Introdução e objetivos: A produção de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs) tem sido restrita a espécies do gênero Klebsiella spp. e E. coli, sendo associada a altos índices de resistência, morbidade e mortalidade. Uma vez que os determinantes genéticos para ESBLs (genes blaESBL) são mediados por plasmídios, a sua disseminação para outras espécies de importância médica é considerada uma urgência epidemiológica. Os genes que codificam para ESBLs são mais comumente encontrados em membros da família Enterobacteriaceae, porém, plasmídeos, integrons, e sequências de inserção têm contribuído para o aumento da incidência de genes blaESBL entre outras bactérias Gramnegativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa. Infelizmente, uma das maiores dificuldades associada à identificação precoce da produção de ESBL em agentes de infecção hospitalar como Pseudomonas aeruginosa tem sido a padronização de métodos fenotípicos, os quais são afetados por resultados falso-negativos, decorrentes de mecanismos intrínsecos que mascaram a presença destas enzimas (i.e., produção de beta-lactamase AmpC de origem cromossômica). O presente estudo teve como objetivo caracterizar feno e genotipicamente a produção de ESBLs em isolados clínicos de P. aeruginosa recuperados de diferentes hospitais do Estado de São Paulo durante o período de 2004-2008. Materiais e métodos: 35 amostras de P. aeruginosa provenientes de 4 diferentes centros médicos de São Paulo, com perfil de resitência às cefalosporinas de terceira geração, foram submetidas à triagem fenotípica para a produção de ESBL na presença e ausência de inibidores específicos (ácido clavulânico e cloxacilina). A confirmação genotípica foi realizada por PCR e sequenciamento, usando iniciadores para pesquisa dos genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaPER e blaGES, e para o mapeamento de integron Classe 1. A diversidade genética das amostras foi realizada com auxílio do método de ERIC PCR e o índice de similaridade calculado empregando-se o coeficiente de Dice. Resultados e conclusão: Os métodos fenotípicos identificaram 3 cepas produtoras de ESBL, porém, a presença dos genes blaCTX-M e blaOXA-10 foi confirmada em 9 (33%) e 2 (7%) cepas de P. aeruginosa, respectivamente, recuperadas em 3 centros. O mapeamento e seqüenciamento do integron classe 1 encontrado revelou que duas cepas carregam 2 diferentes integrons classe 1 com genes blaCTX-M-2, aac6, e aadA6 de resistência para as cefalosporinas de terceira geração e para aminoglicosídeos. A transferência horizontal dos genes blaESBL não foi confirmada por transformação. Este estudo descreve que o aparecimento e disseminação de genes blaCTX-M em isolados clínicos de P. aeruginosa no Brasil teve sua origem a partir de 2005. Uma vez que ESBLs do tipo CTX-M têm sido amplamente descritas em Enterobactérias, a identificação destes genes em isolados de P. aeruginosa é alarmante e mostra que a mobilização horizontal do gene blaCTX-M entre diferentes gêneros e espécies é uma realidade no Brasil. Os genes que conferem resistência às metilases 16s RNAr não estavam relacionados a cepa de Pseudomonas aeruginosa produtores da enzima ESBL isoladas nas amostras de São Paulo. As cepas de Pseudomonas aeruginosa do presente estudo mostraram vários elementos de mobilização genéticos, como integrons e sequências de inserção, que podem estar participando na disseminação de resistência aos antibióticos beta- lactâmicos de amplo espectro. / Introduction and aim: The production of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) has been restricted to Klebsiella spp. and Escherichia coli, being associated with high rates of resistance, morbidity and mortality. Since genetic determinants for ESBLs (blaESBL genes) are mediated by plasmids, the spread to other medical important species is considered an epidemiological urgency. These genes encoding ESBLs are commonly found in members of the Enterobacteriaceae however, plasmids, integrons, and insertion sequences have contributed to the increase in the incidence of blaESBL genes among other gram-negative bacteria, including Pseudomonas aeruginosa. Unfortunately, one of the biggest difficulties associated with the early identification of the production of ESBL in nosocomial agents as Pseudomonas aeruginosa has been the standardization of phenotypic methods, which are affected by false-negative results stemming from intrinsic mechanisms which can mask the presence of these enzymes (i.e., production of chromosomal beta-lactamase AmpC). The aim of this study is to characterize phenotypical and genotypical ESBL production in clinical isolates of P. aeruginosa recovered in different hospitals in São Paulo during the period of 2004 to 2008. Materials and methods: 35 P .aeruginosa isolates intermediately resistant or resistant to third generation cephalosporin were phenotypically analyzed for the presence of ESBL with and without inhibitors (clavulanic acid and cloxacilin).Genotipic confirmation with specific primers for blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaPER and blaGES and the characterization of the genetic environment of blaCTX-M was performed by PCR and DNA sequencing.The random amplified polymorphism DNA technique with primer ERIC-2 was carried out for the isolates genotyping and the similarity index calculated with coefficient of Dice. Results and conclusion: the phenotypic methods identified 3 ESBL producing strains, however, the presence of genes blaCTX-M and blaOXA-10 has been confirmed in 9 (33%) and 2 (7%) strains of P. aeruginosa, respectively, from 3 medical centers. The mapping and sequencing of integron class 1 revealed that two strains harbored two different class 1 integrons with aadA6-like , aac6 gene and blaCTX-M-2-like genes conferring resistance to aminoglicosydes and third generation cephalosporins. The blaESBL horizontal transferation has not been confirmed by transformation. This study describes that the emergence and spread of genes blaCTX-M in clinical isolates of P. aeruginosa in Brazil had its origin from 2005. Since CTX-M type ESBLs have been widely described in Enterobacteriaceae, the identification of these genes in P. aeruginosa is alarming and shows that the blaCTX-M horizontal mobilization among different genus and species is a reality in Brazil. The genes that confer resistance to 16s RNAr methylases are not related to ESBL positive Pseudomonas aeruginosa strains in samples of São Paulo. The Pseudomonas aeruginosa strains of this study showed several genetic mobilization elements, such as integrons and insertion sequences, which may be participating in the spread of resistance to broad spectrum betalactams.

Introdução e objetivos: A produção de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs) tem sido restrita a espécies do gênero Klebsiella spp. e E. coli, sendo associada a altos índices de resistência, morbidade e mortalidade. Uma vez que os determinantes genéticos para ESBLs (genes blaESBL) são mediados por plasmídios, a sua disseminação para outras espécies de importância médica é considerada uma urgência epidemiológica. Os genes que codificam para ESBLs são mais comumente encontrados em membros da família Enterobacteriaceae, porém, plasmídeos, integrons, e sequências de inserção têm contribuído para o aumento da incidência de genes blaESBL entre outras bactérias Gramnegativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa. Infelizmente, uma das maiores dificuldades associada à identificação precoce da produção de ESBL em agentes de infecção hospitalar como Pseudomonas aeruginosa tem sido a padronização de métodos fenotípicos, os quais são afetados por resultados falso-negativos, decorrentes de mecanismos intrínsecos que mascaram a presença destas enzimas (i.e., produção de beta-lactamase AmpC de origem cromossômica). O presente estudo teve como objetivo caracterizar feno e genotipicamente a produção de ESBLs em isolados clínicos de P. aeruginosa recuperados de diferentes hospitais do Estado de São Paulo durante o período de 2004-2008. Materiais e métodos: 35 amostras de P. aeruginosa provenientes de 4 diferentes centros médicos de São Paulo, com perfil de resitência às cefalosporinas de terceira geração, foram submetidas à triagem fenotípica para a produção de ESBL na presença e ausência de inibidores específicos (ácido clavulânico e cloxacilina). A confirmação genotípica foi realizada por PCR e sequenciamento, usando iniciadores para pesquisa dos genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaPER e blaGES, e para o mapeamento de integron Classe 1. A diversidade genética das amostras foi realizada com auxílio do método de ERIC PCR e o índice de similaridade calculado empregando-se o coeficiente de Dice. Resultados e conclusão: Os métodos fenotípicos identificaram 3 cepas produtoras de ESBL, porém, a presença dos genes blaCTX-M e blaOXA-10 foi confirmada em 9 (33%) e 2 (7%) cepas de P. aeruginosa, respectivamente, recuperadas em 3 centros. O mapeamento e seqüenciamento do integron classe 1 encontrado revelou que duas cepas carregam 2 diferentes integrons classe 1 com genes blaCTX-M-2, aac6, e aadA6 de resistência para as cefalosporinas de terceira geração e para aminoglicosídeos. A transferência horizontal dos genes blaESBL não foi confirmada por transformação. Este estudo descreve que o aparecimento e disseminação de genes blaCTX-M em isolados clínicos de P. aeruginosa no Brasil teve sua origem a partir de 2005. Uma vez que ESBLs do tipo CTX-M têm sido amplamente descritas em Enterobactérias, a identificação destes genes em isolados de P. aeruginosa é alarmante e mostra que a mobilização horizontal do gene blaCTX-M entre diferentes gêneros e espécies é uma realidade no Brasil. Os genes que conferem resistência às metilases 16s RNAr não estavam relacionados a cepa de Pseudomonas aeruginosa produtores da enzima ESBL isoladas nas amostras de São Paulo. As cepas de Pseudomonas aeruginosa do presente estudo mostraram vários elementos de mobilização genéticos, como integrons e sequências de inserção, que podem estar participando na disseminação de resistência aos antibióticos beta- lactâmicos de amplo espectro. / Introduction and aim: The production of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) has been restricted to Klebsiella spp. and Escherichia coli, being associated with high rates of resistance, morbidity and mortality. Since genetic determinants for ESBLs (blaESBL genes) are mediated by plasmids, the spread to other medical important species is considered an epidemiological urgency. These genes encoding ESBLs are commonly found in members of the Enterobacteriaceae however, plasmids, integrons, and insertion sequences have contributed to the increase in the incidence of blaESBL genes among other gram-negative bacteria, including Pseudomonas aeruginosa. Unfortunately, one of the biggest difficulties associated with the early identification of the production of ESBL in nosocomial agents as Pseudomonas aeruginosa has been the standardization of phenotypic methods, which are affected by false-negative results stemming from intrinsic mechanisms which can mask the presence of these enzymes (i.e., production of chromosomal beta-lactamase AmpC). The aim of this study is to characterize phenotypical and genotypical ESBL production in clinical isolates of P. aeruginosa recovered in different hospitals in São Paulo during the period of 2004 to 2008. Materials and methods: 35 P .aeruginosa isolates intermediately resistant or resistant to third generation cephalosporin were phenotypically analyzed for the presence of ESBL with and without inhibitors (clavulanic acid and cloxacilin).Genotipic confirmation with specific primers for blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaPER and blaGES and the characterization of the genetic environment of blaCTX-M was performed by PCR and DNA sequencing.The random amplified polymorphism DNA technique with primer ERIC-2 was carried out for the isolates genotyping and the similarity index calculated with coefficient of Dice. Results and conclusion: the phenotypic methods identified 3 ESBL producing strains, however, the presence of genes blaCTX-M and blaOXA-10 has been confirmed in 9 (33%) and 2 (7%) strains of P. aeruginosa, respectively, from 3 medical centers. The mapping and sequencing of integron class 1 revealed that two strains harbored two different class 1 integrons with aadA6-like , aac6 gene and blaCTX-M-2-like genes conferring resistance to aminoglicosydes and third generation cephalosporins. The blaESBL horizontal transferation has not been confirmed by transformation. This study describes that the emergence and spread of genes blaCTX-M in clinical isolates of P. aeruginosa in Brazil had its origin from 2005. Since CTX-M type ESBLs have been widely described in Enterobacteriaceae, the identification of these genes in P. aeruginosa is alarming and shows that the blaCTX-M horizontal mobilization among different genus and species is a reality in Brazil. The genes that confer resistance to 16s RNAr methylases are not related to ESBL positive Pseudomonas aeruginosa strains in samples of São Paulo. The Pseudomonas aeruginosa strains of this study showed several genetic mobilization elements, such as integrons and insertion sequences, which may be participating in the spread of resistance to broad spectrum betalactams.