Abstract The heart adapts to hemodynamic overload with cardiac hypertrophy. Initially the increase in heart mass normalizes wall stress and permits normal cardiac function. In the long term pathological growth is associated with increased heart size, loss of functional myocytes and fibrotic replacement, heart dilatation and cardiac dysfunction, which can ultimately lead to heart failure. Vasoactive peptides participate in the regulation of cardiac contractility in an auto/paracrine way, but the peptidergic signaling pathways are largely unknown. The present study aimed to characterize the signaling mechanisms mediating the positive inotropic effect of endothelin-1 (ET-1) and the effects of prolactin releasing peptide (PrRP) on cardiac contractility in the isolated perfused rat heart preparation. The study demonstrated that mitogen-activated protein kinases (MAPK) have opposing roles in the regulation of cardiac contractility stimulated by ET-1. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) mediated positive inotropic response to ET-1 was found to be counterbalanced by p38-MAPK. In addition, the effect of ET-1 was partly dependent on enhanced NADPH oxidase reactive oxygen species (ROS) generation, which activated the ERK1/2 pathway. In contrast, β-adrenergic inotropic effect was limited by stimulation of ROS production via negating phospholamban phosphorylation. The positive inotropic effect of ET-1 was counterbalanced by guanylyl cyclase (GC)-cGMP-protein kinase G (PKG) pathway and neuronal nitric oxide synthase (nNOS). PrRP was found to exert a direct positive inotropic effect which was independent of cAMP and was suppressed by concurrent activation of protein kinase Cα (PKCα) and protein phosphatase 1 (PP1), and dephosphorylation of phospholamban. In conclusion, in the present study signaling pathways in the acute regulation of cardiac contractility stimulated by ET-1 were characterized. The results suggest that the positive inotropic effect of ET-1 is mediated by ROS and ERK1/2 while p38-MAPK counterbalances the effect of ET-1. In addition, GC-cGMP-PKG pathway and nNOS modulate the response to ET-1. The study also established the previously unknown cardiac effects of PrRP. The findings provide a better understanding of molecular mechanisms involved in the regulation of cardiac contractility, and may indicate potential targets for novel therapeutic interventions. / Tiivistelmä Sydänlihaksen lisääntynyt mekaaninen kuormitus esimerkiksi verenpainetaudin tai sydäninfarktin yhteydessä voi johtaa sydämen kammion seinämän paksuuntumiseen eli hypertrofiaan. Hypertrofia auttaa sydäntä sopeutumaan lisääntyneeseen työmäärään, mutta se on myös sydän- ja verisuonitautitapahtumien riskitekijä. Pitkään jatkuva kuormitus johtaa usein sydämen pumppausvoiman heikkenemiseen ja sydämen vajaatoimintaan. Sydän tuottaa useita paikallisesti vaikuttavia vasoaktiivisia tekijöitä, jotka osallistuvat sydämen supistuvuuden säätelyyn. Väitöskirjatutkimuksessa tutkittiin signaalinvälitysjärjestelmiä, jotka osallistuvat endoteliini-1:n (ET-1) sydämen supistusvoimaa lisäävän eli positiivisen inotrooppisen vaikutuksen muodostumiseen sekä selvitettiin prolaktiinia vapauttavan peptidin (PrRP) vaikutuksia sydämen supistusvoimaan käyttämällä koemallina eristettyä, perfusoitua rotan sydäntä. Väitöskirjatyön tutkimustulokset osoittivat, että mitogeeni-aktivoituvat proteiinikinaasit (MAPK) ERK1/2 ja p38-MAPK osallistuvat ET-1:n inotrooppisen vaikutuksen säätelyyn. ERK1/2 välitti, ja p38-MAPK rajoitti ET-1:n lisäämää supistusvoiman kasvua. NADPH-oksidaasin tuottamat reaktiiviset happiradikaalit välittivät sydämessä ET-1:n inotrooppista vaikutusta ja ERK1/2 fosforylaatiota. Toisaalta NADPH-oksidaasin tuottamat happiradikaalit rajoittivat β-adrenergisen agonistin inotrooppista vaikutusta. Guanylaattisyklaasi (GC)-cGMP-proteiinikinaasi G (PKG) -järjestelmä ja neuronaalinen typpioksidisyntaasi (nNOS) vaimensivat ET-1:n lisäämää sydämen supistusvoiman kasvua. PrRP lisäsi sydämen inotropiaa syklisestä AMP:stä riippumattomalla tavalla, mutta vasteen säätelyyn havaittiin osallistuvan proteiinikinaasi C ja proteiinifosfataasi 1. Väitöskirjatutkimuksessa saatiin uutta tietoa solunsisäisistä viestinvälitysjärjestelmistä, jotka osallistuvat sydämen supistusvoimaan säätelyyn. Havaintojen perusteella ET-1:n positiivisen inotrooppisen vaikutuksen muodostumista välittävät reaktiiviset happiradikaalit ja ERK1/2, kun taas p38-MAPK rajoittaa vastetta. Lisäksi GC-cGMP-PKG -järjestelmä ja nNOS osallistuvat ET-1:n vaikutusten säätelyyn. Tutkimuksessa havaittiin myös, että PrRP vaikuttaa sydämen supistuvuuteen. Solutason mekanismien yksityiskohtien tunteminen voi mahdollistaa tulevaisuudessa sydän- ja verisuonisairauksien, kuten sydämen hypertrofian ja vajaatoiminnan, hoitomenetelmien tehostumisen ja mahdollisesti uudentyyppisten hoitomenetelmien kehittämisen.

Abstract To date, plant endophytic bacteria have mainly been studied in roots of crop plants. However, shoot-associated endophytes are less diverse than root-associated ones. Hence, endophytic bacteria of plant shoots evolved different traits, than root colonizers, especially with types of host tissues infected and patterns of growth and development. This study found Methylobacterium extorquens colonized pine seedlings similarly to stem-colonizing rhizobia of other plants. M. extorquens DSM13060 was isolated from meristematic cells in shoot tip cultures of Scots pine (Pinus sylvestris L.). M. extorquens infected the plant stem through epidermis or stomatal apertures, forming infection pockets in the root and stem epidermis, or cortex. Post-infection, thread-like infection structures passed through the endoderm, invading vascular tissues. This led to systemic colonization of above and below ground-parts, observed in in vitro grown Scots pine. A novel mechanism enabling development of endophyte-host symbiosis is discovered within the M. extorquens – Scots pine model. This mechanism involves ability of M. extorquens to produce polyhydroxybutyrates (PHB) to protect itself from host-induced oxidative stress during infection. Upon initial colonization on the host surface, M. extorquens DSM13060 consumes methanol as a carbon source, using it to biosynthesize PHB. PHB are then degraded, upon host infection, by PHB depolymerases (PhaZ) to yield methyl-esterified 3-hydroxybutyrate oligomers. These oligomers have substantial antioxidant activity towards host-induced oxidative stress, enabling the bacterium to bypass host defenses and colonize further tissues. The bacteria can also store PHBs for future protection. The capacity for PHB production and, thus, protection from oxidative stress, is discovered in a wide taxonomic range of bacteria. This study also shows meristematic endophytes are important in growth and development of their hosts. Unlike many bacterial root endophytes, M. extorquens DSM13060 does not induce plant growth through hormones. However, this bacterium can colonize the interior of living host cells, where it aggregates around the nucleus of the host plant. M. extorquens DSM13060 genome encodes nucleomodulins, eukaryotic-like transcription factors, which may intervene in host transcription and metabolism. / Tiivistelmä Kasvin sisällä elävien endofyyttisten bakteerien tutkimus on perinteisesti keskittynyt viljelykasveihin ja niiden juuristoon. Kasvien maanpäällisissä versoissa elävät endofyytit eroavat merkittävästi juuriston bakteereista lajirikkauden suhteen. Versoissa eläville bakteereille on todennäköisesti kehittynyt erilaisia sopeumia kuin juuriston endofyyttilajeille. Endofyyttinen Methylobacterium extorquens DSM13060 elää männyn silmujen kasvusolukossa lisäten isäntäkasvin kasvua. Tässä tutkimuksessa M. extorquens –bakteerin todettiin siirtyvän männyn taimiin samoja mekanismeja käyttäen kuin Rhizobium –suvun typensitojabakteerit. Metylobakteeri tunkeutui isäntäkasviin aktiivisesti soluseinien läpi tai varren ilmarakojen kautta muodostaen mikropesäkkeitä juuren ja varren pinnoille, sekä infektiotaskuja kuorisolukkoon. Bakteeri eteni infektiolankojen avulla endodermin ohi johtosolukoihin, mikä mahdollisti bakteerin siirtymisen muualle taimeen. M. extorquens käytti kasvin pinnalla runsaana olevaa metanolia hiilenlähteenään, varastoiden sen solujen sisäiseksi polyhydroksibutyraatti (PHB) polymeeriksi. Infektion myöhemmissä vaiheissa bakteeri hajotti varastoidun polymeerin PHB-depolymeraasientsyymien (PhaZ) avulla lyhyiksi rasvahappoketjuiksi. Nämä metyloidut 3-hydroksibutyraatin oligomeerit suojasivat bakteeria isäntäkasvin puolustuksen tuottamilta happiradikaaleilta mahdollistaen infektion etenemisen. Tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella endofyytin solunsisäinen energiavarasto, PHB, toimii pelkistävänä varastona ympäristön hapettavaa stressiä vastaan. Löytö osoitti uudenlaisen antioksidatiivisen puolustumekanismin, joka on levinnyt laajalle bakteerikunnassa ja liittyy yleisesti bakteerien kykyyn sietää vaikeita olosuhteita. Toisin kuin useat juurissa elävät bakteeriendofyytit, M. extorquens ei lisää isäntäkasvin kasvua tuottamalla kasvihormoneja. Bakteeri kykenee elämään männyn elävien solujen sisällä tumien läheisyydessä. M. extorquens DSM13060 genomi sisältääkin useita geenejä, jotka koodaavat nukleomoduliineja, eukaryoottisolujen säätylytekijöiden kaltaisia entsyymejä, joiden avulla bakteeri todennäköisesti vaikuttaa isäntäkasvin aineenvaihduntaan. Vastaavaa vaikutusmekanismia ei ole aikaisemmin kuvattu endofyyteillä. Tutkimus korostaa aiemmin tuntemattomien meristemaattisten bakteeriendofyyttien merkitystä isäntäkasvin kasvussa ja erilaistumisessa.

Abstract Venous malformations (VMs) are localized defects in vascular morphogenesis which can seriously impede or even threaten the patient’s life. VMs are characterized by enlarged, torturous vein-like channels lined by unevenly distributed smooth muscle cells. A large number of mutations in the endothelial TIE2 receptor tyrosine kinase have been found from more than half of the lesions screened, thus providing a common genetic cause. TIE2 has a crucial role in vascular development, remodeling and quiescence. However, the molecular and cellular abnormalities caused by TIE2-mutations in endothelial cells and how they relate to VM formation have been unknown. The aim of this study was to examine how VM-specific mutations affect the molecular characteristics of TIE2-receptor downstream signaling and cellular functions. Because no effective treatment has been available for VMs, a better understanding of the molecular basis of their pathology should enable the development of more potent and non-invasive treatments as well as provide a better understanding of vascular morphogenesis in general. The results demonstrate that the TIE2-VM forms have both common and specific effects on TIE2 and the endothelial cells (ECs) expressing them. Mutation-induced TIE2 autoactivation leading to loss of normal EC monolayer organization due to extracellular matrix (ECM) fibronectin deficiency was found to be a common change. This was shown to occur through chronic activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, which also caused activation of the proteolytic plasminogen system. Also, most mutations altered TIE2 trafficking and angiopoietin ligand regulated TIE2 functions, albeit through different mechanisms. Using RNA-screening we showed that the most common sporadic TIE2-VM mutation dysregulates genes affecting vascular development, cell migration and ECM remodeling. PDGFB, a major attractant of vascular mural cells, was found to be strongly attenuated due to chronic activation of Akt, which also increases EC survival, by the TIE2 mutant receptors. To conclude, the results in this thesis reveal genetic, molecular and cellular alterations which may potentiate VM formation. This data provides new information on the pathological mechanisms behind abnormal vascular morphogenesis and should assist the development of new molecular treatment strategies for VM patients. / Tiivistelmä Laskimoepämuodostumat ovat paikallisia verisuoniston kehityksen häiriöitä. Riippuen niiden koosta ja anatomisesta sijainnista ne voivat aiheuttaa merkittävää haittaa. Epämuodostumat koostuvat laajentuneista, laskimonkaltaisista verisuonista, joissa sileiden lihassolujen kerros on puutteellisesti järjestäytynyt. Yli puolessa tutkituista laskimoepämuodostumista havaitaan mutaatioita verisuonten sisäpinnan endoteelisoluissa ilmenevässä TIE2 reseptorityrosiinikinaasissa, joka säätelee verisuonten kehitystä, muokkausta ja fysiologista toimintaa. TIE2-mutaatioiden aiheuttamia molekyyli- ja solutason muutoksia tai niiden yhteyttä epämuodostumien syntyyn ei ole aikaisemmin tunnettu. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, miten laskimoepämuodostumista löydetyt mutaatiot vaikuttavat TIE2-reseptorin toimintaan molekyyli- ja solutasolla sekä TIE2-reseptorista alkavaan solunsisäiseen viestintään. Koska pysyvää hoitomuotoa laskimoepämuodostumille ei tunneta, voisi tieto niiden taustalla olevista patologisista mekanismeista edesauttaa parempien, ei-kajoavien hoitomuotojen kehittämisessä ja antaa myös yleisesti uutta tietoa verisuoniston kehityksestä. Väitöskirjan tulokset osoittavat, että mutaatiot vaikuttavat TIE2-reseptoriin ja sitä ilmentäviin endoteelisoluihin mutaatioille yhteisillä sekä mutaatiokohtaisilla tavoilla. Mutaatioille tyypillinen TIE2-reseptorin ligandista riippumaton aktivaatio aiheutti aktivaation nousun myös TIE2:sta alavirtaan olevissa viestinvälittäjissä. Tämä puolestaan johti fibronektiini-proteiinin häviämiseen soluväliaineesta, sileitä lihassoluja säätelevän PDGFB-kasvutekijän ilmenemisen laskuun ja solujen ohjelmoidun solukuoleman vähenemiseen. Useimmat tutkitut mutaatiot muuttivat myös TIE2-reseptorin sijaintia soluissa häiriten TIE2:n angiopoietiini-ligandien säätelemiä toimintoja usean eri mekanismin kautta. Transkriptomin laajuiset RNA-tutkimukset osoittivat monien verisuonten kehitykseen, solujen liikkumiseen ja soluväliaineen muokkaukseen liittyvien geenien ilmentymisen muuttuneen. Lopputuloksena tutkimus paljasti geeni-, molekyyli-, ja solutason muutoksia, jotka saattavat vaikuttaa laskimoepämuodostumien syntyyn. Tulokset antavat lisätietoa sairautta aiheuttavista mekanismeista verisuoniston kehityksen häiriöiden taustalla ja ovat hyödyksi kehitettäessä uusia lääkkeitä laskimoepämuodostumien molekulaarisia hoitoja varten.