Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 italo.pdf: 843750 bytes, checksum: 971dc2983746976f9e3b4bd789755fb5 (MD5) Previous issue date: 2010-03-04 / Yeasts were isolated from different Amazon habitat: beetles gut (Carabidae), midgut and hindgut of Nasutitermes sp., soil samples from savanna (Boa Vista city, Roraima state) and Amazon rain forest. The yeasts were selected according to the capability of metabolize sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate (HACA) as one carbon source, assimilate and fermenting D-xylose. To selective medium preparation, HACA was diluted until reducing sugar concentration was 1% and supplemented with Yeast Nitrogen Base (YNB 6,7 g/L) and Agar (20 g/L). Xylose assimilating ability was investigated using replica-plating, as described by Barnett et al. (1990), using D-xylose (50 mM), YNB (6,7 g/L) and Agar (20 g/L). Fermenting capability was evaluated using flasks with 10 mL of YUKX medium (Yeast extract 1,5 g/L; Urea 1,25 g/L; KH2PO4 1,1 g/L and D-xylose 50 g/L), containing a Durham tube. Another fermentation test was performed using Falcon® tubes (50 mL) with 10 mL of YUKX, sealed with rubber stopper. A valve allowed CO2 liberation as fermentative evidence. A number of 76 colonies were isolated (2 from savanna, 8 from rain forest, 12 from Carabidae and 54 from Nasutitermes sp.), among these were detected 28 that have ability to growth on D-xylose as unique carbon source and 3 were able to ferment that sugar. These results agree with Breznak (1982) and Blackwell et al. (2004), which consider that insect gut (as termites and beetle) is a rich source of microorganisms that metabolize hemicelluloses for biotechnology purpose. Three D-xylose fermenting strains isolated from Amazon insects (LC27, IB04 and IB09) were cultivated at HACA and YUKX medium. The cell growth and sugar consumption were evaluated using OD600 and DNS methods, respectively. Thermo tolerance and ethanol tolerance were investigated using heat-shock (52 ºC, 9 minutes) and ethanol-shock (YPD + 20% ethanol during one week), evaluating cell viability. A fermenting assay was performed, monitoring CO2 releasing to estimate ethanol production. Sugar consumption was 78,3% at HACA medium, while at YUKX was 55,9%. Both strains are able to do hemicellulosic hydrolysate saccharification, raising reducing sugar from 42,5 g/L up to 63 g/L. The cell viability after heat-shock was upper 85% for IB04 and IB09 strains, but LC27 had a cell-viability lower than 40%. The cultivation after ethanol shock shows tolerance by all tested strains. The fermenting assay allows estimate low ethanol yield, average about 3,34 g/L. These results indicate potential for biotechnological using of hemicellulosic derived. / Foram isoladas leveduras a partir de diferentes habitats amazônicos, a saber, intestino de besouros da família Carabidae, conteúdo abdominal de cupins (Nasutitermes sp.), amostras de solos coletados em áreas de savanas (formação geomorfológica Boa Vista RR) e em matas de terra firme (Manaus AM). As leveduras foram isoladas segundo a capacidade de crescer invitro usando hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar (HACA) como fonte única de carbono, sendo selecionadas aquelas que fossem capazes de assimilar e fermentar D-xilose. Para tanto se utilizou meio de cultura composto por hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar (concentração de açúcar redutor total ajustada para 1%), suplementado por Yeast Nitrogen Base (YNB 6,7 g/L) e Agar (20 g/L). A capacidade de assimilar D-xilose foi atestada pela técnica replica-plating, descrita por Barnett et al. (1990), cultivando as colônias isoladas em placas de Petri contendo D-xilose (50 mM), YNB (6,7 g/L) e Agar (20 g/L). A capacidade fermentativa foi testada em tubos de ensaio contendo meio YUKX líquido, composto por extrato de leveduras (1,5 g/L), uréia (1,25 g/L), KH2PO4 (1,1 g/L) e D-xilose (50 g/L). Em cada tubo de ensaio foi adicionado um tubo de Durham para retenção de gás liberado pela fermentação. Outro teste qualitativo de fermentação foi efetuado, cultivando as leveduras em tubos Falcon® de 50 mL contendo 10 mL de YUKX. Os tubos foram vedados com rolhas de borracha contendo um orifício fechado por uma mangueira. Após sete dias de cultivo, a mangueira foi aberta dentro de uma coluna de água, para evidenciar o desprendimento de gás pela atividade fermentativa. Foram isoladas ao todo 76 colônias de leveduras, sendo duas associadas a solos de savana, oito associadas a solos de florestas de terra firme, 12 associadas a besouros da familia Carabidae e 54 associadas à Nasutitermes sp. Dentre estas, 28 foram capazes de assimilar D-xilose e três capazes de fermentar o referido açúcar, sendo duas associadas à Carabidae e uma a Nasutitermes sp. Estes resultados concordam com o que foi escrito anteriormente por Breznak (1982) e Blackwell (2004), os quais consideram que o trato digestivo de insetos xilófagos é uma rica fonte de microrganismos de interesse biotecnológico. As três linhagens de leveduras, fermentadoras de D-xilose (LC27, IB04 e IB09) foram cultivadas em YUKX e em HACA, a fim de caracterizá-las quanto ao crescimento celular (mensurando a densidade ótica / λ = 600 nm) e o consumo de açúcar redutor (quantificado pelo método DNS). O ensaio em fermentômetro foi executado para avaliação da perda de massa por desprendimento de CO2 a fim de se estimar a produtividade de etanol. Avaliou-se ainda a termotolerância (choque térmico a 52 ºC por 9 minutos) e tolerância ao etanol (cultivo estacionário por 7 dias em YPD + 20% etanol). Todos os experimentos foram feitos em duplicata, com pH inicial 5,5 e temperatura a 35 ºC. O consumo de açúcar redutor total em HACA foi em média de 78,3%, enquanto que em YUKX o consumo médio foi de 55,9%. Quando cultivadas em HACA, as linhagens demonstraram ainda potencial de sacarificação, elevando a concentração de ART em até 48% durante as primeiras 8 horas de cultivo. As linhagens IB04 e IB09 são termotolerantes, apresentando viabilidade celular superior a 85%, enquanto que LC27 esses valores foram inferiores a 40%. O teste de tolerância ao etanol demonstrou resistência pelas três linhagens, com média de 81 unidades formadoras de colônia nas primeiras 24 horas, tornando-se incontáveis a partir das 48 horas. A evolução de CO2 (valor médio de 3,2 g/L) permite estimar produção de etanol, mas com baixo rendimento, com estimativa de 3,34g/L. Todas apresentam potencial para utilização em processos biotecnológicos usando hidrolisado hemicelulósico como substrato.