Submitted by Maria Suzana Diniz (msuzanad@hotmail.com) on 2015-06-19T12:38:56Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4771941 bytes, checksum: 6114eb1b0cca2bd044155269ba37e794 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-19T12:38:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4771941 bytes, checksum: 6114eb1b0cca2bd044155269ba37e794 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The leaf ethanolic extract of Cissampelos sympodialis showed promising activity in different animal models of asthma. Several alkaloids have been isolated and identified in the extract, including warifteine and methylwarifteine (bisbenzylisoquinoline), as well as milonine (morphinandienone). In this work we describe the development and validation of a method for simultaneous quantification of chemical markers in ethanolic extracts applied to the study of seasonality and isolation of two bisbenzylisoquinoline alkaloids. Already for milonine, warifteine and methylwarifteine were isolated, purified and quantified in crude ethanolic extracts of leaves using a methodology developed and validated. The warifteine and methylwarifteine were isolated from total alkaloid fraction of roots (TAF-r) of C. sympodialis, whereas that the milonine was isolated from the TAF-l. The structural identification was performed by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy of 1H and 13C, mass spectrometry and infrared spectrometry. The method made use of high performance liquid chromatography with ultraviolet detection (278 nm) using a reverse phase column C18 (250 x 4.6 mm, 5mm) and a mobile phase mixture of water-triethylamine (0,05%) (A) : methanol (B) in order gradient: 0-5 min. (60%), 5-15 min. (72%), 15-25 min.(80%), 25-30 min. (60%). at a rate of 1 mL / min. and running time of 30 min. The chromatographic method was validated in accordance with the recommended resolution of 899 of Agência Nacional de Vigilância Sanitária, and was linear in the concentration range used (2-100 mg / mL), selective (with good separation between the three chromatographic peaks and interfering) and robust. The calibration model used was of standard addition. In the study of seasonality of the markers was observed that there was significant decrease in the concentration of milonine, warifteine and methylwarifteine between February and April. These prominent decreases between the months of February and April for the three molecules coincide with the fruiting period of the plant being observed the appearance of warifteine and methylwarifteine alkaloids in the fruits. This observation suggests the need of the biosynthesis of these alkaloids for the fruits. Through chromatographic and spectrometric techniques was isolated and identified FAT roots of C. sympodialis a mixture of the epimers 7’- desmetilroraimine and 1' - epi - 7'- desmetilroraimine bisbenzylisoquinoline alkaloids that are inedited in the literature. / O extrato etanólico das folhas de Cissampelos sympodialis Eichl mostrou promissora atividade em diferentes modelos animais de asma. Vários alcaloides têm sido isolados e identificados no extrato, incluindo warifteína e metilwarifteína (bisbenzilisoquinolínicos), assim como milonina (morfinandienônico). Nesse trabalho descrevemos o desenvolvimento e validação de método para quantificação simultânea dos marcadores químicos em extratos etanólico aplicado ao estudo da sazonalidade e o isolamento de dois alcalóides bisbenzilisoquinolínicos. Os alcalóides milonina, warifteína e metilwarifteína foram isolados, purificados e quantificados em extratos etanólico bruto das folhas através de metodologia desenvolvida e validada. A warifteína e metilwarifteína foram isolados da fração de alcaloides totais das raízes (FAT-r) de C. sympodialis, enquanto a milonina foi isolada da FAT-f. A identificação estrutural dos alcaloides foi realizada por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C, espectrometria de massas e espectrometria de infravermelho. O método fez uso de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta (278 nm), utilizando uma coluna de fase reversa C18 (250 x 4,6 mm, 5μm) e como fase móvel uma mistura de água-trietilamina (0,05%) (A) : metanol (B) em modo gradiente: 0-5 min. (60%), 5-15 min. (72%), 15-25 min. (80%), 25-30 min. (60%) a um fluxo de 1 mL/min. e tempo de corrida de 30 min. O método cromatográfico desenvolvido foi validado segundo o preconizado na Resolução 899 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, e se mostrou linear na faixa de concentração utilizada (2-100 μg/mL), seletivo (com boa separação entre os três picos cromatográficos e interferentes), preciso (DPR%≤15%), exato (bias 85-115%) e robusto. O modelo de calibração utilizada foi o de adição de padrão. No estudo da sazonalidade dos marcadores foi possível observar que houve diminuição significativa da concentração de milonina, warifteína e metilwarifteína entre os meses de fevereiro e abril. Essas diminuições proeminentes para as três moléculas coincidem com o período de frutificação da planta sendo verificado o aparecimento de warifteína e metilwarifteína nos frutos. Essa observação sugere a necessidade da biossíntese dos alcaloides pelos frutos. Através de técnicas espectrométricas e cromatográfica foi isolado e identificado da FAT-r de C. sympodialis uma mistura de epímeros a 7’- desmetilroraimina e a 1’- epi - 7’- desmetilroraimina que são alcalóides bisbenzilisoquinolínicos inéditos na literatura. Palavras-chaves: CLAE, Menispermaceae, warifteína, metilwarifteína, milonina, Cissampelos sympodialis, variação sazonal.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4771941 bytes, checksum: 8d53bb72987d5fdb08cacfec3e12fffc (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The leaf ethanolic extract of Cissampelos sympodialis showed promising activity in different animal models of asthma. Several alkaloids have been isolated and identified in the extract, including warifteine and methylwarifteine (bisbenzylisoquinoline), as well as milonine (morphinandienone). In this work we describe the development and validation of a method for simultaneous quantification of chemical markers in ethanolic extracts applied to the study of seasonality and isolation of two bisbenzylisoquinoline alkaloids. Already for milonine, warifteine and methylwarifteine were isolated, purified and quantified in crude ethanolic extracts of leaves using a methodology developed and validated. The warifteine and methylwarifteine were isolated from total alkaloid fraction of roots (TAF-r) of C. sympodialis, whereas that the milonine was isolated from the TAF-l. The structural identification was performed by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy of 1H and 13C, mass spectrometry and infrared spectrometry. The method made use of high performance liquid chromatography with ultraviolet detection (278 nm) using a reverse phase column C18 (250 x 4.6 mm, 5mm) and a mobile phase mixture of water-triethylamine (0,05%) (A) : methanol (B) in order gradient: 0-5 min. (60%), 5-15 min. (72%), 15-25 min.(80%), 25-30 min. (60%). at a rate of 1 mL / min. and running time of 30 min. The chromatographic method was validated in accordance with the recommended resolution of 899 of Agência Nacional de Vigilância Sanitária, and was linear in the concentration range used (2-100 mg / mL), selective (with good separation between the three chromatographic peaks and interfering) and robust. The calibration model used was of standard addition. In the study of seasonality of the markers was observed that there was significant decrease in the concentration of milonine, warifteine and methylwarifteine between February and April. These prominent decreases between the months of February and April for the three molecules coincide with the fruiting period of the plant being observed the appearance of warifteine and methylwarifteine alkaloids in the fruits. This observation suggests the need of the biosynthesis of these alkaloids for the fruits. Through chromatographic and spectrometric techniques was isolated and identified FAT roots of C. sympodialis a mixture of the epimers 7 - desmetilroraimine and 1' - epi - 7'- desmetilroraimine bisbenzylisoquinoline alkaloids that are inedited in the literature. / O extrato etanólico das folhas de Cissampelos sympodialis Eichl mostrou promissora atividade em diferentes modelos animais de asma. Vários alcaloides têm sido isolados e identificados no extrato, incluindo warifteína e metilwarifteína (bisbenzilisoquinolínicos), assim como milonina (morfinandienônico). Nesse trabalho descrevemos o desenvolvimento e validação de método para quantificação simultânea dos marcadores químicos em extratos etanólico aplicado ao estudo da sazonalidade e o isolamento de dois alcalóides bisbenzilisoquinolínicos. Os alcalóides milonina, warifteína e metilwarifteína foram isolados, purificados e quantificados em extratos etanólico bruto das folhas através de metodologia desenvolvida e validada. A warifteína e metilwarifteína foram isolados da fração de alcaloides totais das raízes (FAT-r) de C. sympodialis, enquanto a milonina foi isolada da FAT-f. A identificação estrutural dos alcaloides foi realizada por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C, espectrometria de massas e espectrometria de infravermelho. O método fez uso de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultravioleta (278 nm), utilizando uma coluna de fase reversa C18 (250 x 4,6 mm, 5μm) e como fase móvel uma mistura de água-trietilamina (0,05%) (A) : metanol (B) em modo gradiente: 0-5 min. (60%), 5-15 min. (72%), 15-25 min. (80%), 25-30 min. (60%) a um fluxo de 1 mL/min. e tempo de corrida de 30 min. O método cromatográfico desenvolvido foi validado segundo o preconizado na Resolução 899 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, e se mostrou linear na faixa de concentração utilizada (2-100 μg/mL), seletivo (com boa separação entre os três picos cromatográficos e interferentes), preciso (DPR%≤15%), exato (bias 85-115%) e robusto. O modelo de calibração utilizada foi o de adição de padrão. No estudo da sazonalidade dos marcadores foi possível observar que houve diminuição significativa da concentração de milonina, warifteína e metilwarifteína entre os meses de fevereiro e abril. Essas diminuições proeminentes para as três moléculas coincidem com o período de frutificação da planta sendo verificado o aparecimento de warifteína e metilwarifteína nos frutos. Essa observação sugere a necessidade da biossíntese dos alcaloides pelos frutos. Através de técnicas espectrométricas e cromatográfica foi isolado e identificado da FAT-r de C. sympodialis uma mistura de epímeros a 7 - desmetilroraimina e a 1 - epi - 7 - desmetilroraimina que são alcalóides bisbenzilisoquinolínicos inéditos na literatura.