O melanoma é o mais agressivo tumor da pele, cuja resistência aos tratamentos quimioterápicos tem promovido a crescente utilização de imunoquimioterapia, como é o caso da utilização de agonistas dos receptores Toll-Like (TLRs). Nesse contexto, os compostos abreviados por P-MAPA e seu sintético estrutural MRB-CFI-1 com reconhecidas propriedades antitumorais e imunológicas, são fortes candidatos na terapia e prevenção desse tipo de câncer. Esse estudo visa determinar o potencial anticâncer do P-MAPA e de MRB-CFI-1 contra o melanoma murino em consequência ao padrão de resposta microambiental semelhante ao de morte imunogênica, em regimes de tratamento terapêutico ou vacinal, na vigência de quimioterapia com cisplatina e/ou em associação com antígenos de células tumorais totais. Após avaliação In vivo do crescimento de tumores B16F10 implantados em modelos murinos selvagem e nocaute para o gene Myd88, na vigência ou não do tratamento com cisplatina e/ou P-MAPA, nossos resultados mostraram que o P-MAPA apresentou atividade pró-tumoral e antagonizou a ação da cisplatina em inibir o crescimento dos tumores, de forma dependente de Myd88. Além disso, através de análises qualitativa e quantitativa pelo software ImageJ em fotomicrografias de secções tumorais coradas histologicamente, observamos que o P-MAPA promoveu mudanças microambientais nos tumores que podem impactar negativamente em seu desempenho. Como monoterapia em esquema de vacinação com lisado tumoral total em combinação com quimioterapia, o P-MAPA em dose baixa falhou em suprimir o crescimento de tumores B16F10, mas o seu sintético MRB-CFI-1 foi capaz de prevenir o crescimento desse tipo de melanoma num regime de vacinação profilática. Apesar do sucesso terapêutico desse imunomodulador em diversos modelos de câncer e de doenças infecciosas, o P-MAPA não foi eficaz em produz respostas microambientais contra o melanoma murino, dados esses que limitam a aplicabilidade clínica do composto. De outro modo, o composto fosfato inorgânico MRB-CFI-1 foi protetivo em retardar o aparecimento desse tipo de doença. Assim, o presente estudo foi importante por ampliar o entendimento funcional do P-MAPA numa abordagem imunoquimioterápica em modelos biológicos de tumores de melanoma, e representa uma importante mudança na utilização de constituintes individuais similares ao P-MAPA que sejam mais eficazes, de fácil obtenção, e de produção controlada e garantida / Melanoma is the most aggressive skin cancer, whose resistance to chemotherapeutic treatments has promoted the increasing use of immunochemotherapy, as is the case for the use of Toll-Like receptor agonists (TLRs). In this context, the compounds abbreviated by P-MAPA and its structural synthetic MRB-CFI-1 with recognized antitumor and immunological properties are strong candidates in the therapy and prevention of this type of cancer. This study aims to determine the anti-cancer potential of P-MAPA and MRB-CFI-1 against murine melanoma as a consequence of the microenvironmental response pattern similar to that of immunogenic death in therapeutic or vaccine treatment regimens when using chemotherapy with cisplatin alone or in combination with whole tumor cell antigens. After In vivo evaluation of the growth of B16F10 tumors implanted in wild-type and Myd88 gene knockout mice, under treatment or not with cisplatin and / or P-MAPA, our results showed that P-MAPA showed pro-tumor activity and antagonized the action of cisplatin in inhibiting the growth of tumors in a Myd88-dependent manner. In addition, using qualitative and quantitative analysis by ImageJ software in histological images of tumor sections, we observed that P-MAPA promoted microenvironmental changes in tumors that may negatively impact its performance. As monotherapy in vaccination schedule with total tumor lysate in combination with chemotherapy, low dose P-MAPA failed to suppress the growth of B16F10 tumors, but its synthetic MRB-CFI-1 was able to prevent the growth of this type of melanoma in prophylactic vaccination regimen. Despite the therapeutic success of this immunomodulator in various cancer models and infectious diseases, P-MAPA has not been effective in producing microenvironmental responses against murine melanoma, data that limit the clinical applicability of the compound. Otherwise, the inorganic phosphate compound MRB-CFI-1 was protective in delaying the onset of this type of disease. Thus, the present study was important because it broadened the functional understanding of P-MAPA in an immuno-chemotherapeutic approach in biological models of melanoma tumors and represents an important change in the use of individual constituents similar to P-MAPA that are more efficient, easily obtainable, and controlled and guaranteed production

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5684.pdf: 2471155 bytes, checksum: f035dbceafb88325d3cb0d3fb8280603 (MD5) Previous issue date: 2013-12-10 / Financiadora de Estudos e Projetos / Matrix metalloproteinases (MMPs) are key factors in tumor progression that allow tumor cells to modify the extracellular matrix (ECM) and to release cytokines, growth factors being activated by cell surface molecules such as the integrins. Integrins are major adhesion receptors of cell surface that connect the cells to the external environment enabling its movement. Integrins activate signaling cascades that influence the adhesion, survival and cell proliferation. Important inhibitors of these molecules were found in snake venoms called disintegrins. Alternagin-C (ALT-C) a disintegrin from Rhinocerophis alternatus snake venom has affinity with α2β1 integrin therfore modulating cell adhesion, migration and proliferation. However, the effect of ALT-C on MMP activity has not been described yet. Here, we have found that, ALT-C increased cell migration in MDA-MB-231 at lower concentration (10 nM) and it decreased cell migration at higher concentrations (40, 100 and 1000 nM). ALT-C was able to inhibit MMP-9 activity in human breast cancer (MDA-MB-231) conditioned medium and MMP-2 activity in fibroblastas and human microvascular endothelial cells (HMEC-1) conditioned medium. ALT-C also modulated the expression of angiogenic genes such as VEGF, c-MYC, MMP-2 and MMP-9 and it was able to inhibit transendothelial migration of MDA-MB-231 cells at all concentrations (10, 40, 100 and 1000 nM). In conclusion, ALT-C affects the extracellular matrix remodeling by modulating the activity of MMPs and expression of angiogenic genes essential for tumor growth as well as decreased cell migration. / As metaloproteinases de matriz (MMPs) são fatores chave na progressão tumoral, pois participam do remodelamento da matriz extracelular (ECM), liberam citocinas, fatores de crescimento e são reguladas por moléculas da superfície celular (integrinas). As integrinas são os principais receptores de adesão da superfície celular. Elas interagem com proteínas presentes na matriz extracelular conectando as células ao meio no qual estão inseridas possibilitando sua locomoção e a participação em cascatas de sinalização que influenciam a adesão, sobrevivência e a proliferação celular. Importantes inibidores dessas moléculas foram encontrados em venenos de serpentes denominados de desintegrinas. Alternagina-C (ALT-C), uma desintegrina de veneno da serpente Rhinocerophis alternatus, tem afinidade para a integrina α2β1, modula a adesão, migração e a proliferação celular mas não há nenhum estudo publicado sobre sua influência na atividade das MMPs. Nesse estudo, a ALT-C foi capaz de aumentar a migração celular em MDA-MB-231 em baixa concentração (10 nM) e diminuir a migração em concentrações mais elevadas (40, 100 e 1000 nM). ALT-C também inibiu a atividade de MMP-9 em meio condicionado de células de carcinoma de mama (MDAMB- 231) e atividade de MMP-2 em meio condicionado de fibroblastos e células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1). A desintegrina também foi capaz de modular a expressão de genes angiogênicos como VEGF, c-MYC, MMP-2 e MMP-9 e inibir a transmigração das células tumorais através das células endoteliais. Conclui-se que a ALT-C atua no remodelamento da matriz extracelular do microambiente tumoral por modular a atividade de MMPs e a expressão de genes angiogênicos essenciais no crescimento tumoral, bem como diminuindo a migração celular.

Introdução: Indivíduos sobreviventes à sepse apresentam maior mortalidade à longo prazo e maior risco de apresentar infecções oportunistas. Existem evidências clínicas e experimentais de desregulação imune no estado pós-sepse. Essas alterações apresentam semelhança com aquelas encontradas no microambiente tumoral, estando relacionadas à imunossupressão. O presente trabalho avaliou o papel de macrófagos associados ao tumor (TAM) em modelo de progressão tumoral em camundongos sobreviventes à sepse. Materiais e Métodos: Camundongos C57/BL6 foram submetidos a ligadura e punção cecal (CLP) e tratados com ertapenem (20 mg/kg, i.p., 6 horas após CLP e 12/12 h por 3 dias). Os animais sobreviventes de sepse eram inoculados com células de melanoma B16-F10 (30 mil, s.c., 15 dias após a CLP). Animais naïve foram usados como controle. Foram avaliadas a progressão tumoral, sobrevida e formação de metástases espontâneas à distância. No D+14, animais foram sacrificados para mensuração do acúmulo de TAM por citometria de fluxo (CD45+F4/80+CD206+) e de citocinas no soro e no tumor por ELISA (IFN-?, IL-10, TNF-?, TGF-?, CCL2, CXCL12). Macrófagos derivados de medula óssea de animais pós-CLP ou naïve foram coinoculados com células B16 para avaliação de progressão tumoral e sobrevida. TAM de animais naïve ou pós-CLP foram isolados através de gradiente de Percoll seguido de adesão seletiva e o RNA foi isolado para análise diferencial de expressão gênica por microarray. Para avaliação da participação da via CXCL12/CXCR4 foi realizada sua inibição com o AMD3100, antagonista de CXCR4 (5 mg/kg, i.p., D+10 e D+14). Foi avaliada a progressão tumoral, sobrevida, acúmulo de TAM e proliferação extramedular de TAM no D+14. Resultados: Animais sobreviventes de sepse apresentaram aumento de progressão tumoral (após 15, 30 e 60 dias da CLP), aumento da carga de metástases (após 15 dias da CLP) e redução de sobrevida. Foi detectado o aumento de TAM nos animais pós-CLP, associado a maior marcação de Ki67, em comparação com animais naïve no D+14. Verificamos aumento das concentrações séricas de TGF-?, CXCL12, CCL2 e TNF-?. Camundongos naïve que coinoculados com macrófagos derivados de medula óssea de animais pós-CLP apresentaram aumento de progressão tumoral e redução de sobrevida em comparação com o grupo controle. TAM de animais pós-CLP apresentaram menor expressão de genes relacionados ao MHC-II e genes relacionados à ativação leucocitária. A inibição de CXCL12/CXCR4 preveniu a progressão tumoral induzida por sepse, com menor acúmulo de TAM e menor presença de TAM Ki67+. Conclusões: O estado pós-sepse promove a progressão tumoral de melanoma B16 em camundongos, o qual foi associado a aumento de 12 TAM. A via CXCL12/CXCR4 participa do processo de acúmulo de TAM nesse modelo experimental. / Background: Survivors from sepsis present higher long-term mortality and increased risk of opportunistic infections. There is clinical and experimental evidence for an immunosuppressive immune dysregulation in post-sepsis. These alterations are similar to those found in tumor microenvironment. The present work assessed the role of tumorassociated macrophage (TAM) in a model of tumor progression in sepsis-surviving mice. Materials and Methods: C57/BL6 mice were submitted to cecal ligation and puncture (CLP) and treated with ertapenem (20 mg/kg, ip. - 6 h after CLP and then each 12 h for 3 days). Sepsis surviving mice were inoculated with B16-F10 melanoma cells (30,000, sc., 15 days after CLP). Naïve mice were used as controls. Tumor progression, survival and distant spontaneous metastasis were evaluated. Mice were killed at D+14 for TAM measurement through flow cytometry (CD45+F4/80+CD206+) and for cytokines (IFN-?, IL-10, TNF-?, TGF-?, CCL2, CXCL12) quantification by ELISA. Bone marrow-derived macrophage (BMDM) were isolated and co-inoculated together with B16 melanoma cells for tumor progression and survival evaluation. TAM from naïve or post-sepsis mice were isolated through Percoll gradient (70/30) followed by selective adhesion. The RNA was isolated for gene expression analysis using microarray assay. To evaluate the role of CXCL12/CXCR4, we used the specific antagonist AMD3100 (5 mg/kg, ip., at D+10 and D+14) and assessed tumor progression, survival and TAM accumulation at D+14. Results: Sepsis-surviving mice showed increased tumor progression (15, 30 or 60 days after CLP), higher metastatic burden (15 days after CLP), and less overall survival. TAM were increased in post-sepsis mice at D+14. We found increased serum levels of TGF-?, CXCL12, CCL2 e TNF-?. Naïve mice inoculated with BMDM from post-sepsis and B16 cells showed higher tumoral progression and less survival, when compared to the control group. TAM from post-sepsis showed decreased expression of MHC-II related genes and genes related to leukocyte activation. The inhibition of CXCL12/CXCR4 prevented the post-sepsis-induced tumor progression, with less TAM accumulation and reduced expression of Ki67 in TAM. Conclusions: The post-sepsis state promotes the progression of B16 melanoma in mice, which was associated with an increase in TAM accumulation. CXCL12/CXCR4 mediates TAM accumulation in this experimental model.

O melanoma é a forma mais letal entre os cânceres de pele. Essa neoplasia freqüentemente apresenta-se resistente a abordagens terapêuticas. A angiogênese associada ao tumor representa um crítico passo da tumorigênese, resultado da ação de diferentes citocinas e fatores de crescimento como VEGF produzidos no microambiente tumoral. As galectinas extracelulares participam de múltiplos processos biológicos incluindo angiogênese tumoral e metástases, sua interação com as células presentes no microambiente tumoral pode ocorrer via receptores toll-like sugerindo seu envolvimento nos processos pro-inflamatórios e na secreção de citocinas. Recentemente mostramos que a ausência de gal-3 no estroma e parênquima tumoral diminui a angiogênese por interferir na resposta de macrófagos via VEGF e/ou TGFbeta1. Entretanto, o envolvimento de galectinas extracelulares na angiogênese e na modulação do sistema imune no microambiente tumoral ainda não está esclarecido. Assim, este estudo visa buscar respostas ao envolvimento das galectinas no crescimento tumoral e angiogênese contribuindo ao combate do melanoma maligno. Nossos resultados mostram a participação das galectinas 1 e 3 no crescimento tumoral e seu envolvimento com macrófagos via receptores toll-like, além de coordenarem a modulação do perfil de polarização de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos wild-type. Dessa forma, podemos inferir que essas galectinas agem como coordenadoras de mudança de perfil dos macrófagos, uma vez que inibidas extracelularmente promovem uma diminuição do crescimento tumoral em camundongos wild-type, inoculados com células de melanoma murino e uma manutenção do perfil de macrófagos M1 in vitro. Assim, concluimos que as galectinas 1 e 3 extracelulares são importantes para o crescimento tumoral de melanomas murinos pois promovem o crescimento tumoral e são coordenadoras da mudança do perfil de macrófagos / Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. This tumor often presents itself resistant to therapeutic approaches. The tumor-associated angiogenesis is a critical step in tumorigenesis and the result of the action of several cytokines and growth factors such as VEGF produced in the tumor microenvironment. The extracellular galectins participate in multiple biological processes including tumor angiogenesis and metastasis, their interaction with cells present in the tumor microenvironment may occur via toll-like receptors suggesting their involvement in pro-inflammatory processes and the secretion of cytokines. We have recently shown that the absence of Gal-3 the stroma and tumor parenchyma decreases angiogenesis by interfering with the macrophage response by VEGF and / or TGFbeta1. However, the involvement of extracellular galectins on angiogenesis modulation of the immune system in the tumor microenvironment is not yet clear. This study aims is to find answers to the involvement of galectins on tumor growth and angiogenesis contributing to the study of the malignant melanoma. Our results demonstrate the involvement of galectin 1 and 3 on tumor growth and its involvement in macrophage by toll-like receptors pathway, and coordinating the modulation of the polarization profile in wild-type mice bone marrow derived macrophages. Therefore, we show these galectins act as coordinators of macrophages profile change, since inhibited extracellularly promote a reduction in tumor growth in wild-type mice inoculated with murine melanoma cells and macrophages M1 maintenance of profile in vitro. Thus, we conclude that galectins 1 and 3 extracellular are important for tumor growth of murine melanomas because they promote tumor growth and are coordinators of change macrophages profile

INTRODUÇÃO: O carcinoma ductal in situ da mama é o estágio final antes do carcinoma ductal invasivo (CDI) no processo de carcinogênese mamária. As semelhanças histológicas, moleculares e imunoistoquímicas do epitélio nestas duas lesões tornaram improvável que o epitélio fosse o único responsável pelo processo de invasão estromal. Ao mesmo tempo, foram identificadas importantes alterações nas características do microambiente mamário durante esta transição. As células mioepiteliais, componente do microambiente e cuja rotura determina o diagnóstico histológico do carcinoma invasivo, tem papel direto ou indireto neste processo. A fim de predizer esse risco de invasão, propomos que as características das células mioepiteliais sejam investigadas em conjunto com as características intrínsecas do epitélio neoplásico. OBJETIVOS: Determinar os fatores morfológicos e moleculares das células epiteliais e os marcadores das células mioepiteliais do microambiente em carcinomas ductais in situ da mama relacionados ao risco de invasão estromal. MÉTODOS: Foram selecionados retrospectivamente 236 casos consecutivos com diagnóstico inicial de CDIS seguidos de ressecção cirúrgica na Divisão de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo no período de janeiro de 2000 a dezembro de 2009, divididos nos grupos 1 (CDIS puro, 90 casos) e 2 (CDIS associado a carcinoma invasor, 146 casos). Blocos de microarranjos de tecido foram construídos com áreas representativas dos CDIS e CDI que foram, então, classificados nos perfis moleculares de acordo com o seu perfil imunoistoquímico. Os marcadores mioepiteliais (vimentina, AML, calponina, p63, CK5/6, SMMHC, CD10) foram avaliados de acordo com a expressão imunoistoquímica baixa ou alta. RESULTADOS: Os perfis moleculares dos componentes in situ e invasivo da mesma lesão foram semelhantes. Os CDIS de baixo grau histológico, em comparação aos CDIS de alto grau, apresentaram maior número de casos com perfil molecular luminal (143 vs. 18) e menor proporção de casos luminal/HER2-positivo (6 vs. 11), HER2 (4 vs. 27) e triplo-negativo (3 vs. 22). Os CDIS no grupo 1, em relação aos CDIS no grupo 2, tiveram maior proporção de casos com expressão de receptores hormonais (84.4% vs. 71,2%) menor expressão de HER2 (76,7% vs. 81,5%), mais perfis moleculares luminal/HER2-positivo (12,2% vs. 4,1%) e menos perfis triplo-negativos (4,4% vs. 14,4%). A expressão de CK5/6 nas células epiteliais do CDIS teve maior proporção entre o subtipo HER2 (34,5%), seguido pelo triplo-negativo (25%), luminal/HER2- negativo (15,4%) e luminal/HER2-positivo (12,5%). A expressão de CK5/6 foi maior nas células epiteliais dos CDIS do grupo 1 em relação aos CDIS do grupo 2 (30,6% vs. 11,3%). A expressão alta de SMMHC nas células mioepiteliais associou-se mais frequentemente aos CDIS do grupo 1 (88,2%) em relação aos CDIS do grupo 2 (11,8%), e esta diferença manteve-se tanto nos CDIS de baixo grau (85,7%) quanto nos de alto grau histológico (92,3%). A expressão baixa de CD10 nas células mioepiteliais associou-se mais frequentemente aos CDIS do grupo 2 (95,6%) em relação aos CDIS do grupo 1 (4,4%), e esta diferença manteve-se tanto nos CDIS de baixo grau (96,4%) quanto nos de alto grau histológico (94,1%). Não houve diferença na expressão de marcadores mioepiteliais de acordo com o perfil molecular baseado na imunoistoquímica. CONCLUSÕES: O risco de invasão estromal em CDIS está associado ao perfil molecular triplo-negativo e à perda de expressão do marcador CD10 pelas células mioepiteliais e é inversamente proporcional à expressão de CK5/6 pelas células neoplásicas e à forte expressão do marcador SMMHC nas células mioepiteliais / INTRODUCTION: Ductal carcinoma in situ is the last step preceding invasive ductal carcinoma in breast carcinogenesis. Histologic, molecular and immunohistochemistry similarities in epithelium of these components make improbable that epithelial changes are sole responsible for the stromal invasion. At the same time important changes were identified in mammary microenvironment during this transition. Myoepithelial cells, components of microenvironment and which rupture is the histological definition of stromal invasion, have a direct or indirect role in this process. We propose an associated investigation of myoepithelial cells and intrinsic neoplastic epithelium caracteristics in view of predict the risk of stromal invasion. OBJECTIVES: To determinate morphologic and molecular factors of epithelial cells and microenvironment myoepithelial cell markers related to stromal invasion risk in ductal carcinomas in situ of the breast. METHODS: 236 cases with initial diagnosis of DCIS followed by surgical ressection were retrospectively selected from Division of Surgical Pathology, Faculty of Medicine, Sao Paulo University from january 2000 to december 2009, divided in groups 1 (pure DCIS, 90 cases) and 2 (DCIS associated with invasive carcinoma, 146 cases). Tissue microarrays were constructed with selected areas of DCIS and IDC and those were then classificated in molecular subgroups according to its immunohistochemistry profile. Myoepithelial markers (vimentin, smooth muscle actin, calponin, p63, CK5/6, SMMHC, CD10) were avaliated according to its high or low immunohistochemistry expression. RESULTS: Molecular profiles of in situ and invasive components of the same tumor were similar. Low-grade DCIS showed more luminal profiles than highgrade DCIS (143 vs. 18), and less luminal/HER2-positive (6 vs. 11), HER2 (4 vs. 27) and triple-negative (3 vs. 22) profiles. Group 1 DCIS, compared to group 2 DCIS, showed more cases with hormonal receptor expression (84.4% vs. 71.2%), less expression of HER2 (76.7% vs. 81.5%), more luminal/HER2-positive (12.2% vs. 4.1%) and less triple-negative profiles (4.4% vs. 14.4%). CK5/6 expression in epithelial cells was more frequent in HER2 (34.5%) subtype followed by triple-negative (25%), luminal/HER2-negative (15.4%) and luminal/HER2-positive (12.5%). Epithelial cells in group 1 DCIS showed more CK5/6 expression than cells in group 2 DCIS (30.6% vs. 11.3%). High expression of SMMHC in myoepithelial cells was more frequent in group 1 DCIS (88.2%) than group 2 DCIS (11.8%) and this pattern was also mantained in low-grade DCIS (85.7%) and high-grade DCIS (92.3%). Low expression of CD10 in myoepithelial cells was more frequent in group 2 DCIS (95.6%) than group 1 DCIS (4.4%) and this pattern was also mantained in low-grade (96.4%) and high-grade DCIS (94.1%). There was no significant difference in expression of myoepithelial cells according to molecular profile classified by immunohistochemistry. CONCLUSIONS: Stromal invasion risk in DCIS is associated with triple-negative profile, CD10 expression loss in myoepithelial cells and inversely correlated with CK5/6 expression in neoplastic cells and high expression of SMMHC in myoepithelial cells

O desenvolvimento do câncer cervical está associado à infecção por alguns tipos de Papilomavírus Humano (HPV). Entre os mecanismos de carcinogênese associados ao HPV incluem-se alterações em moléculas que modulam a manutenção de componentes da matriz extracelular (MEC), como as metaloproteinases de matriz (MMP) e alguns de seus reguladores. A proteína RECK (reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs) apresenta função essencial na remodelação tecidual e na angiogênese fisiológica ou tumoral, através da regulação pós-transcricional da atividade de MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). Resultados publicados previamente por nosso grupo apontam para a correlação entre a expressão da oncoproteína E7 de HPV16, a alta expressão e atividade de MMP-9 e a baixa expressão de seus reguladores, TIMP-2 e RECK. A expressão de RECK também é baixa em lesões do colo uterino de alto grau e em amostras de câncer cervical, quando comparadas a amostras de pacientes com cervicite. O presente estudo visa determinar o papel de RECK no processo de tumorigênese mediado por HPV. Para isto, estabelecemos linhagens derivadas de tumor de colo de útero (SiHa, SW756 e C33A) que superexpressam RECK a partir de transdução com lentivírus. Os efeitos da superexpressão de RECK sobre o potencial tumorigênico de SiHa, SW756 e C33A foram avaliados em modelos de estudo in vivo e in vitro. De maneira geral, a superexpressão de RECK foi associada com a capacidade reduzida de invasão em câmara de Matrigel® e de formação de colônia independente de ancoragem. Ainda, camundongos nude inoculados s.c. com células tumorais superexpressando RECK apresentaram atraso no estabelecimento e crescimento tumoral e sobrevida global estendida quando comparados aos controles. Ambos tumores derivados de SiHa RECK e SW756 RECK apresentaram redução na frequência de células tumorais e endoteliais, ao passo que mostrarm aumento no infiltrado inflamatório. Esta observação foi acompanhada de redução na população de neutrófilos e potenciais células mieloderivadas supressoras em tumores de ambas as linhagens. Em tempo, analisamos séries de dados de expressão de CIN e carcinomas cervicais do banco de dados GEO e verificamos que a hipermetilação do gene RECK e a inibição da expressão de mRNA de RECK são eventos precoces no desenvolvimento do câncer de colo de útero. Avaliamos que a baixa expressão de RECK foi associada a progressão de lesões CIN3+ e ao aumento de metástases em linfonodo pélvico em pacientes com câncer de colo de útero. Ademais, notamos que o tratamento com quimio radioterapia levou ao aumento dos níveis de mRNA de RECK em um outro grupo de pacientes com câncer de colo de útero. Concluímos que a superexpressão de RECK (i) reduz o potencial tumorigênico de linhagens celulares derivadas de colo de útero independente do status de infecção por HPV e que (ii) o seu efeito sobre as populações intratumorais se mostrou específico para as linhagens infectadas por HPV. Estes resultados apontam para uma possível interação entre as alterações no microambiente tumoral associadas ao HPV e a função de RECK. Finalmente, a regulação negativa da expressão de RECK é um evento precoce na história natural do câncer cervical. / Persistent infection with high-risk Human Papillomavirus (HPV) types is the main etiologic factor for the development of cervical cancer. The HPV carcinogenic mechanisms include alterations in extracellular matrix (ECM) components, as matrix metalloproteinases (MMP) and its regulators. The Reversion-inducing Cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) plays a central role on tissue remodeling, tumor angiogenesis and exert inhibitory effects on the transcription, synthesis, activation and activity of MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). As previously published by our group, it has been observed a correlation between the HPV16 E7 oncoprotein expression, the up-regulation of MMP-9 and the down-regulation of its inhibitors, RECK and tissue inhibitor of metalloproteinases 2 (TIMP-2). Also, RECK expression was downregulated in cervical intraepithelial neoplasias grades 2 and 3 (CIN2/3) and invasive carcinoma samples levels when compared with clinical samples of pacients diagnosed with cervicitis. The present study aims to determine the role of RECK in HPV mediated tumorigenesis. In order to do so, we generated cervical tumors derived cell lines (SiHa, SW756 e C33A) superexpressing RECK by lentiviral transduction followed by FACS. We assessed the effects of RECK superexpression in the tumorigenic potential of SiHa, SW756 e C33A using both in vitro and in vivo protocols. Overall, RECK superexpression is associated with reduced chamber invasion and reduced anchorage independent colony formation. Moreover, nude mice injected s.c. with RECK superexpressing tumor cells presented (i) delayed tumor establishment and (ii) increased overall survival, when compared with controls. Both SiHa and SW756 superexpressing RECK presented decreased frequency of tumor and endothelial cells, whilst showed increase in inflammatory infiltrate population. This observation was followed by a decrease in potential myeloid derived suppressor cell and neutrophil populations in both SiHa RECK and SW756 RECK tumors. Additionally, we observed hipermethylation and premature and consistent downregulation of RECK mRNA expression in CIN and cervical cancer expression datasets from GEO database. We observed that reduced RECK expression was associated with CIN3+ progression and increased pelvic lymph node metastasis in cervical cancer patients. Furthermore, we found that chemo radiotherapy treatment led to increased levels of mRNA in another set of cervical cancer patients. We conclude that RECK superexpression reduces the tumorigenic potential of cervical cancer derived cell lines regardless of HPV infection status. However, we found that the effect of RECK over the intratumoral cells populations is specific to HPV infected tumor cell lines. These results points to a possible interaction between HPV associated tumor microenvironment alterations and RECK. Finally, RECK downregulation is an early event in the natural history of cervical cancer.

No câncer de mama, o metabolismo tumoral, ação dos moduladores de estrógenos são fatores que podem influenciar as células dendríticas (DCs). Neste trabalho avaliou o fenótipo de DCs em amostras tumorais, a diferenciação de DCs a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) das pacientes e comparou com voluntárias saudáveis. Os resultados mostraram que há alteração na capacidade de geração, no fenótipo, na capacidade aloestimuladora, maior produção de interleucina 10 e expressão de HSP27 nas DCs de pacientes, comparadas com as DCs de voluntárias saudáveis que produzem mais Interferon-gama. A via p38MAPK parece ser importante na diferenciação de PBMCs em DCs, entretanto, estímulos estressantes podem ativar esta via e induzir a síntese de HSP27 inibindo este processo. O tratamento com tamoxifeno parece modular a expressão de algumas moléculas de membrana. Desta forma, os resultados sugerem que as DCs diferenciadas de pacientes com câncer de mama apresentam alterações fenotípicas e funcionais causadas pelo microambiente tumoral. / In breast cancer, the tumor metabolism, the action of estrogens antagonists can influence dendritic cells (DC) generation. The aim of this work was to evaluate the frequency of DCs in tumor tissue and the differentiation of DCs derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and compared the phenotypic and functionally of these cells from healthy individuals and breast cancer patients. The results showed that patients PBMCs were unable to generate phenotypicaly, functionally mature DCs and presented larger production of interleukin 10 and higher expression of HSP27 when compared with healthy volunteers\' DCs, presented higher production of Interferon-gamma. The p38 MAPK signaling pathway seems to be important in PBMCs differentiation into DCs, and its activation by stress can induce the synthesis of HSP27, that inhibits DC generation. The tamoxifen treatment caused modulation of membrane DC markers expression. Therefore, these results show that patients\' DCs present phenotypic and functional alterations which can be caused by tumor microenvironment.

O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno, de maior ocorrência em cães, possui rápido crescimento e alto potencial metastático. Assim, o cão é um modelo útil para o estudo da doença em humanos, tendo em vista as semelhanças clínicas e histopatológicas que ocorrem em ambas às espécies. Atualmente, os estudos a respeito de células-tronco são promissores considerando seu alto potencial terapêutico. Entretanto, ainda prevalecem muitas dúvidas referentes ao tratamento de tumores utilizando a terapia celular. Este tema é pouco conhecido e estudado, por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre células-tronco obtidas da polpa dentária canina com as células derivadas osteossarcoma canino. Foram realizados cocultivos celulares das células derivadas de polpa dentária canina, osteossarcoma canino e derivadas de osso normal canino. Analisou-se os aspectos morfológicos das células cocultivadas e controle, assim como a atividade proliferativa, a morte celular, o potencial elétrico mitocondrial e a expressão gênica. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a interação entre a célula-tronco da polpa dentária canina imatura e as células de osteosarcoma canino não apresentam alterações morfológicas. Entretanto, as células-tronco derivadas da polpa dentária canina e de osso fetal canino sadio parecem servir de suporte para o crescimento tumoral. Além disso, a cocultura celular, em todos os grupos testados, promove alterações na expressão gênica e proteica. / Osteosarcoma is a malignant bone tumor most frequent in dogs. It has fast growth and high metastatic potential. Thus, the dog is an useful model for the study of human disease, due to the clinical and histological similarities found in both species. Currently, studies about stem cells are promising considering its high therapeutic potential. However, many doubts still exist regarding the treatment of tumors using cell therapy. This theme is little known and studied. Therefore, the aim of this study was to evaluate the interaction between stem cells obtained from canine immature dental pulpstem cells with osteosarcoma cells derived from dogs. Cellular coculture were performed using cells derived from canine dental pulp, canine osteosarcoma and canine normal bone. The morphological aspects of cocultured cells and control were analyzed, as well as proliferative activity, cell death, the mitochondrial membrane electric potential and gene expression. In summary, it was concluded that the interaction between stem cells from canine immature dental pulp and canine osteosarcoma cells did not show morphological changes. However, stem cells derived from canine dental pulp and healthy canine fetal bone serve to support tumor growth. Furthermore, the cell coculture in all groups tested, causes changes in gene and protein expression.

INTRODUÇÃO: A incidência de câncer da glândula tireoide é a que mais vem crescendo nas últimas décadas. Dentro desse grupo de diferentes neoplasias, o carcinoma papilífero, um dos carcinomas bem diferenciados, representa a maioria e tem prognóstico favorável, com sobrevida acima dos 90% em 5 anos. Embora sejam utilizadas diversas classificações de risco baseadas em diferentes fatores prognósticos, ainda não se consegue predizer quais pacientes terão maior chance de recorrência, metástases linfonodais e desfecho desfavorável, que se beneficiariam de um tratamento mais agressivo. Já foi demonstrado em diversos tipos de neoplasias que diferenças no perfil do infiltrado imune tumoral têm relação com prognóstico e resposta ao tratamento. Neste estudo caracterizou-se o microambiente imune do carcinoma papilífero através de marcadores imuno-histoquímicos de células inflamatórias e relacionou-se este perfil de infiltração com fatores prognósticos clínico-patológicos e com sobrevida livre de recorrência. MÉTODOS: Foram incluídos 151 casos selecionados com base em um banco de dados que incluiu todos os pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para câncer de tireoide no A.C.Camargo Cancer Center entre 2008 e 2010. Casos com tireoidite significante foram excluídos. Estes tumores selecionados foram então submetidos a reação imuno-histoquímica com marcadores de células inflamatórias e foram analisados por dois patologistas experientes. As características clínicas e patológicas foram avaliadas, assim como as recorrências e sobrevida, relacionando-as com as leituras de células marcadas. As análises de sobrevida global e livre de doença foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier, com comparação de curvas de sobrevida pelo teste de Logrank. RESULTADOS: Cento e cinquenta e um pacientes foram incluídos, sendo 130 (86,1%) mulheres e 21 (13.9%) homens. Multifocalidade foi encontrada em 41 (27.2%), extensão extratireoidiana em 43 (28.5%) e metástase linfonodal em 36 (23.8%) casos. Apenas dois pacientes apresentaram metástase a distância. O tempo de seguimento médio foi 65,1 meses e observou-se nove (6%) pacientes com recorrências de neoplasia. Os pacientes com tumores com metástase linfonodal e/ou extensão extratireoidiana apresentaram maior risco de recorrência. Dos marcadores analisados, uma maior densidade de CD8 (que marca linfócitos citotóxicos) na área peritumoral esteve associada a uma tendência a melhor sobrevida livre de recorrência: 97,1% versus 87,5% (p=0,057), além de significativos menores índices de multifocalidade tumoral e de metástase linfonodal. A maior infiltração de linfócitos T CD8+ no tumor também se relacionou com menor ocorrência de metástase linfonodal nesta amostra (18,4% versus 38,1%, p=0,011). Além disso, a densidade desta marcação, tanto no interior da lesão neoplásica como em área peritumoral foi significativamente maior nos casos de carcinomas papilíferos restritos à tireoide, ou seja, sem extensão extratireoidiana e sem metástases. Os demais marcadores analisados não apresentaram relação significativa e consistente com recorrência ou outros fatores prognósticos. CONCLUSÕES: Nas neoplasias malignas de tireoide, o microambiente imune parece ter uma relação com características patológicas de agressividade. Este estudo mostrou que em carcinoma papilífero de tireoide quando não associado à tireoidite significativa, a densidade do infiltrado tumoral e peritumoral por linfócitos T CD8+ está inversamente relacionada com chance de disseminação metastática linfonodal e, provavelmente, com recidiva da doença, sendo, portanto, um marcador de melhor prognóstico. Este dado sugere que estes linfócitos exercem efeito antitumoral no carcinoma papilífero de tireoide, corroborando a importância da resposta imune na evolução desta neoplasia / INTRODUCTION: Within the last few decades thyroid cancer has the fastest rising incidence rate among all malignancies. In this group of different neoplasms, the papillary carcinoma, one of the well-differentiated carcinomas, represents the great majority and has favorable prognosis, with overall survival rates above 90% in five years. Although several risk classifications based on different prognostic features have been used, they are not accurate to predict which patients will have higher chance of recurrence, lymphatic metastasis and worse outcome, benefiting from more aggressive treatment. It has been described in several kinds of malignancies that tumor related immune infiltration has relation with prognosis and response to treatment. In this study, we characterize the immune microenvironment in papillary thyroid carcinomas, using immunohistochemical markers to inflammatory cells, and relate it with clinical and pathological prognostic features and with recurrence free survival rates. METHODS: The 151 included cases were selected from a database that included all patients who underwent surgical treatment for thyroid cancer at A.C.Camargo Cancer Center between the years 2008 and 2010. Tumor with significant thyroiditis were excluded. The selected tumors were submitted to immunohistochemical reactions with markers of inflammatory cells and analysis in complete slides by two experienced pathologists. Clinical and pathological features were evaluated, as well as recurrence and survival, relating them with the reading of marked cells. Survival analysis were made using Kaplan-Meier method, comparing survival curves with the Logrank test. RESULTS: One hundred and fifty one patients were included, of which 130 (86.1%) were females and 21 (13.9%) males. Multifocal disease was found in 41 cases (27.2%), extrathyroidal extension in 43 (28.5%) and lymph node metastasis in 36 (23.8%). Only two patients had distant metastasis. The mean follow-up time was 65.1 months and we observed nine (6%) tumor recurrences. Tumors with lymph node metastasis and/or extrathyroidal extension showed significantly higher recurrence rates. Of the analyzed markers, the cases with a higher density of CD8 (which marks cytotoxic T lymphocytes) in peritumoral areas presented a trend to better recurrence-free survival: 97.1% versus 87.5% (p=0.057), in addition to lower rates of mutifocal tumors and lymph node metastasis. A higher infiltration rate of CD8+ T lymphocytes in the tumor also correlated with less risk of lymph node metastasis in this sample (18.4% versus 38.1%, p=0.011). Besides that, the density of this marking both in the tumor and in peritumoral areas, was significantly higher in the papillary carcinomas limited to the thyroid gland (without extrathyroidal extension or metastasis). The other markers analyzed did not presented significant or consistent relation with recurrence or other prognostic factors. CONCLUSIONS: In thyroid cancer, the immune microenvironment seems to relate with pathological features of aggressiveness. This study showed that in papillary thyroid carcinomas without significant thyroiditis, the density of tumoral and peritumoral infiltration by CD8+ T lymphocytes is inversely related with lymph node metastasis rate and probably with recurrence, being therefore a marker of better prognosis. These data suggest that these lymphocytes play an anti-tumoral role in papillary thyroid carcinoma, supporting the implication of immune response in the progression of this neoplasm

INTRODUÇÃO: O carcinoma ductal in situ da mama é o estágio final antes do carcinoma ductal invasivo (CDI) no processo de carcinogênese mamária. As semelhanças histológicas, moleculares e imunoistoquímicas do epitélio nestas duas lesões tornaram improvável que o epitélio fosse o único responsável pelo processo de invasão estromal. Ao mesmo tempo, foram identificadas importantes alterações nas características do microambiente mamário durante esta transição. As células mioepiteliais, componente do microambiente e cuja rotura determina o diagnóstico histológico do carcinoma invasivo, tem papel direto ou indireto neste processo. A fim de predizer esse risco de invasão, propomos que as características das células mioepiteliais sejam investigadas em conjunto com as características intrínsecas do epitélio neoplásico. OBJETIVOS: Determinar os fatores morfológicos e moleculares das células epiteliais e os marcadores das células mioepiteliais do microambiente em carcinomas ductais in situ da mama relacionados ao risco de invasão estromal. MÉTODOS: Foram selecionados retrospectivamente 236 casos consecutivos com diagnóstico inicial de CDIS seguidos de ressecção cirúrgica na Divisão de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo no período de janeiro de 2000 a dezembro de 2009, divididos nos grupos 1 (CDIS puro, 90 casos) e 2 (CDIS associado a carcinoma invasor, 146 casos). Blocos de microarranjos de tecido foram construídos com áreas representativas dos CDIS e CDI que foram, então, classificados nos perfis moleculares de acordo com o seu perfil imunoistoquímico. Os marcadores mioepiteliais (vimentina, AML, calponina, p63, CK5/6, SMMHC, CD10) foram avaliados de acordo com a expressão imunoistoquímica baixa ou alta. RESULTADOS: Os perfis moleculares dos componentes in situ e invasivo da mesma lesão foram semelhantes. Os CDIS de baixo grau histológico, em comparação aos CDIS de alto grau, apresentaram maior número de casos com perfil molecular luminal (143 vs. 18) e menor proporção de casos luminal/HER2-positivo (6 vs. 11), HER2 (4 vs. 27) e triplo-negativo (3 vs. 22). Os CDIS no grupo 1, em relação aos CDIS no grupo 2, tiveram maior proporção de casos com expressão de receptores hormonais (84.4% vs. 71,2%) menor expressão de HER2 (76,7% vs. 81,5%), mais perfis moleculares luminal/HER2-positivo (12,2% vs. 4,1%) e menos perfis triplo-negativos (4,4% vs. 14,4%). A expressão de CK5/6 nas células epiteliais do CDIS teve maior proporção entre o subtipo HER2 (34,5%), seguido pelo triplo-negativo (25%), luminal/HER2- negativo (15,4%) e luminal/HER2-positivo (12,5%). A expressão de CK5/6 foi maior nas células epiteliais dos CDIS do grupo 1 em relação aos CDIS do grupo 2 (30,6% vs. 11,3%). A expressão alta de SMMHC nas células mioepiteliais associou-se mais frequentemente aos CDIS do grupo 1 (88,2%) em relação aos CDIS do grupo 2 (11,8%), e esta diferença manteve-se tanto nos CDIS de baixo grau (85,7%) quanto nos de alto grau histológico (92,3%). A expressão baixa de CD10 nas células mioepiteliais associou-se mais frequentemente aos CDIS do grupo 2 (95,6%) em relação aos CDIS do grupo 1 (4,4%), e esta diferença manteve-se tanto nos CDIS de baixo grau (96,4%) quanto nos de alto grau histológico (94,1%). Não houve diferença na expressão de marcadores mioepiteliais de acordo com o perfil molecular baseado na imunoistoquímica. CONCLUSÕES: O risco de invasão estromal em CDIS está associado ao perfil molecular triplo-negativo e à perda de expressão do marcador CD10 pelas células mioepiteliais e é inversamente proporcional à expressão de CK5/6 pelas células neoplásicas e à forte expressão do marcador SMMHC nas células mioepiteliais / INTRODUCTION: Ductal carcinoma in situ is the last step preceding invasive ductal carcinoma in breast carcinogenesis. Histologic, molecular and immunohistochemistry similarities in epithelium of these components make improbable that epithelial changes are sole responsible for the stromal invasion. At the same time important changes were identified in mammary microenvironment during this transition. Myoepithelial cells, components of microenvironment and which rupture is the histological definition of stromal invasion, have a direct or indirect role in this process. We propose an associated investigation of myoepithelial cells and intrinsic neoplastic epithelium caracteristics in view of predict the risk of stromal invasion. OBJECTIVES: To determinate morphologic and molecular factors of epithelial cells and microenvironment myoepithelial cell markers related to stromal invasion risk in ductal carcinomas in situ of the breast. METHODS: 236 cases with initial diagnosis of DCIS followed by surgical ressection were retrospectively selected from Division of Surgical Pathology, Faculty of Medicine, Sao Paulo University from january 2000 to december 2009, divided in groups 1 (pure DCIS, 90 cases) and 2 (DCIS associated with invasive carcinoma, 146 cases). Tissue microarrays were constructed with selected areas of DCIS and IDC and those were then classificated in molecular subgroups according to its immunohistochemistry profile. Myoepithelial markers (vimentin, smooth muscle actin, calponin, p63, CK5/6, SMMHC, CD10) were avaliated according to its high or low immunohistochemistry expression. RESULTS: Molecular profiles of in situ and invasive components of the same tumor were similar. Low-grade DCIS showed more luminal profiles than highgrade DCIS (143 vs. 18), and less luminal/HER2-positive (6 vs. 11), HER2 (4 vs. 27) and triple-negative (3 vs. 22) profiles. Group 1 DCIS, compared to group 2 DCIS, showed more cases with hormonal receptor expression (84.4% vs. 71.2%), less expression of HER2 (76.7% vs. 81.5%), more luminal/HER2-positive (12.2% vs. 4.1%) and less triple-negative profiles (4.4% vs. 14.4%). CK5/6 expression in epithelial cells was more frequent in HER2 (34.5%) subtype followed by triple-negative (25%), luminal/HER2-negative (15.4%) and luminal/HER2-positive (12.5%). Epithelial cells in group 1 DCIS showed more CK5/6 expression than cells in group 2 DCIS (30.6% vs. 11.3%). High expression of SMMHC in myoepithelial cells was more frequent in group 1 DCIS (88.2%) than group 2 DCIS (11.8%) and this pattern was also mantained in low-grade DCIS (85.7%) and high-grade DCIS (92.3%). Low expression of CD10 in myoepithelial cells was more frequent in group 2 DCIS (95.6%) than group 1 DCIS (4.4%) and this pattern was also mantained in low-grade (96.4%) and high-grade DCIS (94.1%). There was no significant difference in expression of myoepithelial cells according to molecular profile classified by immunohistochemistry. CONCLUSIONS: Stromal invasion risk in DCIS is associated with triple-negative profile, CD10 expression loss in myoepithelial cells and inversely correlated with CK5/6 expression in neoplastic cells and high expression of SMMHC in myoepithelial cells