Orientadores: Jorg Kobarg, Jose Andres Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T22:20:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trindade_DanielMaragno_D.pdf: 7352494 bytes, checksum: 5b03d143205e747b05e3d4b6a8ed8e34 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Staniocalcinas (STCs) representam uma pequena família de hormônios glicoprotéicos, encontrados em todos os vertebrados e composta por STC1 e STC2, que foram inicialmente implicados na homeostase de cálcio e recentemente também foram implicados em vários outros processos. Stanniocalcina-1 (STC1), o primeiro membro encontrado, foi originalmente descoberto em peixes ósseos e posteriormente identificado em humanos onde parece ter um papel, embora ainda obscuro, na carcinogênese e angiogênese. Nos seres humanos STC1 pode ser encontrado em duas formas: um dímero ou um grupo de variantes de alto peso molecular coletivamente chamados bigSTC. Uma vez que ambas as células leucêmicas e os tumores sólidos dependem vascularização, a angiogênese é um passo fundamental na interação tumorhospedeiro e essencial para a progressão do câncer. Análises prévias de microarray resultaram na identificação de vários genes ativados em células endoteliais da medula óssea (BMEC) modulados pela presença de células leucêmicas. Apresentamos aqui STC1 como um marcador microambiente de medula óssea (BMM) durante leucemia linfoblástica aguda (LLA) pela validação dos dados prévios de microarray através de PCR em tempo real quantitativos. Em vista da falta de informações funcionais e estruturais sobre STC1 realizamos: (1) um screen no sistema de duplo híbrido em levedura, a fim de encontrar algumas das proteínas que interagem com a STC1 humana, e (2) uma caracterização estrutural inicial à baixa resolução desta proteína. Fomos capazes de construir um mapa interação proteína-proteína, obtido a partir dos 22 interactantes encontrados em screen de duplo híbrido em levedura. As proteínas encontradas apresentam-se em vários compartimentos celulares nos quais STC1 já foi demonstrada para estar presente, e essas novas informações podem ajudar a esclarecer como e qual o papel STC1 desempenha nesses locais. A fim de fornecer informação estrutural sobre STC1, realizamos análises bioquímicas e estruturais da proteína recombinante STC1 com 6xHis tag produzida em células de inseto utilizando o sistema baculovírus. A análise de dicroísmo circular confirmou a predição in silico do elevado conteúdo de alfa-helices. A análise por espectrometria de massas forneceu os dados experimentais que confirmaram o padrão conservado de pontes dissulfeto anteriormente descrito para STC1 de peixes. Finalmente, os dados de espalhamento de raios-X a baixo ângulo demonstraram que, STC1 adota uma estrutura dimérica, ligeiramente alongada em solução fornecendo deste modo os primeiros dados estruturais à baixa resolução desta família de proteínas. Além disso, foi possível obter proteína suficiente e de elevado grau de pureza para realizar ensaios cristalização que resultaram em cristais os quais difrataram a boa resolução. / Abstract: Staniocalcins (STCs) represent a small family of glycoprotein hormones found in all vertebrates composed by STC1 and STC2, which have been initially implicated in calcium homeostasis and also recently implicated in several other processes. Stanniocalcin-1 (STC1), the first member found, was originally discovered in bony fishes and later identified in humans were it seems to have a role, although still unclear, in carcinogenesis and angiogenesis. In humans STC1 can be found in two forms: a dimer or a group of higher molecular weigh variants collectively called bigSTC. Since both leukemic cells and solid tumors depend on vascularization, angiogenesis is a fundamental step in tumor-host interaction and essential to the cancer progression. Previous microarray analysis resulted in the identification of several activated genes in bone marrow (BM) endothelial cells (BMEC) modulated by presence of leukemic cells. Here we present STC1 as a BM microenvironment marker during acute lymphoblastic leukemia (ALL) by validating previous microarray data by quantitative RealTime-PCR. In view of the lack of functional and structural information on STC1 we performed (1) a yeast two hybrid screen in order to find some of the human STC1 interacting proteins and (2) a initial structural lowresolution characterization of this protein. We were able to construct a protein-protein interaction map, derived from the 22 interactants found in our yeast two-hybrid screen. The proteins found are located in several cellular compartments in which STC1 has already been shown to be present, and the new information might help to clarify how and which role it performs at these sites. As a means to provide structural information about STC1, we performed biochemical and structural analyses of recombinant STC1 6xHis tagged protein produced in insect cells by using the baculovirus system. Circular dichroism analysis confirmed the in silico predicted high alpha-helical content. By mass spectroscopy analysis we provided experimental data that confirmed the conserved disulfide pattern previously described for fish STC1. Finally Small Angle X-ray Scattering data demonstrated that STC1 adopts a dimeric, slightly elongated structure in solution, providing there by the first low resolution structural data of this family of proteins. Additionally, we could obtain enough protein of high purity to perform crystallization trials that resulted in crystals diffracting at good resolution. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Introdução: Os cânceres de mama subtipos Luminal A e B (HER2 negativo) podem apresentar prognóstico variável, a depender do índice de proliferação, avaliado pelo Ki67. As células malignas e as células estromais adjacentes (fibroblastos e células de resposta imune ) podem interagir tanto pelo contato célula a célula como por fatores secretados por elas, ambas influenciando no comportamento tumoral. Já foi demonstrado que as células estromais podem aumentar a proliferação das células do câncer da mama. Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão gênica de células do estroma em câncer de mama luminal A e luminal B e analisar se este se correlaciona com o prognóstico da doença. Pacientes e Métodos/ Resultados: Amostras de tumores de 11 pacientes na pós menopausa foram analisadas, todas elas HER2 negativas. A expressão de Ki67 foi <= 10 % em 5 pacientes (luminal A) e >= 30 % em outras 6 amostras(Luminal B ). Células estromais foram microdissecadas para a extração de RNA, que posteriormente foi hibridizado na plataforma de microarray Agilent G485 -1A GE 8x60K. Após a normalização, 50 % dos genes com a maior variância foram selecionados para análise por SAM duas classes desemparelhado (software TMEV ) e aceitando FDR 14.1%, 35 sequências foram identificadas como diferencialmente expressas, incluindo 16 genes conhecidos, entre as células estromais das amostras de Luminal A versos Luminal B, todos mais expressos nas amostras B. Dentre as funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos encontram-se regulação positiva do sistema imune, incluindo genes como ZAP70 (proteína quinase 70kDa associada a cadeia zeta (TCR)), CD38 (molécula CD38); UBASH3A (ubiquitina associada e SH3 domínio que contém A); PLA2G7 (fosfolipase A2, grupo VII (fator acetil ativador de plaquetas no plasma)); NCR3 (citotoxicidade natural, provocando receptor 3). Nosso próximo passo foi avaliar se a expressão de alguns genes selecionados estava associada com prognóstico de tumores luminais. Para tal selecionamos amostras de outro grupo de 89 pacientes com seguimento de pelo menos 5 anos, cujos tumores eram ER(+), HER2(-), para análise de expressão proteica em Tissue microarray. Caracterizamos os fibroblastos destas amostras com 3 marcadores de fibroblastos: actina de músculo liso (AML), S100A4 e caveolina-1 (CAV1) e analisamos a marcação da proteína ZAP70. Correlacionamos a expressão proteica de todos os marcadores com as características anatomopatológicas da amostra. Observamos que fibroblastos de todas as amostras de tumor de mama expressam AML, S100A4 e CAV1, em diferentes proporções, entretanto não detectamos diferença entre os tumores luminais A e B. Também não obsevamos diferença de expressão de AML, S100A4 e CAV1 em relação a grau histológico, comprometimento linfonodal e estadiamento clínico. Nestas amostras não detectamos expressão proteica de ZAP70 em fibroblastos tumorais. Conclusão: Houve expressão diferencial de 16 genes relacionados a processos imunes, todos eles mais expressos em células estromais de tumores Luminal B em relação a luminal A / Introduction: Luminal breast cancer subtypes A and B (HER2 negative) may present a variable prognosis, depending on tumor proliferation index, evaluated by Ki67 expression. Malignant cells and adjacent stromal cells (fibroblasts and immune response cells) may interact by both cell contact and secreted factors and influence tumor behavior. It was shown that stromal cells may enhance breast cancer cells proliferation. Objective: Our aim was to evaluate stromal cells gene expression profile in luminal A and luminal B tumors and to evaluate whether selected transcripts expressed in stromal cells may be associated with prognosis in breast cancer. Material/ Methods and Results: Hormone receptor positive tumor samples from 11 post menopausal patients were analyzed, all of them Her2 negative. Ki67 expression <= 10% (luminal A) was observed in five and Ki67 >= 30% (luminal B) in six samples. Stromal cells were microdissected for RNA extraction, which was hybridized in Agilent G485-1A GE 8x60K microarray platform. After normalization, 50% of the genes with the highest variance were selected for further analysis by two class unpaired SAM (TMEV software) and accepting FDR 14,1%, 35 sequences, including 16 known genes, were found differentially expressed between stromal cells from luminal A vs luminal B breast cancer samples, all of them more expressed in luminal B. Among biological functions enriched in genes found differentially expressed were positive regulation of immune system process, including genes as: ZAP70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa); CD38 (CD38 molecule); UBASH3A (ubiquitin associated and SH3 domain containing A); PLA2G7 (phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma); NCR3 (natural cytotoxicity triggering receptor 3). Our next step was evaluate whether expression of selected genes was associated with prognosis in another group of patients. Tumor samples from 89 patients with at least 5 years of follow up, all of them estrogen receptor positive and HER2 negative, were selected. Tissue microarray was prepared with stromal tumor compartment from paraffin embedded tumor samples. Fibroblasts were characterized for the expression of 3 fibroblasts markers (alfa-SMA, alpha smooth muscel actin; S100A4 and CAV1, caveolin 1), and ZAP70. Correlation of expression of these markers with prognostic variables was determined. Expression of alfa-SMA, S100A4 and CAV1 was detected in fibroblasts from all tumor samples in different proportions, however no differential expression was observed between luminal A and B tumors. Neither difference was detected on the expression of these proteins in relation with histological grade, lymph node involvement and clinical stage. Conclusion: A differential expression of 16 genes involved in immune process was found, all of them more expressed in fibroblasts from luminal B as compared with luminal A tumors

Introdução: Em câncer de mama, existem evidências de que o microambiente pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário, bem como em metástases regionais e a distância. Neste contexto, fibroblastos são importantes células estromais que podem influenciar a proliferação e a migração de células do câncer e podem prover um nicho apropriado para o desenvolvimento tumoral. Objetivos:O principal objetivo deste trabalho é comparar células estromais obtidas do tumor primário (PT), metástase linfonodal (N+) e medula óssea (BM) de pacientes com câncer de mama, através do perfil de expressão gênica. Pacientes e Métodos: Foi analisada a expressão gênica de fibroblastos (cultura primária) de 11 pacientes com câncer de mama. O perfil de expressão foi determinado em PT (n=4), N+(n=3) e BM (n=4) através de uma plataforma de cDNA microarray customizada (contendo 4.800 sequencias imobilizadas, representando cerca de 4600 genes), e os genes diferencialmente expressos foram identificados pelo teste SAM multiclasse, seguido pelo teste SAM de duas classes (TMEV, FDR 0%). A análise funcional foi realizada pelo software DAVID v6.7. Validação técnica foi realizada em 6 amostras previamente analisadas no microarray e a validação biológica em fibroblastos obtidos de outros 16 pacientes utilizando-se de RT-qPCR. Resultados: O perfil de expressão gênica dos fibroblastos obtidos de diferentes sítios mostraram 267 genes diferencialmente expressos, os quais apropriadamente agruparam os fibroblastos de acordo com suas origens (PT vs. N+ vs. BM). Apesar das diferenças entre PT e N+ serem representadas por 20 genes, as diferenças entre PT vs. BM e N+ vs BM foram mais significantes (235 e 245 genes diferencialmente expressos respectivamente). Análise funcional dos genes diferencialmente expressos mostrou enriquecimento de funções relacionadas ao desenvolvimento e morfogênese.A seguir, a expressão de alguns genes selecionados foi analisada em uma série diferente de amostras (validação biológica). Desse modo observamos que NOTCH2 confirmou uma alta expressão em N+ (vs. PT), e ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 e USP16 confirmaram alta expressão em BM (vs PT). Conclusão:Em pacientes com câncer de mama, células estromais obtidas de diferentes origens apresentam um perfil de expressão gênica diferencial, o qual pode influenciar o comportamento do tumor / may influence tumor development in the primary site of breast cancer, as well as in regional and distant metastatic sites. In this context, fibroblasts are important stromal cells which influence proliferation and migration of cancer cells and may also provide an appropriate niche to tumor development. Objectives: The main objective of this work is the comparison of stromal cells from the primary tumor (PT), lymph node metastasis (N+) and bone marrow (BM) obtained from breast cancer patients, through gene expression profile. Patients and Methods: The gene expression profile was analyzed in fibroblasts primary culture from 11 breast cancer patients. The expression profiles of PT cells (n=4), N+ cells (n=3) and BM cells (n=4) were determined through a customized cDNA microarray platform (containing 4800 immobilized sequences which represents 4600 genes approximately). The analysis were performed by SAM multiclass (TMEV; FDR 0%), followed by SAM two classes test (TMEV; FDR 0%). Functional analysis was performed using DAVID v6.7. Technical validation was performed in same 6 samples that were previously analyzed in microarray experiments and biological validation was performed in fibroblasts obtained from other group of 16patients by RT-qPCR Results: The expression profile of fibroblasts obtained from three sites revealed 267 differentially expressed genes, which appropriately clustered fibroblasts in three different branches, in accordance with their origin (PT vs. N+ vs. BM). Although the differences between PT and N+ were represented by 20 genes, differences between PT vs. BM and N+ vs. BM were more significant (235 and 245 differentially expressed genes respectively). Functional analysis revealed enrichment of functions related to development and morphogenesis. Afterwards, the expression of some selected genes were analyzed in a different batch of samples (biological validation).Thereby, NOTCH2 confirmed high expression in N+ (vs. PT), and ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 and USP16 confirmed high expression in BM (vs. PT). Conclusion: In breast cancer patients, stromal cells obtained from different origins present a differential gene expression profile, which may influence tumor behavior

[ES] La mayoría de las terapias contra el cáncer de mama que se utilizan actualmente en la práctica clínica se centran en atacar las células tumorales. Sin embargo, los nuevos avances en el campo de la inmunología han resaltado el papel principal del microambiente tumoral en la modulación tumoral. Específicamente, los fibroblastos asociados al cáncer desempeñan un papel importante en la progresión tumoral, la modulación de la inmunidad tumoral y la resistencia a la terapia. Por ello, esta tesis doctoral titulada "Nanopartículas de sílice mesoporosas dirigidas al microambiente tumoral como herramienta para el tratamiento del cáncer de mama" se centra en el diseño de un nanodispositivo dirigido a los fibroblastos asociados al cáncer y en la evaluación de su potencial como nueva estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer de mama. Se diseñó y sintetizó una nanopartícula utilizando nanopartículas mesoporosas de sílice como soporte, cargadas con doxorrubicina y funcionalizadas con un péptido ligando de FAP-¿ (NP-FAP-DOX). La caracterización de NP-FAP-DOX mostró una liberación controlada de la carga y un perfil no tóxico in vitro. Los estudios in vitro evaluaron la eficacia de las nanopartículas para dirigirse a FAP-¿, la citotoxicidad celular y la penetrabilidad tumoral en las líneas celulares de cáncer de mama, en los fibroblastos asociados al cáncer derivados de biopsias de pacientes con cáncer de mama triple negativo y en los organoides derivados de pacientes con cáncer de mama. Estos estudios demostraron que NP-FAP-DOX se dirigió eficazmente y produjo un efecto citotóxico en células de cáncer de mama con expresión positiva de FAP-¿, así como en fibroblastos asociados al cáncer. Además, la NP-FAP-DOX presentó una buena eficiencia de penetración en los organoides derivados de paciente, manteniendo así la acción dirigida y el efecto citotóxico en este modelo tridimensional. Finalmente, se evaluó la eficacia de NP-FAP-DOX in vivo en un modelo murino de cáncer de mama triple negativo. La NP-FAP-DOX mostró una buena capacidad para atacar tumores y una administración eficaz de fármacos, lo que dio como resultado un efecto antitumoral in vivo. Además, el tratamiento in vivo con NP-FAP-DOX se dirigió eficazmente a los fibroblastos asociados al cáncer y los eliminó, lo que llevó a la remodulación del microambiente tumoral y a la activación de la respuesta inmunitaria del tumor. Específicamente, este tratamiento promovió la infiltración de linfocitos, aumentó el porcentaje de células asesinas naturales y disminuyó los macrófagos M2, lo que llevó a un aumento de la proporción M1/M2 en los tumores. Además, las nanopartículas mejoraron el perfil terapéutico y de seguridad del fármaco libre, previniendo la toxicidad cardíaca y sistémica inducida por doxorrubicina. Con todo, estos resultados demostraron el potencial de los nanodispositivos diseñados como un nuevo sistema de administración de fármacos dirigido para el tratamiento del cáncer de mama. Estas nanopartículas pueden mejorar la eficacia de la administración de fármacos, superar los efectos secundarios adversos y mejorar la eficacia de la terapia mediante la modulación del microambiente tumoral. / [CA] La majoria de les teràpies contra el càncer de mama que s'utilitzen actualment en la pràctica clínica, es centren en atacar les cèl·lules tumorals. Tanmateix, els nous avanços en el camp de la immunologia han ressaltat el paper principal del microambient tumoral en la modulació tumoral. Específicament, els fibroblasts associats al càncer tenen un paper important en la progressió tumoral, la modulació de la immunitat tumoral i la resistència a teràpia. Per això, aquesta tesi doctoral titulada "Nanopartícules de sílice mesoporoses dirigides al microambient tumoral com a ferramenta per al tractament del càncer de mama" es centra en el disseny d'un nanodispositiu dirigit als fibroblasts associats al càncer i en l'avaluació del seu potencial com a nova estratègia terapèutica per al tractament del càncer de mama. Es va dissenyar i sintetitzar una nanopartícula utilitzant nanopartícules mesoporoses de sílice com a suport, carregades amb doxorubicina i funcionalitzades amb un pèptid lligand de FAP-¿ (NP-FAP-DOX). La caracterització de NP-FAP-DOX va mostrar un alliberament controlat de la càrrega i un perfil no tòxic in vitro. Els estudis in vitro van avaluar la eficàcia de les nanopartícules en l'acció dirigida a FAP-¿, la citotoxicitat cel·lular i la penetrabilitat tumoral en les línies cel·lulars de càncer de mama, en els fibroblasts associats al càncer derivats de biòpsies de pacients amb càncer de mama triple negatiu i en els organoides derivats de pacients amb càncer de mama. Aquests estudis van demostrar que NP-FAP-DOX es dirigia eficaçment i produïa un efecte citotòxic en les cèl·lules de càncer de mama amb expressió positiva de FAP-¿, així com en fibroblasts associats al càncer. A més, la NP-FAP-DOX va presentar una bona eficiència de penetració en els organoides derivats de pacient, mantenint així l'acció dirigida i l'efecte citotòxic en aquest model tridimensional. Finalment, es va avaluar la eficàcia de NP-FAP-DOX in vivo en un model murí de càncer de mama triple negatiu. La NP-FAP-DOX va mostrar una bona capacitat per a atacar tumors i una administració eficaç de fàrmacs, el que va donar com a resultat un efecte antitumoral in vivo. Addicionalment, el tractament in vivo amb NP-FAP-DOX es va dirigir eficaçment als fibroblasts associats al càncer generant la seua depleció i així, la remodelació del microambient tumoral i l'activació de la resposta immunitària del tumor. Específicament, aquest tractament va promoure la infiltració de limfòcits, va augmentar el percentatge de cèl·lules citocides naturals i va disminuir els macròfags M2, el que va conduir a un augment en la proporció M1/M2 en els tumors. A més, les nanopartícules van millorar el perfil terapèutic i de seguretat del fàrmac lliure, prevenint la toxicitat cardíaca i sistèmica induïda per la doxorubicina. Amb tot, aquests resultats demostraren el potencial dels nanodispositius dissenyats com un nou sistema d'administració de fàrmacs dirigits per al tractament del càncer de mama. Aquestes nanopartícules poden millorar l'eficàcia de l'administració de fàrmacs, reduir els efectes secundaris adversos i millorar l'eficàcia de la teràpia mitjançant la modulació del microambient tumoral. / [EN] Most of the breast cancer therapies currently used in the clinical practice are focused on targeting tumor cells. Nevertheless, new advances in the immunology field uncovered the main role of the tumor microenvironment in tumor modulation. Specifically, cancer-associated fibroblasts play an important role in tumor progression, tumor immunity modulation, and therapy resistance. Hence, this Ph.D. thesis entitled "Mesoporous silica nanoparticles targeting tumor microenvironment as a tool for breast cancer treatment" is focused on the design of a nanodevice targeting cancer-associated fibroblasts and on the evaluation of its potential as a new therapeutic strategy for breast cancer treatment. A nanoparticle was designed and synthesized using mesoporous silica nanoparticles as support, loaded with doxorubicin, and functionalized with a FAP-¿ ligand peptide (NP-FAP-DOX). NP-FAP-DOX's characterization showed controlled cargo release and an in vitro nontoxic profile. The in vitro studies evaluated the nanoparticle efficacy to target FAP-¿, cellular cytotoxicity, and tumor penetration in breast cancer cell lines, cancer-associated fibroblasts derived from triple-negative breast cancer patient biopsies, and breast cancer patient-derived organoids. These studies probed that the NP-FAP-DOX efficiently targeted and produced a cytotoxic effect in breast cancer cells with FAP-¿ positive expression as well as in cancer-associated fibroblasts. Moreover, the NP-FAP-DOX presented good penetration efficiency in patient-derived organoids, while maintaining the targeting and cytotoxic effect in this 3D model. Finally, the NP-FAP-DOX's in vivo efficacy was evaluated in a murine triple-negative breast cancer model. The NP-FAP-DOX showed a tumor-targeting ability and effective drug delivery, resulting in an in vivo antitumoral effect. Moreover, the NP-FAP-DOX in vivo treatment efficiently targeted and depleted cancer-associated fibroblasts, leading to tumor microenvironment re-modulation and activation of tumor immune response. Specifically, this treatment promoted lymphocyte infiltration, increased the percentage of natural killer cells, and decreased the M2-like macrophages leading to an increased M1/M2 ratio in tumors. Besides, the nanoparticles improved the therapeutic and safety profile of the free drug, preventing doxorubicin-induced cardio and systemic toxicity. Overall, these results demonstrated the potential of the designed nanodevices as a new targeted drug delivery system for breast cancer treatment. These nanoparticles can improve drug delivery efficacy, overcome adverse side effects, and enhance therapy efficacy through the modulation of the tumor microenvironment. / Trigo Lameirinhas, AC. (2024). Mesoporous Silica Nanoparticles Targeting Tumor Microenvironment as a Tool for Breast Cancer Treatment [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/210630