Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:08:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345651.pdf: 12559513 bytes, checksum: 7af5b3a93965abfe830dccf4afe13b9b (MD5) Previous issue date: 2016 / Com o surgimento de novas tecnologias no campo interdisciplinar da Biotecnologia, cresce também a utilização das microalgas em diversos setores de interesse econômico e de tecnologia ambiental. O presente trabalho buscou procurou aliar conceitos distintos de formas de cultivo de microalgas em um único sistema (híbrido), para produção de biomassa e abordar o potencial de uma microalga extremófila quanto a sua tolerância a metais pesados. O trabalho foi desenvolvido paralelamente no Laboratório de Cultivo de Algas (LCA-UFSC) e no Laboratório de Ficologia (LAFIC-UFSC), entre fevereiro de 2013 e maio de 2015. O capítulo 1 tratou da construção de um sistema híbrido para o cultivo e a realização de testes de batelada com a microalga teste Scenedesmus obliquus para validação, com quantificação do crescimento, produtividade, perfil da biomassa (teor de óleo, perfil de ácidos graxos, proteínas, teor de luteína e betacaroteno) quanto à presença de CO2 no cultivo. O volume total de trabalho do sistema foi definido em 180 litros, que circulou por três segmentos: reservatório, sistema de tubos (2m de coluna d?água) e rampa. A rampa foi definida em 5m2 de área superficial com lâmina d?água média de 1,5cm de altura. A vazão de trabalho foi de 55,7 L min-1 e velocidade de fluxo de 0,0619 m s-1. O sistema teve o pedido de patente protocolado junto ao INPI (Apêndice 1). A produtividade líquida média de S. obliquus, com CO2, foi de 7,08 g m-2 dia-1 contra 0,77g m-2 dia-1 sem o porte do gás. Foi observado que o cultivo de S.obliquus neste sistema necessita de CO2 mesmo em baixa densidade. O teor de óleo médio nos experimentos com CO2 foi de cerca de 20%, contra 15,5% nos experimentos sem CO2. O resultado também indicou uma maior assimilação de carbono na condição com suprimento adicional de CO2. A diferença marcante no perfil entre os dois tratamentos foi quanto aos ácidos graxos insaturados com 18 carbonos. Na condição sem CO2 o ácido oleico (C18:1) foi predominante, ao passo que na condição com CO2, o ácido a-linolênico (C18:2) foi o mais abundante. O capítulo 2 abordou o crescimento de Chlamydomonas acidophila LAFIC-004 em meio com elevadas concentrações de zinco e cádmio (quantificação de biomassa, glutationas, fitoquelatinas, pigmentos, zinco e cádmio no sobrenadante e alterações da ultraestrutura). A cepa mostrou alto potencial às concentrações testadas. A presença de fitoquelatinas livres foi reduzida significativamente indicando imobilização dos metais na célula, corroborado pela análise ultraestrutural.<br> / Abstract : With the emergence of new technologies in the interdisciplinary field of biotechnology, the use of microalgae in various sectors of economic interest and environmental technology is also increasing. The present work sought to combine different concepts of microalgae cultivation in a single system (hybrid) for biomass production and to address the potential of an extremophilic microalgae as to its tolerance to heavy metals. In two charpters the work was divided, with the experimental part developed in parallel in the Algae Cultivation Laboratory (LCA-UFSC) and in the Laboratory of Ficology (LAFIC-UFSC) between February 2013 and May 2015. Chapter 1 dealt with the The construction of the hybrid system for the cultivation and performance of batch tests with the Scenedesmus obliquus test microalgae, for validation, with quantification of growth, productivity, biomass profile (oil content, fatty acids profile, proteins, lutein content and betacarotene) for the presence of CO2 in the culture. The total work volume of the system was set at 180 liters, which circulated through three main segments: reservoir, pipe system (2m of water column) and ramp. The ramp was defined in 5m2 of surface area with an average water depth of 1.5cm in height. The workflow was 55.7 L min-1 and flow velocity of 0.0619 m s-1. The system had the patent application filed with the INPI. The average net productivity of S. obliquus with CO2 was 7.08 g m-2 day-1 versus 0.77 g m-2 day-1 without the gas carrying. It was observed that the cultivation of S. obliquus in this system requires CO2 even at low density. The average oil content in the CO2 experiments was about 20%, against 15.5% in the experiments without CO2. The result also indicated greater carbon uptake in the condition with additional CO2 supply. The marked difference in the profile between the two treatments was for the unsaturated fatty acids with 18 carbons. In the condition without CO2 the oleic acid (C18:1) was predominant, whereas in the CO2 condition, a-linolenic acid (C18:2) was the most abundant. The chapter two were about Chlamydomonas acidophila LAFIC-004, were grown in medium with high concentrations of zinc and cadmium (quantification of biomass, glutathione, phytochelatins, pigments, zinc and cadmium in the supernatant and ultrastructure changes). The strain was tolerant to the concentrations tested. The presence of free phytochelatins was significantly reduced indicating immobilization of the metals in the cell, corroborated by the ultrastructural analysis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2017 / Made available in DSpace on 2017-09-05T04:04:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347267.pdf: 3144062 bytes, checksum: 334780a15fcef1f70f18c0ee82c7f94e (MD5) Previous issue date: 2017 / Abstract: Microalgae have emerged as a source of a wide range of compounds, which enable the development of a variety of products for pharmaceutical, nutraceutical and cosmetic industries. The extraction of these natural compounds is essential for the commercialization of these high value compounds (HVPs) from microalgae. The success of the extraction depends on the affinity of the compounds with the solvent used in the process that should be suitable for the extraction of value compounds. In this context, this thesis is addressed to the extraction of compounds from the biomass from three marine microalgae species (Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata and Porphyridium cruentum), using subcritical n-butane for the obtainment of the crude extracts. In order to compare and evaluate the affinity of n- butane with the extracted compounds, were also applied to each microalgae biomass, organic solvent extraction through Soxhlet method (AOAC 963.15) and supercritical extraction using CO2 (SC-CO2) as solvent. For the obtainment of the biomass needed for the extraction experiments, the microalgae cultivation and the steps of harvesting, washing and drying of biomass were performed. With the obtainment of the dry biomass, the chemical composition was determined (moisture, ashes, proteins, carbohydrates, lipids and fatty acids profile) for each species. The proposed extraction methods were applied to the three different microalgae biomass, and the fatty acids composition of the extracts obtained by each method were compared. The same extracts obtained by SC-CO2 and subcritical n-butane were evaluated regarding to their antioxidant activities using DPPH radical scavenging assay. The total carotenoids content was also quantified by UV-visible (UV-vis) and the results correlated. Furthermore, a case study was developed for the harvesting step at pilot scale, using the protozoan Tetrahymena as flocculant agent in microalgal cultures of Chlorella sorokiniana 8-C4 (australian local strain). From the results obtained from the chemical composition of each microalgae cultivated for the extraction experiments, these species were suggested for the enhancement of food products considering their respective nutritional benefits. Comparing the extraction methods used, subcritical n-butane extracted higher percentages of polyunsaturated fatty acids (?3 and ?6) than supercritical CO2, and in some cases reached higher affinity with these compounds than the organic solvent, showing it to be a suitable method for the extraction of high value fatty acids (i.e. eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, arachidonic acid). The extracts obtained by CO2 and n-butane as solvents presented antioxidant activity values against the radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), where the subcritical n-butane extract of P. cruentum presented the highest capacity to scavenge DPPH, showing value close to the synthetic antioxidant butylated hydroxytoluene (BHT). Moreover, the correlation between the antioxidant activity results and carotenoids content was considered significant (R2=0.8021) between the obtained extracts, independent of the method used. In the case study about the application of the protozoan Tetrahymena as bioflocculant in microalgal cultures of C. sorokiniana, was possible to obtain an OD750 concentration profile along the flocculator developed for the assays. From the verified OD750 profile a gradient of suspended solids (algal cells) was demonstrated along the cylinder, however the expected efficiency was not achieved, suggesting the performance of more experimentation towards the optimization of this biomass pre-concentration process, which is still in early stages of research.<br> / Resumo expandido: As microalgas têm emergido como fonte de vasta gama de compostos que possibilitam o desenvolvimento de grande variedade de produtos, desde biocombustíveis até produtos de alto valor agregado. A extração de compostos da biomassa é uma etapa essencial para a comercialização de produtos a partir das microalgas, e seu sucesso depende da afinidade dos compostos em questão com o solvente utilizado no processo. Neste contexto, a presente tese trata da extração de compostos da biomassa de três espécies de microalgas marinhas (Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata e Porphyridium cruentum) utilizando n-butano subcrítico como solvente na obtenção dos extratos brutos. Com o intuito de comparar e avaliar a afinidade do n-butano com os compostos extraídos, também foram aplicados à biomassa de cada espécie, extração com solvente orgânico através do método de Soxhlet (AOAC 963.15) e extração supercrítica utilizando CO2 (SC-CO2). Para a obtenção da biomassa necessária para os experimentos de extração, foram desenvolvidos os cultivos das microalgas e as etapas de separação, lavagem e secagem da biomassa. Com a obtenção da biomassa seca, foi determinada a composição química (umidade, cinzas, proteínas, carboidratos, lipídios e perfil de ácidos graxos) de cada espécie. Foram aplicados os três diferentes métodos de extração propostos, onde foi comparada a composição de ácidos graxos dos extratos obtidos por cada método de extração das três espécies produzidas. Os mesmos extratos obtidos via SC-CO2 e n-butano subcrítico foram avaliados quanto as suas atividades antioxidantes utilizando o radical 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) como método de determinação. Os resultados de atividade antioxidante foram correlacionados com os valores conteúdos de carotenóides totais, quantificados por UV-visível (UV-vis). Além disso, foi desenvolvido um estudo de caso em escala piloto para a etapa de separação da biomassa, onde foi utilizado o protozoário Tetrahymena como agente floculador em culturas da microalga Chlorella sorokiniana 8-C4 (espécie local australiana). A partir dos resultados sobre a composição química da biomassa de cada microalga produzida para os experimentos de extração, espécies foram sugeridas para o enriquecimento de alimentos considerando seus respectivos benefícios nutricionais. Comparando-se os métodos de extração utilizados, n- butano subcrítico extraiu as maiores porcentagens de ácidos graxos poli- insaturados (?3 e ?6) do que CO2 supercrítico e em alguns casos obteve maior afinidade com estes compostos do que o solvente orgânico, mostrando-se um método adequado para a extração de ácidos graxos de alto valor agregado (ácido eicosapentaenóico, ácido docosahexaenóico, ácido araquidônico, por exemplo). Os extratos obtidos através de SC- CO2 e n-butano apresentaram diferentes níveis de atividade antioxidante frente ao radical DPPH, onde o extrato obtido da microalga P. cruentum utilizando n-butano como solvente apresentou a maior capacidade de sequestro do radical DPPH, apresentando valor mais próximo ao antioxidante sintético hidroxitolueno butilato (BHT). Ainda, a correlação entre os resultados de atividade antioxidante e conteúdo de carotenóides foi considerada significante (R2 = 0.8021) entre os extratos obtidos, independentemente do método utilizado. No estudo de caso da aplicação do protozoário Tetrahymena como biofloculante em culturas da microalga C. sorokiniana, foi possível a obtenção de um perfil de concentração de OD750, ao longo do floculador desenvolvido para os testes. A partir do perfil de OD750 constatado foi demostrado um gradiente de sólidos suspensos (células algais) ao longo do cilindro, no entanto a eficiência esperada no processo não foi atingida, o que sugere a realização de mais experimentações na busca da otimização deste processo de pré-concentração da biomassa, que ainda se encontra em estágio inicial de pesquisa.

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O presente trabalho compreende a execução de 16 experimentos, realizados em duplicata, visando avaliar a influência de fatores, tais como iluminância, concentração de NaH2PO4.H2O, concentração de NaNO3, fotoperíodo e comprimento de onda, além da interação entre a iluminância e os demais fatores, na produção de biomassa e lipídios pela microalga marinha Chlorella minutíssima. Os experimentos estiveram dispostos em 2 arranjos ortogonais L8 de Taguchi, cada um dos quais recebeu dados obtidos em experimentos com diferentes comprimentos de onda (470 nm, além da luz branca), nos quais eram variados, em dois níveis, a iluminância (26 klx e 13 klx), as concentrações de NaH2PO4.H2O (5 mg/L e 15 mg/L) e NaNO3 (45 mg/L e 75 mg/L) e o fotoperíodo (12: 12 horas claro: escuro e 8 ciclos diários de 2: 1 horas claro: escuro). Os experimentos se processaram em reatores de vidro com formato de prisma de base quadrada com volume útil de 1,1 L, isolados da influência da luminosidade externa. Para a luz branca, o melhor resultado para a produção de biomassa foi de 1300 mg/L, ao passo que o melhor resultado para o teor lipídico foi de 22,75% em relação à biomassa seca. Para a luz de comprimento de onda equivalente a 470 nm, o melhor resultado para a produção de biomassa foi de 1270 mg/L, ao passo que o melhor resultado para o teor lipídico foi de 19,03% em relação à biomassa seca. / This work comprises the execution of 16 experiments, performed in duplicate, in order to evaluate the influence of factors such as illuminance, NaH2PO4.H2O concentration, NaNO3 concentration, photoperiod and wavelenght, in addition to the interaction between the illuminance and the others factors, in the production of biomass and lipids by the m arine microalgae Chlorella minutíssima. The experiments were arranged in 2 Taguchi\'s L8 orthogonal arrays, each of which received data obtained in experiments with different wavelengths (470 nm, in addition to the white light), in which the illuminance (26 klx and 13 klx), the NaH2PO4.H2O (5 mg/L and 15 mg/L) and NaNO3 (45 mg/L and 75 mg/L) concentrations and the photoperiod (12: 12 hours light: dark and 8 daily cycles of 2: 1 hours light: dark) were varied, in two levels. The experiments were performed in quadrangular prism glass reactors with a useful volume of 1.1 L, isolated from the influence of external luminosity. For white light, the best result for biomass production was 1300 mg/L, while the best resulto f lipid contente was 22,75% in relation on the dry biomass. For light with a wavelength of 470 nm, the best result for biomass production was 1270 mg/L, while the best result of lipid contente was 19,03% in relation to the dry biomass

O presente trabalho avaliou a influência de quatro fatores no processo de extração dos lipídios da biomassa de três microalgas marinhas: Chlorella minutíssima, Dunaliella salina e Nannochloropsis gaditana. Estes fatores foram: a umidade da biomassa, a proporção entre os solventes, o volume total de solventes e o tempo de ultrassom, estabelecidos em três diferentes níveis e verificados simultaneamente em diferentes combinações, em um arranjo ortogonal de Taguchi. O objetivo primeiro deste estudo simultâneo foi encontrar o ajuste fornecedor da maior porcentagem de lipídios. Três diferentes níveis de umidade foram investigados na biomassa: 64%, 72% e 80%. A extração de lipídios da biomassa microalgal com elevado teor de umidade permite grande economia de tempo e energia, que seriam consumidos no processo de secagem, caso o processo de extração exigisse somente biomassa seca. Quanto à proporção entre os solventes e ao volume total de solventes, buscou-se encontrar as quantidades ideais de cada um dos solventes empregados: clorofórmio, metanol e água, que contribuem para a lise celular e o sequestro mais eficiente dos lipídios. A quarta variável, o tempo de ultrassom, foi verificado por ser um catalisador do processo de lise celular. O estudo dessas variáveis visou não somente melhorar a eficácia da extração, mas economizar tempo de processo e energia. O processo compreendeu a hidratação controlada da biomassa, seguido da extração propriamente dita, onde um sistema ternário formou-se com a separação posterior em duas fases distintas, com os lipídios dissolvidos na fase orgânica. Além de determinar a melhor condição de extração, este trabalho verificou o potencial do material lipídico das três espécies à conversão em ésteres de etila, visando a produção de biodiesel e a composição em ácidos graxos, avaliando seu potencial à aplicação nutracêutica, como fonte de ácidos graxos essenciais. A melhor condição de extração resultou de uma biomassa com 64% de umidade, proporção de 5,7 de clorofórmio para 3,0 de metanol e 1,0 de água em um volume total de 33 mL de solventes por grama de biomassa; tempos de ultrassom de 50 ou 70 minutos mostraram-se adequados para obtenção dos maiores teores lipídicos. O material lipídico extraído das três espécies revelou-se promissor como matéria-prima para a produção de biodiesel, com conversões de até 94,5%, via catálise ácida, após um tempo de reação de 5 horas a 80ºC e também rico em ácidos graxos essenciais, principalmente os ácidos linoleico e ?-linolênico. A composição em ácidos graxos das três espécies foi comparada com outras espécies do mesmo gênero, e diferentes meios de cultivo, mostrando a influência do cultivo sem injeção de dióxido de carbono, que favorece a síntese de ácidos graxos poli-insaturados. O método de Taguchi foi o diferencial por permitir a avaliação conjunta de todas as variáveis, contribuindo para encontrar os melhores ajustes em menor tempo, ressaltando o ineditismo deste trabalho de pesquisa. / This work aimed to study four factors that influence in the process of lipids extraction in the biomass from three marine microalgae species: Chlorella minutíssima, Dunaliella salina and Nannochloropsis gaditana. These factors were: biomass\' moisture, solvents\' ratio, solvents\' total volume and ultrasonic time, which were set at three different levels and observed simultaneously in a Taguchi orthogonal arrangement. The first objective of this study was to find the simultaneous adjustment provider of higher percentage of lipids. Three different humidity levels were investigated in biomass: 64%, 72% and 80%. The extraction of lipids of microalgal biomass with high moisture content allows great savings of time and energy that would be consumed in the drying process before the extraction if only dry biomass was demanded. Regarding the proportion between solvents and the total volume of solvents, we looked for to find the optimal amounts of each of the employed solvent: chloroform, methanol and water, which contribute to cell lysis and more efficient lipids sequestration. The fourth variable as a catalyst cellular lysis process, ultrasound time was checked. The method comprised controlled hydration of the biomass followed by extraction, where a ternary system formed with subsequent separation into two phases, with lipids dissolved in the organic phase. Besides determining the best extraction condition, this work had as objective verifying the potential of the lipid material to conversion into ethyl esters, aiming at the production of biodiesel and the composition of fatty acids, evaluating its potential for nutraceutical application as a source of essential fatty acids. The best extraction condition employed 64% humidity biomass, ratio of 5,7/3/1 chloroform/methanol/water, 33 mL solvents/gram, ultrasound times of 50 or 70 minutes were adequate to obtain the highest lipid contents. The lipid material extracted from the three species proved promising as raw material for biodiesel production, with conversions up to 94.5%, via acid catalysis, after a reaction time of 5 hours at 80ºC and also rich in essential fatty acids, especially linoleic and ?-linolenic acids. The fatty acid composition of the three species was compared to other species of the same genus and different culture media, showing the influence of the culture without injection of carbon dioxide, which favors the synthesis of polyunsaturated fatty acids. Taguchi method was the differential for allowing the joint evaluation of all the variables, contributing to find the best adjustments in a shorter time, highlighting the novelty of this research work.

O presente trabalho avaliou a influência de quatro fatores no processo de extração dos lipídios da biomassa de três microalgas marinhas: Chlorella minutíssima, Dunaliella salina e Nannochloropsis gaditana. Estes fatores foram: a umidade da biomassa, a proporção entre os solventes, o volume total de solventes e o tempo de ultrassom, estabelecidos em três diferentes níveis e verificados simultaneamente em diferentes combinações, em um arranjo ortogonal de Taguchi. O objetivo primeiro deste estudo simultâneo foi encontrar o ajuste fornecedor da maior porcentagem de lipídios. Três diferentes níveis de umidade foram investigados na biomassa: 64%, 72% e 80%. A extração de lipídios da biomassa microalgal com elevado teor de umidade permite grande economia de tempo e energia, que seriam consumidos no processo de secagem, caso o processo de extração exigisse somente biomassa seca. Quanto à proporção entre os solventes e ao volume total de solventes, buscou-se encontrar as quantidades ideais de cada um dos solventes empregados: clorofórmio, metanol e água, que contribuem para a lise celular e o sequestro mais eficiente dos lipídios. A quarta variável, o tempo de ultrassom, foi verificado por ser um catalisador do processo de lise celular. O estudo dessas variáveis visou não somente melhorar a eficácia da extração, mas economizar tempo de processo e energia. O processo compreendeu a hidratação controlada da biomassa, seguido da extração propriamente dita, onde um sistema ternário formou-se com a separação posterior em duas fases distintas, com os lipídios dissolvidos na fase orgânica. Além de determinar a melhor condição de extração, este trabalho verificou o potencial do material lipídico das três espécies à conversão em ésteres de etila, visando a produção de biodiesel e a composição em ácidos graxos, avaliando seu potencial à aplicação nutracêutica, como fonte de ácidos graxos essenciais. A melhor condição de extração resultou de uma biomassa com 64% de umidade, proporção de 5,7 de clorofórmio para 3,0 de metanol e 1,0 de água em um volume total de 33 mL de solventes por grama de biomassa; tempos de ultrassom de 50 ou 70 minutos mostraram-se adequados para obtenção dos maiores teores lipídicos. O material lipídico extraído das três espécies revelou-se promissor como matéria-prima para a produção de biodiesel, com conversões de até 94,5%, via catálise ácida, após um tempo de reação de 5 horas a 80ºC e também rico em ácidos graxos essenciais, principalmente os ácidos linoleico e ?-linolênico. A composição em ácidos graxos das três espécies foi comparada com outras espécies do mesmo gênero, e diferentes meios de cultivo, mostrando a influência do cultivo sem injeção de dióxido de carbono, que favorece a síntese de ácidos graxos poli-insaturados. O método de Taguchi foi o diferencial por permitir a avaliação conjunta de todas as variáveis, contribuindo para encontrar os melhores ajustes em menor tempo, ressaltando o ineditismo deste trabalho de pesquisa. / This work aimed to study four factors that influence in the process of lipids extraction in the biomass from three marine microalgae species: Chlorella minutíssima, Dunaliella salina and Nannochloropsis gaditana. These factors were: biomass\' moisture, solvents\' ratio, solvents\' total volume and ultrasonic time, which were set at three different levels and observed simultaneously in a Taguchi orthogonal arrangement. The first objective of this study was to find the simultaneous adjustment provider of higher percentage of lipids. Three different humidity levels were investigated in biomass: 64%, 72% and 80%. The extraction of lipids of microalgal biomass with high moisture content allows great savings of time and energy that would be consumed in the drying process before the extraction if only dry biomass was demanded. Regarding the proportion between solvents and the total volume of solvents, we looked for to find the optimal amounts of each of the employed solvent: chloroform, methanol and water, which contribute to cell lysis and more efficient lipids sequestration. The fourth variable as a catalyst cellular lysis process, ultrasound time was checked. The method comprised controlled hydration of the biomass followed by extraction, where a ternary system formed with subsequent separation into two phases, with lipids dissolved in the organic phase. Besides determining the best extraction condition, this work had as objective verifying the potential of the lipid material to conversion into ethyl esters, aiming at the production of biodiesel and the composition of fatty acids, evaluating its potential for nutraceutical application as a source of essential fatty acids. The best extraction condition employed 64% humidity biomass, ratio of 5,7/3/1 chloroform/methanol/water, 33 mL solvents/gram, ultrasound times of 50 or 70 minutes were adequate to obtain the highest lipid contents. The lipid material extracted from the three species proved promising as raw material for biodiesel production, with conversions up to 94.5%, via acid catalysis, after a reaction time of 5 hours at 80ºC and also rich in essential fatty acids, especially linoleic and ?-linolenic acids. The fatty acid composition of the three species was compared to other species of the same genus and different culture media, showing the influence of the culture without injection of carbon dioxide, which favors the synthesis of polyunsaturated fatty acids. Taguchi method was the differential for allowing the joint evaluation of all the variables, contributing to find the best adjustments in a shorter time, highlighting the novelty of this research work.