de diferenciação em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. A análise por citometria mostrou-se positiva para CD29, CD44, CD90 e CD105, com uma pequena população de células de CD14, CD34, CD45 e CD117, confirmando a presença preponderante de CTm. Protocolo I: Após 30 dias, a inoculação de CTmLA, dose única, preveniu a elevação da pressão arterial, da proteinúria, da glomeruloesclerose, recuperando a expressão dos marcadores de podócitos, WT-1 e sinaptopodina. Entretanto, não houve efeito benéfico nos níveis de creatinina sérica e na fibrose intersticial, após 30 e 60 dias. O tratamento com CTmLA promoveu uma diminuição marcante do número de macrófagos e uma discreta queda dos leucócitos no infiltrado inflamatório renal, além da diminuição do número de miofibroblastos no interstício renal. Citocinas pró-inflamatórias foram encontradas em menor concentração no tecido renal dos animais que receberam CTmLA (IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 e RANTES). Não houve alteração significativa das citocinas Th1 e Th2, exceto por um aumento da IL-4 nos animais tratados com CTmLA. Os animais que foram acompanhados por 60 dias tiveram uma melhora da proteinúria, da glomeruloesclerose, diminuição do infiltrado de macrófagos e uma melhora da expressão de WT-1. Não foram observadas diferenças estatísticas nos parâmetros de creatinina sérica e fibrose intersticial, aos 30 e 60 dias. Protocolo II: Nos animais que receberam a segunda dose de CTmLA e foram acompanhados por 60 dias observou-se prevenção da elevação da pressão arterial e da proteinúria, além de uma marcante diminuição da fibrose intersticial. Em conclusão, o presente estudo mostrou, pela primeira vez, que a terapia com CTmLA foi capaz de induzir renoproteção nos animais com doença renal crônica estabelecida. O tratamento com CTmLA pode representar uma nova abordagem terapêutica bloqueando a progressão da doença renal crônica / Mesenchymal stem cells (mSC) represent therapeutic potential for the treatment of renal diseases, due to their ability to induce tissue regeneration and functional recovery. Human amniotic fluid stem cells (AFmSC) are a class of fetal, pluripotent stem cells, which present characteristics intermediate between embryonic and adult stem cells. These cells are characterized by the expression of mesenchymal stem cells markers. In addition, they have the ability to differentiate into lineages of all embryonic germ layers. They also show high proliferative rates, but do not induce tumor formation. Therefore, AFmSC are considered to be a very promising cell source and these characteristics have generated a great interest concerning their potential renoprotective effects. The aim of this study was to analyze the effects of AFmSC in an experimental model of chronic kidney disease, the 5/6 nephrectomy model (Nx), after the disease has been established, in order to more closely resemble the clinical settings in humans. AFmSC derived from second-trimester amniocentesis were isolated by plastic adhesion. After 4-7 passages, AFmSC characteristics were confirmed by flow cytometry and by their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Two experimental protocols were performed: In protocol I, rats underwent 5/6 nephrectomy (Nx) or sham surgery at day 0, received at day 15 a single dose of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule and were studied at day 30 and 60 days. In protocol II, rats underwent Nx or sham surgery, and received at days 15 and 30, two doses of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule, and were studied at day 60. In both protocols, the animals were subdivided into four groups: Sham, rats submitted to fictitious surgery; Sham+hAFmSC, Sham rats that received hAFmSC; Nx, rats submitted to nephrectomy 5/6; Nx+hAFmSC, Nx rats receiving hAFmSC. The hAFmSC were followed in the renal tissue by in situ hybridization for XY chromosome. In all the groups, clinical and histological parameters were analyzed by immunohistochemistry and real-time PCR. Results: AFmSC cultivated demonstrated an ability to adhere to plastic, to grow in colonies and to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic cells. Quantitative analysis of cell markers by flow cytometry showed that isolated cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105, with a small population of cells positive for CD14, CD34, CD45 and CD117, confirming a preponderant presence of mSC. Protocol I: After 30 days, the single dose of hAFmSC significantly reduced the blood pressure levels, proteinuria, glomerulosclerosis and improved the expression of podocytes markers, WT-1 and synaptopodin. A marked decrease on the number of macrophages and a discrete decrease of leucocyte infiltration, as well as a reduction of interstitial myofibroblasts was observed. Treatment with hAFmSC significantly reduced some proinflammatory cytokines (IL1beta, TNF-alpha, MCP-1 and RANTES). No significant difference in Th1 or Th2 cytokines was observed, except for IL-4 increase in Nx rats treated with hAFmSC. At 60 days of follow-up, Nx rats treated with hAFmSC presented reduced proteinuria, glomerulosclerosis and macrophages besides increase in WT-1 expression. No improvements were observed on serum creatinine and of interstitial fibrosis, after 30 and 60 days. Protocol II: Inoculation of two doses of hAFmSC in Nx rats improved blood pressure levels, proteinuria and interstitial fibrosis at day 60. In conclusion, the present study demonstrated, for the first time, that hAFmSC induced renoprotection in animals with established chronic kidney disease. Treatment with hAFmSC may represent a novel therapeutic approach for blocking the progression of chronic kidney disease

A sepse é uma doença relacionada como a presença de infeção junto a uma resposta inflamatória sistêmica; sua fisiopatologia envolve uma rede complexa de citocinas e mediadores inflamatórios que causam a injúria de diversos tecidos. Na atualidade são muitas as tentativas para diminuir a mortalidade, porém até agora, não existe uma estratégia específica para tratar a doença. As células-tronco mesenquimais da geleia de Wharton do cordão umbilical (CTM-GW) são conhecidas por expressar genes e fatores envolvidos na angiogênese e imunomodulação. Nós usamos o modelo de ligadura e punção do ceco (LPC) para analisar o papel da CTM-GW em disfunção orgânica relacionada à sepse. Foi utilizada a citometria de fluxo para avaliar o fenótipo das células isoladas. Dividimos ratos Wistar em grupos: sham (operação simulada); LPC; e LPC + CTM (106 CTM-GW i.p., 6 horas após LPC). Às 24 h pós-LPC, foram avaliadas a função renal, hepática e outras variáveis do estudo. As CTM-GW foram negativas para CD3, CD34, CD45 e HLA-DR, enquanto eles foram positivos para CD73, CD90 e CD105. O tratamento com CTM na sepse reduziu a mortalidade, melhorou a filtração glomerular (aferido pelo clearance de inulina), função tubular, reduziu a lesão hepática e demostrou uma ação anti-inflamatória. O tratamento também apresentou um efeito anti-apoptótico e protetor do tecido renal e do endotélio, mediante a regulação da expressão de VEGF, AQP2 e eNOS. Em conclusão as CTM-GW diminuem a injúria renal e hepática, portanto, pode desempenhar um papel protetor na sepse / Sepsis is a disease related to the presence of infection with a systemic inflammatory response. The pathophysiology involves complex cytokine and inflammatory mediator networks that cause injury to various tissues. Currently, there are many attempts to reduce mortality, but so far, there is no specific strategy for treating the disease. Human umbilical cord Wharton\'s jelly-derived mesenchymal stem cells (hWJ-MSCs) are known to express genes and factors involved in angiogenesis and immunomodulation. We used a cecal ligation and puncture (CLP) model to analyze the role of hWJ-MSCs in sepsis-related organ dysfunction. We used flow cytometry to evaluate hWJ-MSC phenotypes. We divided Wistar rats into groups: sham (sham-operated); CLP; and CLP+MSC (106 WJ-MSCs, i.p., 6 h after CLP). At 24 h post-CLP, we evaluated renal function, liver and other variables. hWJ-MSCs were negative for CD3, CD34, CD45 and HLA-DR, whereas they were positive for CD73, CD90 and CD105. In sepsis, treatment with MSC reduced mortality, improved glomerular filtration rate (measured by inulin clearance), tubular function, reduced liver damage and decreased the inflammatory markers. The treatment also showed an anti-apoptotic effect and protected the renal tissue and endothelium by up-regulation the expression of VEGF, AQP2 and eNOS. In conclusion, hWJ-MSCs decrease renal and hepatic injury, therefore, may play a protective role in sepsis

Introdução. O transplante de células é possibilidade terapêutica promissora para muitas doenças neurológicas. Nos últimos anos, a possibilidade do isolamento de células-tronco dos tecidos adultos, por exemplo da medula-óssea, atrai a atenção da comunidade científica, estratégia que minimiza os problemas éticos relativos ao uso de tecido fetal para implantes visando ao tratamento de doenças neurológicas. Entretanto, a eficiência da transdiferenciação de células-tronco mesenquimais em neurônios, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem desconhecidos. A obtenção de neurônios maduros ocorreu somente em sistemas de co-cultura, o que induz a questão se a diferenciação representa um potencial das células per si, ou se é possível somente devido à fusão com neurônios maduros. Objetivos. No presente trabalho, pretendeu-se verificar o potencial de as células-tronco mesenquimais tornarem-se neurônios e esclarecer os possíveis mecanismos envolvidos nesse processo. Material e métodos. Células-tronco mesenquimais foram isoladas de 20 doadores voluntários normais e caracterizadas por análise de separação celular ativada por fluorescência. A multipotencialidade foi investigada ao se diferenciar as células em condrócitos e osteócitos. A capacidade de auto-renovação foi confirmada pelo ensaio de incorporação de BrdU. Ulteriormente, as células foram diferenciadas por uma semana em meio contendo AMPc, IBMX, ou combinação de ambos, e os resultados foram comparados com o cultivo em meio básico. Diferentes bloqueadores de Ca2+ ou inibidores de PKA foram usados como tentativa de se impedir a diferenciação, ocorrência que foi mensurada com imunocitoquímica para NF-200 (marcador de neurônios maduros). O registro eletrofisiológico por meio de patch clamp foi usado para se confirmar o fenótipo neuronal. As figuras foram configuradas em microscopia confocal. Para análise estatística foi utilizada ANOVA com teste post-hoc. Resultados. As células isoladas expressaram CD90, 105, 44 e 13 mas foram negativas para CD34 e 45. Isto significa que não são de origem hematopoiética; 98,74 ± 0,43% das células incorporaram BrdU em 24 horas. Após o isolamento, foi possível diferenciá-las em condrócitos ou osteócitos. Em situação controle, não foram evidenciadas células positivas para NF200. Por outro lado, ocorreu positividade em 10,75% ± 1,35 (p<0,0001) das células sob IBMX e, em 15,18% ± 1,12, sob a combinação cAMP e IBMX (p<0,0001). Foram registradas correntes de Na+ e K+ dependentes de voltagem, mas não potenciais de ação. A diferenciação foi inibida com PKAi (5,73% ± 0,42, p<0,0001), nifedipina (5,79% ± 0,98, p<0,0001), Ni2+ (7,06% ± 1,68, p<0,0001) e Cd2+ (0 ± 0, p<0,0001). Discussão. Isolou-se uma população de células-tronco estromais da medula-óssea de seres humanos que se mostrou multipotencial e auto-renovável. O aumento da concentração de AMPc no meio elevou a concentração de neurônios para 15%. A diferenciação parece depender da via PKA mas também envolve a concentração intracelular de Ca2+. Conclusão. O correto entendimento de como as células-tronco mesenquimais diferenciam-se pode contribuir para aumentar a eficácia do método e, talvez um dia, tornar possível o uso dessa ferramenta no campo clínico. / Introduction. Cell transplantation has been considered a promising therapeutic approach for many neurological diseases. The possibility of isolation of stem cells from adult tissues, i.e. bone marrow, has attracted the attention of the scientific community in the recent years. This strategy is interesting on avoiding the ethical issues regarding the use of fetal tissue for neural implants. Moreover, the efficiency of the transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons, and the mechanisms involved in this process remain largely unknown. The obtention of mature neurons was described only in coculture systems, what raised the question if the differentiation is a potential of the cells itself, or if it is possible only due to fusion with mature neurons. Objectives. In the present investigation, we aimed to verify the potential of MSCs to differentiate into neurons, and also to clarify the possible mechanisms involved on it. Material and methods. MSCs were isolated from 20 healthy human subjects and characterized by FACS-analysis. Multipotentiality was addressed by differentiating them into chondrocytes and osteocytes. The self-renewal capacity was confirmed with BrdU-incorporation assay. Afterwards, cells were differentiated for 1 week in a medium containing cAMP, IBMX, or a combination of both, and the results were compared with cells treated in basal-medium condition. Different Ca2+-blockers and PKA-inhibitor peptide were used on an attempt to impair differentiation, which was quantified with NF-200 immunostaining (a marker of mature neurons). Patch-clamp recording was used to confirm neuronal phenotype. Pictures were taken in confocal microscope. For statistical analysis ANOVA with a post-hoc test was used. Results. The isolated cells expressed CD90, 105, 44, and 13, but were negative for CD34 and 45, meaning that they were non-hematopoiethic; 98.74 ± 0.43 % of them incorporated BrdU in 6hs. After isolation, they differentiated into chondrocytes and osteocytes. In a control situation, no NF200 positive cell was seen. On the other hand, 10.75% ± 1.35 (p<.0001) of positivity was seen under IBMX and 15.18% ± 1.12 in the combination of cAMP with IBMX (p<.0001). Na+ and K+-voltage gated currents were recorded. Differentiation was impaired with PKAi (5.73% ± 0.42, p<.0001), nifedipin (5.79% ± 0.98, p<.0001), Ni2+ (7.06% ± 1.68, p<.0001), and Cd2+ (0 ± 0, p<.0001). Discussion. We were able to isolate a population of stromal stem cells from the bone marrow of human subjects, since they were multipotential and self-renewable. Increasing the concentration of cAMP raised the percentage of neurons up to 15%. The differentiation seems to be dependent on the PKA pathway, but also involved the intracellular concentration of Ca2+. Conclusions. The complete understanding of how MSC differentiate can contribute to increase the efficiency of the method and thus make possible to use this powerful tool in the clinical practice.

Introdução. A possiblidade de restauração do Sistema Nervoso Central representa um desafio em Neurociências, e a integração bem sucedida de células-tronco no cérebro adulto tem se tornado um importante objetivo. Objetivo. Testar a hipótese de que a sobrevivência e diferenciação de células-tronco mesenquimais (CTMs) sejam dependentes de condições microambientais de acordo com o alvo de implante no cérebro. Métodos. CTMs foram isoladas de ratos adultos e geneticamente modificadas por meio de transfecção lentiviral para expressarem GFP. O fenótipo neuronal foi satisfatoriamente induzido in vitro. Uma suspensão de células foi implantada estereotaxicamente no cérebro de 40 ratos da mesma linhagem, em uma área neurogênica (hipocampo) e outra não-neurogênica (estriado). Os animais foram sacrificados 6 e 12 semanas após a cirurgia, e os cérebros foram corados com marcadores de neurônios maduros. Células co-expressando NeuN e GFP foram contadas estereologicamente nos dois alvos. Resultados. A população de célula isolada foi capaz de gerar 14,5 ± 1,1 % de neurônios NF200-positivos in vitro. Uma vez implantados no hipocampo, as células migraram além do enxerto e geraram neurônios maduros (1634±231 células GFP/NeuN+). Por outro lado, maciça degeneração celular foi vista no estriado, onde não ocorreu migração significativa, sendo que somente 108±24 NeuN/GFP+ neurônios (p<0.001) foram contados. Conclusão. Nossos dados demonstraram que a sobrevivência e diferenciação de CTMs são altamente dependentes do sítio de implante no cérebro hospedeiro, indicando assim a importância de um microambiente permissivo. Futuros estudos para identificação dos fatores pró-neurogênicos presentes no hipocampo poderão subsequentemente permitir a integração de células-tronco em áreas do SNC nãopermissivas, assim contribuindo para se alcançar o objetivo de introduzir a restauração do SNC na prática clínica. / The possibility of CNS restoration represents a challenge in Neuroscience, and the successful integration of stem cells in adult brain has become an important goal. The working hypothesis of the present study is that survival and neurodifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) may be dependent upon microenvironmental conditions according to the site of implant in the brain. Methods: MSCs were isolated from adult rats and labeled with eGFP lentivirus. The neuronal phenotype was successfully induced in vitro. A cell suspension was implanted stereotactically into the brain of 40 young rats of the same strain, in neurogenic (hippocampus) and non-neurogenic (striatum) areas. Animals were sacrificed six or twelve weeks after surgery, and brains were stained for mature neuronal markers. Cells co-expressing NeuN-GFP were counted stereologically at both targets. Results: The isolated cell population was able to generate 14.5±1.1% of NF200+-neurons in vitro. Once implanted into the hippocampus, cells migrated away from the graft and gave rise to mature neurons (1634±231 cells GFP/NeuN+). By contrast, massive cell degeneration was seen in the striatum, with no significant migration, while only 108±24 NeuN/GFP+ neurons (p<0.001) were counted. Conclusions: Our data demonstrated that survival and differentiation of MSCs are strongly dependent upon the site of implant in the brain, thus indicating the importance of a permissive microenvironment. Future studies for identification of the pro-neurogenic factors present in the hippocampus could subsequently allow the integration of stem cells into non-permissive areas of the CNS and thus contribute for the challenging goal of introducing CNS repair in the clinical practice.