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The interplay between physiology and evolution in microorganisms is extremely relevant from the stand-point of human health, the environment, and biotechnology; yet microbial physiology and microbial evolution largely continue to grow as disjoint fields of research. The goal of this dissertation was to use experimental evolution to study methylamine metabolism in Methylobacterium extorquens species. Methylotrophs like the M. extorquens species grow on reduced single carbon compounds and are the largest biological sink for methane. M. extorquens AM1, the model system for the study of aerobic methylotrophy, has an unstable genome and severe growth defects as a result of laboratory domestication. First, I describe the genomic, genetic, and phenotypic characterization of a new model system for the study of aerobic methylotrophy: M. extorquens PA1. This strain has a stable genome, was recently isolated from a known ecological niche, and is closely related to AM1. Whereas PA1 grew 10-50% faster than AM1on most substrates, it was five-fold slower on methylamine. The PA1 genome encodes a poorly characterized but ecologically relevant N-methylglutamate pathway whereas AM1 also encodes the well-characterized methylamine dehydrogenase for methylamine oxidation. I characterized the genetics of the N-methylglutamate pathway in PA1 to resolve a linear topology that requires the formation of two, unique amino acid intermediates during methylamine oxidation. I also showed that methylamine metabolism via the N-methylglutamate pathway routes carbon flux in a manner completely different from previous instances of methylotrophy. Next, I evolved replicate populations of PA1 on methylamine for 150 generations. Based on the empirical heuristic that the initial fitness is negatively correlated to the rate of adaptation, it was expected that the fitness gain would be rapid. However, methylamine fitness did not improve at all; adaptive constraints led to evolutionary recalcitrance despite low initial fitness. These adaptive constraints were alleviated by the horizontal gene transfer of an alternate, functionally degenerate metabolic module. Finally, I uncovered ecologically distinct roles for two functionally degenerate routes for methylamine oxidation pathways in the AM1 genome; the highly expressed, efficient route is primarily used for growth and the tightly regulated, energetically expensive route is used for assimilating nitrogen in methylamine-limiting environments.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第23251号 / 農博第2458号 / 新制||農||1085(附属図書館) / 学位論文||R3||N5341(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 阪井 康能, 教授 小川 順, 教授 井上 善晴 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Abstract To date, plant endophytic bacteria have mainly been studied in roots of crop plants. However, shoot-associated endophytes are less diverse than root-associated ones. Hence, endophytic bacteria of plant shoots evolved different traits, than root colonizers, especially with types of host tissues infected and patterns of growth and development. This study found Methylobacterium extorquens colonized pine seedlings similarly to stem-colonizing rhizobia of other plants. M. extorquens DSM13060 was isolated from meristematic cells in shoot tip cultures of Scots pine (Pinus sylvestris L.). M. extorquens infected the plant stem through epidermis or stomatal apertures, forming infection pockets in the root and stem epidermis, or cortex. Post-infection, thread-like infection structures passed through the endoderm, invading vascular tissues. This led to systemic colonization of above and below ground-parts, observed in in vitro grown Scots pine. A novel mechanism enabling development of endophyte-host symbiosis is discovered within the M. extorquens – Scots pine model. This mechanism involves ability of M. extorquens to produce polyhydroxybutyrates (PHB) to protect itself from host-induced oxidative stress during infection. Upon initial colonization on the host surface, M. extorquens DSM13060 consumes methanol as a carbon source, using it to biosynthesize PHB. PHB are then degraded, upon host infection, by PHB depolymerases (PhaZ) to yield methyl-esterified 3-hydroxybutyrate oligomers. These oligomers have substantial antioxidant activity towards host-induced oxidative stress, enabling the bacterium to bypass host defenses and colonize further tissues. The bacteria can also store PHBs for future protection. The capacity for PHB production and, thus, protection from oxidative stress, is discovered in a wide taxonomic range of bacteria. This study also shows meristematic endophytes are important in growth and development of their hosts. Unlike many bacterial root endophytes, M. extorquens DSM13060 does not induce plant growth through hormones. However, this bacterium can colonize the interior of living host cells, where it aggregates around the nucleus of the host plant. M. extorquens DSM13060 genome encodes nucleomodulins, eukaryotic-like transcription factors, which may intervene in host transcription and metabolism. / Tiivistelmä Kasvin sisällä elävien endofyyttisten bakteerien tutkimus on perinteisesti keskittynyt viljelykasveihin ja niiden juuristoon. Kasvien maanpäällisissä versoissa elävät endofyytit eroavat merkittävästi juuriston bakteereista lajirikkauden suhteen. Versoissa eläville bakteereille on todennäköisesti kehittynyt erilaisia sopeumia kuin juuriston endofyyttilajeille. Endofyyttinen Methylobacterium extorquens DSM13060 elää männyn silmujen kasvusolukossa lisäten isäntäkasvin kasvua. Tässä tutkimuksessa M. extorquens –bakteerin todettiin siirtyvän männyn taimiin samoja mekanismeja käyttäen kuin Rhizobium –suvun typensitojabakteerit. Metylobakteeri tunkeutui isäntäkasviin aktiivisesti soluseinien läpi tai varren ilmarakojen kautta muodostaen mikropesäkkeitä juuren ja varren pinnoille, sekä infektiotaskuja kuorisolukkoon. Bakteeri eteni infektiolankojen avulla endodermin ohi johtosolukoihin, mikä mahdollisti bakteerin siirtymisen muualle taimeen. M. extorquens käytti kasvin pinnalla runsaana olevaa metanolia hiilenlähteenään, varastoiden sen solujen sisäiseksi polyhydroksibutyraatti (PHB) polymeeriksi. Infektion myöhemmissä vaiheissa bakteeri hajotti varastoidun polymeerin PHB-depolymeraasientsyymien (PhaZ) avulla lyhyiksi rasvahappoketjuiksi. Nämä metyloidut 3-hydroksibutyraatin oligomeerit suojasivat bakteeria isäntäkasvin puolustuksen tuottamilta happiradikaaleilta mahdollistaen infektion etenemisen. Tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella endofyytin solunsisäinen energiavarasto, PHB, toimii pelkistävänä varastona ympäristön hapettavaa stressiä vastaan. Löytö osoitti uudenlaisen antioksidatiivisen puolustumekanismin, joka on levinnyt laajalle bakteerikunnassa ja liittyy yleisesti bakteerien kykyyn sietää vaikeita olosuhteita. Toisin kuin useat juurissa elävät bakteeriendofyytit, M. extorquens ei lisää isäntäkasvin kasvua tuottamalla kasvihormoneja. Bakteeri kykenee elämään männyn elävien solujen sisällä tumien läheisyydessä. M. extorquens DSM13060 genomi sisältääkin useita geenejä, jotka koodaavat nukleomoduliineja, eukaryoottisolujen säätylytekijöiden kaltaisia entsyymejä, joiden avulla bakteeri todennäköisesti vaikuttaa isäntäkasvin aineenvaihduntaan. Vastaavaa vaikutusmekanismia ei ole aikaisemmin kuvattu endofyyteillä. Tutkimus korostaa aiemmin tuntemattomien meristemaattisten bakteeriendofyyttien merkitystä isäntäkasvin kasvussa ja erilaistumisessa.

Le dichlorométhane (DCM ; CH2Cl2) est un polluant chloré toxique émis dans l’environnement principalement par les activités industrielles. Ce polluant peut être dégradé par des bactéries méthylotrophes qui utilisent des composés en C1 réduits comme seule source de carbone et d’énergie. La protéobactérie Methylorubrum extorquens DM4 porte quatre gènes dcm au sein du transposon catabolique dcm très conservé chez les bactéries dégradant le DCM. Le gène dcmA code la DCM déshalogénase de la famille des glutathion-S transférases essentielle à la croissance avec le DCM. Son activité est modulée par DcmR, un facteur de transcription qui régule l’expression de dcmA ainsi que son propre gène, orienté de manière divergente par rapport à dcmA. DcmR porte un domaine hélice-tour-hélice de fixation à l'ADN et un second domaine appelé methanogen / methylotroph, DcmR sensory (MEDS) potentiellement impliqué dans la fixation d’un composé hydrocarboné ligand. Les objectifs de ma thèse étaient de répondre à plusieurs questions : i) quel est le niveau d’expression des transcrits dcm et des protéines correspondantes par rapport à d’autres gènes et protéines dont l’abondance est modifiée en réponse à la croissance sur le DCM ? ii) Comment le facteur de transcription DcmR intervient-il dans la régulation des gènes dcm ? iii) Quelle est la variabilité du gène dcmR et de son environnement génétique in situ ? Des méthodes globales « -omiques » de transcriptomique et de protéomique ont permis d’inventorier les ARN et les protéines dont l’abondance varie chez la souche sauvage DM4 cultivée soit avec le DCM ou le méthanol, le substrat de référence de la méthylotrophie. Les gènes dcm sont parmi les plus exprimés en présence de DCM, ce qui confirme leur régulation en présence de DCM. Deux approches complémentaires ciblant la détermination des sites d’initiation de la transcription (TSS-Seq) et de la traduction (N-terminome) ont permis la recherche de motifs de régulation dans les régions 5’UTR (5’-untranslated terminal region) et les promoteurs de gènes régulés en réponse à la croissance avec le DCM. Le rôle régulateur de dcmR a été étudié en comparant les phénotypes de croissance, l’activité promotrice par fusion transcriptionnelle, la quantification des ARN et des protéines des gènes dcm chez la souche sauvage par rapport à des mutants du gène dcmR seul ou combiné à d’autres gènes dcm mutés. Ces travaux ont permis de confirmer qu’en absence de DCM, DcmR inhibe la transcription de son propre gène ainsi que celle de dcmA. Outre DcmR, la répression nécessite aussi l’expression d’au moins un des autres gènes dcm et ceci par un mécanisme indépendant des boîtes de 12 pb conservées dans les promoteurs des gènes dcmR et dcmA. Lors de la croissance en condition DCM, l’absence du gène dcmR confère une vitesse de croissance ralentie, qui ne résulte pas d’une différence de production des ARN et des protéines codées par le transposon dcm. Pour que l’expression du gène dcmA soit activée, l’ensemble de la région intergénique entre dcmR et dcmA doit être présente, ce qui suggère la présence de sites de régulation pour la fixation d’un facteur de transcription indépendant de DcmR. L’ensemble de ces résultats a permis de proposer un nouveau modèle de régulation des gènes dcm. Alors que le gène dcmR a été détecté en quantité similaire à celle du gène dcmA par qPCR dans des échantillons de sites contaminés par le DCM, une analyse bioinformatique à partir des données de séquences indique que des gènes dcmR-like sont trouvés dans d’autres contextes génétiques que celui du transposon catabolique dcm. Ainsi, DcmR pourrait exercer un rôle de régulateur dans d’autres contextes ouvrant de nouvelles pistes pour l’identification des ligands du domaine MEDS. / Dichloromethane (DCM; CH2Cl2) is a toxic chlorinated pollutant mainly emitted in the environment through industrial activities. Some methylotrophic bacteria that utilize reduced one carbon compounds as sole source of carbon and energy can degrade DCM. The four dcm genes found in the catabolic dcm transposon are highly conserved among DCM-degrading bacteria, including in the Proteobacterium Methylorubrum extorquens DM4. The dcmA gene encodes a DCM dehalogenase of the glutathione-S transferase family which is essential for growth with DCM. The transcriptional factor DcmR regulates the expression of dcmA and its own gene, two genes which are divergently oriented. DcmR consists of a helix-turn-helix domain for DNA fixation and of a domain, called MEDS for ‘methanogen / methylotroph, DcmR sensory’, proposed to bind a hydrocarbon ligand. The aim of my PhD was to address the following questions: i) What is the expression level of dcm transcripts and their corresponding proteins compared to other genes and proteins whose abundance is modulated in response to growth with DCM? ii) How does DcmR regulate the expression of the dcm genes? iii) How variable is dcmR and its genetic environment in situ? Global transcriptomic and proteomic approaches were followed to inventory transcripts and proteins whose abundance varied in the wild-type DM4 strain grown with DCM compared to with methanol, the reference substrate for methylotrophy. The dcm genes were among the most expressed in cultures grown with DCM, confirming their regulation in response to DCM. The identification of transcription start sites (TSS-Seq) and translation starts (N-terminome) allowed the subsequent search for regulation motifs in the promoter and 5’-untranslated terminal regions (5’UTR) of regulated genes in response to DCM utilization. The role of dcmR was studied using growth phenotypes, promoter activities in transcription fusion assays, dcm transcript and corresponding protein product quantification, comparing the wild-type strain with strains mutated only in dcmR, or also in other dcm genes. In absence of DCM, DcmR inhibited the transcription of its own gene and of dcmA. In addition to DcmR, repression requires the expression of one of the other dcm genes by a mechanism that does not involve previously predicted DcmR-binding sites (a 12 bp conserved box shared by dcmR and dcmA promoters). Mutants with impaired dcmR show slower growth with DCM, although no difference in transcript or protein abundance encoded by the dcm transposon was observed. The complete dcmR-dcmA intergenic region was shown to be required to activate dcmA expression. This suggests that regulatory sites present in the intergenic region may be involved in DcmR-independent transcription activation. Taken together, these data allowed to propose a new model of dcm gene regulation. The dcmR gene was detected and quantified in similar amounts as dcmA in DCM-contaminated environmental samples, despite the fact that bioinformatics analysis of sequence databases suggests that dcmR-like genes are not necessary associated with the catabolic dcm transposon. Thus, DcmR may play a role in other contexts. This may provide new leads for future investigations of potential ligands of the MEDS domain.

Le chlorométhane (CH3Cl) est un composé organique volatile responsable de plus de 15 % de la dégradation de l’ozone stratosphérique due aux composés chlorés. Il est produit majoritairement par les plantes vivantes ou en décomposition. Les bactéries capables d’utiliser le CH3Cl comme source de carbone pour leur croissance peuvent jouer un rôle de filtre dans les émissions de CH3Cl vers l'atmosphère. Ce processus biologique reste à quantifier dans l'environnement, notamment pour les sols forestiers considérés comme un puits majeur de ce composé.Dans les études environnementales, le gène cmu A est utilisé comme biomarqueur de la dégradation bactérienne du CH3Cl. Il code une chlorométhane méthyltransférase essentielle à la croissance bactérienne avec le CH3Cl parla voie cmu (pour chloromethane utilisation), la seule caractérisée à ce jour. Mon projet de thèse avait un double objectif : i) l’approfondissement des connaissances de l’adaptation au CH3Cl chez une bactérie méthylotrophe modèle, Methylobacterium extorquens CM4; ii) l’exploration de la diversité des bactéries CH3Cl-dégradantes de sols forestiers. L’étude RNAseq chez la souche CM4 a montré que la croissance avec le CH3Cl s'accompagne de différences dans la transcription de 137 gènes de son génome (6.2 Mb) par rapport à sa croissance sur le méthanol (CH3OH). Les gènes de la voie cmu, ainsi que d’autres gènes impliqués dans le métabolisme de cofacteurs essentiels à l’utilisation du CH3Cl par cette voie et eux aussi portés par le plasmide pCMU01 de la souche, en font partie. Les paralogues de ces gènes localisés sur le chromosome ne sont quant à eux pas différentiellement exprimés. En revanche, d’autres gènes du chromosome, potentiellement impliqués dans l’excrétion de protons produits lors de la déshalogénation (hppA), la régénération du NADP+ (pnt), ou le métabolisme du cofacteur tétrahydrofolate(gènes gcvPHT), le sont. L’étude de la diversité des bactéries CH3Cl-dégradantes de sol forestier de la réserve naturelle de Steigerwald (Allemagne) a été réalisée sur des microcosmes par une approche de « Stable Isotope Probing ». Les microorganismes capables d’assimiler le CH3Cl marqué au [13C] incorporent cet isotope lourd du carbone dans leur ADN. L'analyse des séquences amplifiées par PCR des gènes codant l’ARN 16S des fractions d'ADN enrichies en [13C] a permis de mettre en évidence de nouveaux phylotypes, du genre Methylovirgula et de l’ordre des Actinomycetales, distincts de ceux auxquelles les souches dégradant le CH3Cl isolées jusqu'ici sont affiliées. En revanche, les séquences du gène cmuA et d’autres gènes du métabolisme méthylotrophe obtenues par PCR à partir de l'ADN enrichi en [13C] sont très proches de celles des souches CH3Cl-dégradantes connues. Les résultats obtenus suggèrent ainsi que des bactéries ayant acquis par transfert horizontal les gènes de dégradation de la voie cmu ou ne possédant pas de gène cmuA contribuent au filtrage biologique du CH3Cl des sols forestiers. A l'avenir, le couplage de différentes méthodes moléculaires et des approches culturales visera à découvrir de nouvelles voies microbiennes de l’utilisation du CH3Cl, et à caractériser l’abondance et la diversité des métabolismes impliqués dans la dégradation du CH3Cl dans les sols et d'autres compartiments environnementaux. / Chloromethane (CH3Cl) is a volatile organic compound responsible for over 15% of stratospheric ozone degradation due to chlorinated compounds. It is mainly produced by living and decaying plants. Bacteria utilizing CH3Cl as sole carbon and energy source for growth were shown to be involved in the filtering of CH3Cl emissions to the atmosphere. This biological process remains to be quantified in the environment, especially for forest soil, a major CH3Cl sink. The cmuA gene is used as a biomarker of bacterial CH3Cl degradation in environmental studies. It encodes a CH3Cl methyltransferase essential for bacterial growth by the cmu (chloromethane utilization) pathway for growth with CH3Cl and the only one characterized so far. My thesis project had a double aim: i) In depth studies of CH3Cl adaptation of a model methylotrophic bacterium, Methylobacterium extorquens strain CM4; ii) Exploration of bacterial CH3Cl-utilizers in forest. An RNAseq study of strain CM4 has shown that growth with CH3Cl leads to a difference of transcription of 137 genes in its 6.2 Mb genome compared to growth with methanol (CH3OH). Among those, genes of the cmu pathway and other genes involved in the metabolism of essential cofactors for CH3Cl utilization by this pathway, are all plasmid pCMU01-encoded. Paralogous genes located on the chromosome were not differentially expressed. On the other hand, other chromosomal genes potentially involved in extruding protons generated during CH3Cl deshalogenation (hppA), NADP+ regeneration (pnt), or in the cofactor tetrahydrofolate metabolism (gcvPHT) were differentially expressed. The diversity of CH3Cl-degrading bacteria in forest soil of the German natural park of Steigerwald was studied in microcosms using stable isotope probing. Microorganisms able to assimilate labeled [13C]- CH3Cl incorporate this heavy carbon isotope in their DNA. Sequence analysis of the PCR-amplified 16S RNA encoding gene from [13C]-DNA fractions uncovered phylotypes of the genus Methylovirgula and of the order of the Actinomycetales, which were not associated with bacterial CH3Cl degradation so far. In contrast, PCR-amplified sequences of cmuA and other genes of methylotrophic metabolism were closely related to known CH3Cl-degrading isolates. These results suggest that bacteria containing genes of the cmu pathway acquired by horizontal gene transfer as well as bacteria lacking the cmu pathway contribute to biological filtering of CH3Cl in forest soil. Future experiments coupling molecular and culture methods will aim to discover new CH3Cl-degrading pathways and to characterize the abundance and diversity of CH3Cl-degradation metabolism in soil and other environmental compartments.