Osteossarcoma (OS) é uma neoplasia que acomete principalmente as metáfises de ossos longos, sendo o tumor ósseo pediátrico mais comum. O tratamento consiste em ressecção cirúrgica, tratamento quimioterápico multimodal neo-adjuvante e adjuvante. No entanto, apesar dos tratamentos, cerca de 80% dos pacientes que apresentam metástase tem uma sobrevida curta. Deste modo, torna-se necessário um melhor entendimento do processo metastático, assim como da busca por novos alvos terapêuticos. Uma das principais vias relacionada à invasão e migração das células neoplásicas é a das GTPases Rho, cujas principais moléculas efetoras são as quinases ROCK1 e 2, responsáveis por mediar a migração através do controle do citoesqueleto. Tais quinases têm sido relatadas hiperexpressas em diversas neoplasias e associadas ao pior prognóstico. Recentemente, pesquisas também têm apontado a desregulação de miRNAs na tumorigênese, sendo que a hipoexpressão de alguns microRNAs estão relacionados à hiperexpressão das ROCKs e, portanto, envolvidos no processo metastático. No presente trabalho, estudou-se a expressão tanto das ROCKs quanto de miRNAs associados a elas em amostras tumorais de OS por meio de PCR em tempo real. Encontramos uma hipoexpressão de ROCK1 nas amostras OS quando comparadas ao osso não neoplásico controle, enquanto que ROCK2 não apresentou diferença. O miR-138 foi encontrado hiperexpresso e obteve correlação com ROCK2, além de associação com a sobrevida. Os miR-139 e miR-708 demonstraram-se hipoexpressos nas amostras tumorais. Já os miR-196b e miR-584 não apresentaram diferenças. Após as análises de expressão, optou-se pelo estudo do miR-708 em linhagens de OS, desta forma, sua expressão foi induzida em três linhagens celulares, através de um vetor lentiviral, e foram realizados ensaios funcionais com o objetivo de estabelecer o papel deste miRNA. Não foi observada diferença nas taxas de proliferação ou capacidade clonogênica quando a expressão do miR-708 foi indizida. No ensaio de migração wound healing o miR-708 reduziu a migração da linhagem SAOS-2, enquanto que no ensaio de invasão induziu a invasão da linhagem MG-63 em matrigel, mas reduziu esse potencial nas linhagens HOS e SAOS-2 na matriz de gelatina. Uma análise in silico dos alvos deste miRNA apontou sua associação às vias WNT, MAPK e de Junções Aderentes. Desta forma, sugere-se que o miR-708 pode estar envolvido no controle processos que levam ao desenvolvimento de metástase, principalmente na interação com a matriz extracelular. / Osteosarcoma (OS) is a neoplasia that mainly occurs at the metaphyses of long bones, being the most common pediatric bone tumor. The treatment is based on surgical resection and the multimodal chemoterapy adjuvant and neoadjuvant. However, despite the treatment, around 80% of patients who evolve to metastais present a poor survival. Therefore, understanding the metastatic process is essencial, as well as the search for new therapy targets. The mainly pathway related to invasion and migration in neoplasic cells is regulated by the Rho GTPases, and their main effectors are the kinases ROCK1 and ROCK2, which are responsible for cytoskeleton control. The hyperexpression of these kinases has been described in different cancers and it has been associated to poor prognostic. In parallel, several studies have extensively demonstrated miRNA deregulation in tumorigenesis, and the hipoexpression of some miRNA are related to ROCK upregulation, consequently, involved with metastasis. Herein, we studied the expression profiles of ROCK1 and 2 and associated miRNAs in OS tumor samples by means of qRT-PCR. We found downregulation of ROCK1 in OS samples when compared to normal bone (control), while ROCK2 did not show differences. MiR-138 showed hiperexpression and was correlated with ROCK2, and an association with survival rates. MiR-139 and miR-708 were found downregulated in tumor samples, though miR- 196b and miR-584 did not show differences in expression. Afterwards, miR-708 expression was induced in three OS cell lines, aiming establish miR-708 role. Proliferation and clonogenic essays did not present any effects when miR-708 was induced. In the wound healing essay, miR-708 reduced the migration of SAOS-2 cells, and in invasion essay, miR-708 induced invasion of MG-63 cells in a matrigel matrix, while reduced the invasive potential of HOS and SAOS-2 cell lines in a gelatin matrix. An in silico analysis of miR-708 targets highlighted its association with WNT, MAPK and Adherent Junction pathways. Therefore, we suggest that miR-708 can be involved in process that leads to metastasis, mainly related to extracellular matrix interation.

Osteossarcoma (OS) é uma neoplasia que acomete principalmente as metáfises de ossos longos, sendo o tumor ósseo pediátrico mais comum. O tratamento consiste em ressecção cirúrgica, tratamento quimioterápico multimodal neo-adjuvante e adjuvante. No entanto, apesar dos tratamentos, cerca de 80% dos pacientes que apresentam metástase tem uma sobrevida curta. Deste modo, torna-se necessário um melhor entendimento do processo metastático, assim como da busca por novos alvos terapêuticos. Uma das principais vias relacionada à invasão e migração das células neoplásicas é a das GTPases Rho, cujas principais moléculas efetoras são as quinases ROCK1 e 2, responsáveis por mediar a migração através do controle do citoesqueleto. Tais quinases têm sido relatadas hiperexpressas em diversas neoplasias e associadas ao pior prognóstico. Recentemente, pesquisas também têm apontado a desregulação de miRNAs na tumorigênese, sendo que a hipoexpressão de alguns microRNAs estão relacionados à hiperexpressão das ROCKs e, portanto, envolvidos no processo metastático. No presente trabalho, estudou-se a expressão tanto das ROCKs quanto de miRNAs associados a elas em amostras tumorais de OS por meio de PCR em tempo real. Encontramos uma hipoexpressão de ROCK1 nas amostras OS quando comparadas ao osso não neoplásico controle, enquanto que ROCK2 não apresentou diferença. O miR-138 foi encontrado hiperexpresso e obteve correlação com ROCK2, além de associação com a sobrevida. Os miR-139 e miR-708 demonstraram-se hipoexpressos nas amostras tumorais. Já os miR-196b e miR-584 não apresentaram diferenças. Após as análises de expressão, optou-se pelo estudo do miR-708 em linhagens de OS, desta forma, sua expressão foi induzida em três linhagens celulares, através de um vetor lentiviral, e foram realizados ensaios funcionais com o objetivo de estabelecer o papel deste miRNA. Não foi observada diferença nas taxas de proliferação ou capacidade clonogênica quando a expressão do miR-708 foi indizida. No ensaio de migração wound healing o miR-708 reduziu a migração da linhagem SAOS-2, enquanto que no ensaio de invasão induziu a invasão da linhagem MG-63 em matrigel, mas reduziu esse potencial nas linhagens HOS e SAOS-2 na matriz de gelatina. Uma análise in silico dos alvos deste miRNA apontou sua associação às vias WNT, MAPK e de Junções Aderentes. Desta forma, sugere-se que o miR-708 pode estar envolvido no controle processos que levam ao desenvolvimento de metástase, principalmente na interação com a matriz extracelular. / Osteosarcoma (OS) is a neoplasia that mainly occurs at the metaphyses of long bones, being the most common pediatric bone tumor. The treatment is based on surgical resection and the multimodal chemoterapy adjuvant and neoadjuvant. However, despite the treatment, around 80% of patients who evolve to metastais present a poor survival. Therefore, understanding the metastatic process is essencial, as well as the search for new therapy targets. The mainly pathway related to invasion and migration in neoplasic cells is regulated by the Rho GTPases, and their main effectors are the kinases ROCK1 and ROCK2, which are responsible for cytoskeleton control. The hyperexpression of these kinases has been described in different cancers and it has been associated to poor prognostic. In parallel, several studies have extensively demonstrated miRNA deregulation in tumorigenesis, and the hipoexpression of some miRNA are related to ROCK upregulation, consequently, involved with metastasis. Herein, we studied the expression profiles of ROCK1 and 2 and associated miRNAs in OS tumor samples by means of qRT-PCR. We found downregulation of ROCK1 in OS samples when compared to normal bone (control), while ROCK2 did not show differences. MiR-138 showed hiperexpression and was correlated with ROCK2, and an association with survival rates. MiR-139 and miR-708 were found downregulated in tumor samples, though miR- 196b and miR-584 did not show differences in expression. Afterwards, miR-708 expression was induced in three OS cell lines, aiming establish miR-708 role. Proliferation and clonogenic essays did not present any effects when miR-708 was induced. In the wound healing essay, miR-708 reduced the migration of SAOS-2 cells, and in invasion essay, miR-708 induced invasion of MG-63 cells in a matrigel matrix, while reduced the invasive potential of HOS and SAOS-2 cell lines in a gelatin matrix. An in silico analysis of miR-708 targets highlighted its association with WNT, MAPK and Adherent Junction pathways. Therefore, we suggest that miR-708 can be involved in process that leads to metastasis, mainly related to extracellular matrix interation.

Les carcinomes spinocellulaires cutanés (cSCCs) sont le deuxième type de cancer par ordre de fréquence et sont responsables de 25% des décès dus aux cancers de la peau. Il est donc essentiel de caractériser les mécanismes responsables de la cancérisation de l'épiderme afin de développer de nouveaux traitements. Dans ce contexte, les miRNAs apparaissent comme des cibles de choix pour le développement de futures thérapies anti-tumorales. Toutefois, leur implication dans la physiopathologie des cSCCs est encore peu documentée. Au cours de cette étude, j’ai identifié, par séquençage à haut débit, 112 miRNAs dont l’expression est altérée au cours du développement tumoral dans un modèle murin de carcinogénèse chimique cutanée. J’ai ensuite focalisé mon attention sur le cluster miR-193b/365a et sur miR-708 dont les niveaux diminuent au cours de la progression tumorale, suggérant des fonctions de suppresseurs de tumeur. En accord avec cette hypothèse, l’expression ectopique de ces miRNAs inhibe la prolifération, la survie et la migration de cellules tumorales, alors que le blocage de leur action par des anti-sens stimule ces fonctions cellulaires dans des kératinocytes normaux. L’association d’approches in silico et d’analyses du transcriptome de cellules de cSCC sur-exprimant ces miRNAs m’a permis d’identifier leurs gènes cibles potentiels. J’ai validé KRAS et MAX comme cibles communes de miR-193b et miR-365a, et montré par l’utilisation de siRNAs que la répression de ces cibles mime les effets de ces miRNAs. Ces résultats suggérent que le ciblage de ces gènes pourrait médier en partie les effets suppresseurs de tumeur de miR-193b et de miR-365a dans les cSCCs. / Cutaneous squamous cell carcinomas (cSCCs) are the second most common cancer and are responsible for up to 25% of all skin cancer deaths. It is therefore essential to characterize the mechanisms responsible for epidermis carcinogenesis to develop new treatments. In this context, miRNAs appear to be prime targets for the development of future anti-tumor therapies. However, their involvement in the pathophysiology of cSCCs is still poorly documented. In this study, I identified using Small RNA sequencing, 112 miRNAs whose expression is altered during tumor development in a mouse model of cutaneous two-stage chemical carcinogenesis. Then, I focused my attention on the miR-193b/365a cluster and on miR-708, that are down-regulated during tumorigenesis, suggesting tumor suppressor functions. Consistent with this hypothesis, the ectopic expression of these miRNAs inhibit the proliferation, survival and migration of tumor cells, while blocking their action with antisense oligonucleotides stimulates these cellular functions in normal keratinocytes. Combining in silico target-prediction approaches and transcriptome analyzes of cSCC cells over-expressing these miRNAs, I identified their potential target genes. I validated KRAS and MAX as direct targets of miR-193b and miR-365a, and I showed that repression of these genes using siRNAs mimics the effects of these miRNAs. These results suggest that targeting these genes might mediate, at least in part, the tumor suppressor action of miR-193b and miR-365a in cSCCs.