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El principal objetivo de la Tesis Doctoral es el estudio en profundidad de poblaciones de Pseudomonas presentes en el ambiente. Para ello se ha realizado una prospección de los aislamientos de Pseudomonas procedentes de diversos hábitats. Se han analizado muestras en suelos agrícolas, arenas de la zona intermareal, aguas freáticas y aguas de ríos. Los aislados de Pseudomonas aeruginosa procedentes de muestras ambientales, se han comparado con los aislados clínicos procedentes del Hospital Universitario Son Dureta. Se han aplicado distintas metodologías en el análisis de estos estudios. Métodos dependientes de cultivo, basados en metodología tradicional, y métodos independientes de cultivo basados en nuevos métodos moleculares. Estos últimos incluyen: tipado de secuencias multilocus, secuenciación con cebadores específicos y análisis de DNA total procedente de muestras ambientales por clonación y pirosecuenciación con cebadores específicos. Esta última metodología se ha aplicado por primera vez en muestras ambientales de la manera realizada en esta Tesis. La genómica comparativa se ha aplicado para evaluar la diversidad intraclonal. Se ha estimado el potencial de nuevas metodologías moleculares como la clonación, pirosecuenciación, y estudio de genomas, aplicándolo al análisis de la diversidad de las especies de Pseudomonas. Los datos obtenidos nos permiten tener una amplia perspectiva de estos métodos aplicados a la ecología y taxonomía del género Pseudomonas. En el primer capítulo, se ha analizado la estructura y microdiversidad de 53 aislamientos de muestras ambientales y clínicas de Mallorca (España), mediante el análisis de secuencias multilocus (MLST). Patrones de multiresistencia a distintos antibióticos, solo se hallaron en aislamientos de origen clínico. El elevado número de nuevos alelos y secuencias tipo, halladas en una misma área, refleja la gran diversidad de las poblaciones de P. aeruginosa. A todo ello deben sumarse los índices de diversidad que también indicaron la alta diversidad de la población estudiada. Los tests de clonalidad demostraron que la recombinación juega un papel esencial en la distribución de los alelos. La secuencia tipo ST-1146 fué la única secuencia hallada en los dos tipos de muestras, tres aislamientos en muestras ambientales y un aislado clínico con distinto perfil de resistencia a antibióticos. En el segundo capítulo, los cuatro genomas de los aislados ST-1146 fueron secuenciados y ensamblados de novo. Los resultados indicaron que el número de genes propios del aislado clínico (SD9) era superior al de los aislados de origen ambiental (P37, P47 y P49). Genes relacionados con el bacteriófago Pf1 y otros relacionados con los bacteriófagos F116 y H66 solo se hallaron en SD9 pero no en las otras cepas del ST-1146 de origen ambiental. Los genes relacionados con el bacteriófago Pf1 de SD9 presentaron un elevado número de mutaciones respecto a los aislados de origen ambiental. La comparación genómica demostró que los aislados ST-1146 están estrechamente relacionados y los genes relacionados con la patogenicidad estudiados estaban conservados. El número de alelos exclusivos de SD9 fue 2,5 y 3,6 veces superior a los aislados de origen ambiental, al compararse todos ellos con los genomas de referencia de las cepas P. aeruginosa PAO1-UW y UCBPP-PA14. En el tercer capítulo, el río Woluwe se tomó como hábitat modelo para el estudio de la diversidad de las especies del género Pseudomonas. Una muestra de agua no contaminada se analizó por métodos dependientes e independientes de cultivo. La identificación de los aislados de Pseudomonas se analizó por secuenciación y análisis de los cebadores del gen rpoD. Los métodos independientes de cultivo se basaron en la clonación y pirosecuenciación del amplicón del gen rpoD obtenido con los cebadores selectivos para dicho gen en Pseudomonas: PsEG30F-PsEG790R. Cabe destacar el elevado número de cepas de Pseudomonas obtenidas en las muestras por los tres métodos de análisis: 26 especies distribuidas en 13 grupos o subgrupos filogenéticos. La pirosecuenciación ha sido el mejor método de los utilizados; las secuencias obtenidas correspondieron a 24 de las especies totales observadas, con la excepción de P. stutzeri y P. simiae. El grupo filogenético predominante fue Pseudomonas fluorescens. En todos los métodos de análisis se halló un gran número de posibles nuevas especies indicando una enorme diversidad del género, no descrita hasta el momento. En el cuarto capítulo, se aislaron cepas de Pseudomonas de muestras ambientales procedentes de suelos y zonas intermareales. En el proceso de identificación algunos de estos aislamientos no han podido ser asignados a especies conocidas de Pseudomonas considerándose como posibles nuevas especies. En el análisis de secuencias multilocus se incluyeron cepas procedentes de nuestra colección del laboratorio de Microbiología de la “Universitat de les Illes Baleares”. El análisis de secuencias multilocus demostró que varios aislados podrían corresponder a 3 nuevas especies (6, 5 y 1 aislados de cada especie). La confirmación de estos resultados requerirá posteriores análisis. Otros cuatro aislados fueron estudiados mediante su caracterización morfológica, fisiológica, bioquímica, quimiotaxonómica y genómica. Estos estudios demostraron que los aislados no podían ser asignados a ninguna especie conocida de Pseudomonas por lo que se han propuesto dos cepas nuevas: Pseudomonas aestusnigri (cepa VGXO14T = CECT 8317 T = CCUG 64165 T) y Pseudomonas terricola (cepa S58 T = CECT 8389 T = CCUG 64415 T). / The main goal of the present work is a thorough study of the diversity of Pseudomonas populations present in several habitats. In chapter one, the population structure and microdiversity of 53 Pseudomonas aeruginosa isolates from environmental samples and clinical specimens obtained in Mallorca (Spain) has been analyzed by a multilocus sequence typing approach (MLST). Antibiotic multiresistance to several antibiotics was only found in isolates of clinical origin. The high number of new alleles and new sequence types found in a limited area reflects the great diversity of P. aeruginosa populations and the high plasticity of a paradoxically phylogenetic conserved genome of P. aeruginosa. The calculated genetic diversity index also demonstrated the high diversity of the population under study. Clonality tests demonstrated that recombination plays a key role in the distribution of alleles. The ST-1146 was the only one found in both kind of samples, 3 environmental isolates (from the same site isolated at 2 different dates) and 1 clinical isolate, with differences in its antibiotic susceptibility profile. For this reason, the 4 genomes of newly described sequence type ST-1146 have been sequenced and analyzed. In the second chapter, the four genomes of ST-1146 were obtained and the sequences assembled de novo and compared with the CD-HIT program. Results showed that the number of isolate-specific genes was higher in the clinical isolate (SD9) than in environmental isolates (P37, P47 and P49). Some genes related to phage Pf1 and to other phages similar to bacteriophages F116 and H66 were found in isolate SD9 but not in the other isolates of ST-1146. The bacteriophage Pf1 region in isolate SD9 accumulated the highest number of mutations in comparison with the environmental isolates. Comparative genomic methods indicated that the isolates of ST-1146 are closely related, and most genes implicated in pathogenicity are highly conserved in the environmental isolates, suggesting the genetic potential for infectivity similar to that of the clinical isolate. Moreover, the four genomes were mapped against the reference genomes of P. aeruginosa PAO1-UW and UCBPP-PA14. A mutational profile was performed as a result of each comparison. The clinical isolate showed in both comparisons a number of exclusive alleles 2.5 and 3.6 times greater than the environmental isolates. These results suggest that the mutation pressure is not the same in the environmental isolates than in the clinical one. In the third chapter, the River Woluwe has been taken as a model habitat for the study of the diversity of species in the genus Pseudomonas. A water sample from a non-contaminated site at the source of the river was analyzed by culture-dependent and –independent methods. Identification of the Pseudomonas isolates was performed by sequencing and analysis of their rpoD sequence. Culture-independent methods consisted of a cloning and pyrosequencing of a specific rpoD amplicon obtained from total DNA extracted from the same sample and amplified by Pseudomonas rpoD primer set EGPsF340-EGPsR 780. It was remarkable the number of known species detected in the sample by the three different methods: 26 species distributed in 13 phylogenetic groups or subgroups within the genus. Pyrosequencing was the more powerful analysis; sequences obtained represented the 24 species with the exception of P. stutzeri and P. simiae. The predominant phylogenetic group within the Pseudomonas genus was Pseudomonas fluorescens group in the cultures and in the culture-independent analysis. In all analysis a high number of putative novel species were found indicating the enormous diversity not described yet. In the fourth chapter, several Pseudomonas strains have been isolated from environmental samples, from soil and intertidal habitats. In the identification process, some of these strains have not been assigned to known Pseudomonas species and were considered members of putative novel species. In their phylogenetic characterization by MLSA we found that strains in the culture collection of our laboratory were close-related and therefore they were also included in the taxonomic characterization of these putative novel species. MLSA demonstrated that 3 putative novel species were represented by 6, 5 and 1 strains respectively, which will be the subject of additional studies. Four other strains were deeply studied by a taxonomic polyphasic approach, including morphological, physiological, biochemical, chemotaxonomic and genomic characterizations. These studies demonstrated that the four strains cannot be assigned to any of the known Pseudomonas species and we propose the creation of two novel species, Pseudomonas aestusnigri (strain VGXO14T = CECT 8317 T = CCUG 64165 T) and Pseudomonas terricola (strain S58 T = CECT 8389 T = CCUG 64415 T).

En esta Tesis Doctoral, hemos caracterizado el papel de un conjunto de estructuras de la superficie de Haemophilus influenzae (HiNT) como factores de virulencia implicados a distintos niveles del proceso infeccioso, mediante el empleo de mutantes generados en el laboratorio y de aislados clínicos. Hemos analizado la heterogeneidad fenotípica de aislados clínicos de HiNT respecto a su resistencia al ataque bactericida de péptidos antimicrobianos, a su interacción con superficies abióticas y epiteliales, y a mecanismos moleculares de subversión del epitelio respiratorio empleados por el patógeno durante los procesos de adhesión e invasión epitelial. Asimismo, el análisis de este repertorio de fenotipos asociados a virulencia en una batería de cepas mutantes que carecen de estructuras superficiales del patógeno, incluyendo modificaciones del lipopolisacárido y adhesinas de naturaleza proteíca, nos ha permitido establecer una asociación directa entre moléculas bacterianas y elementos de la inmunidad innata del hospedador. Por otra parte, hemos diseccionado la implicación de un conjunto de moléculas eucariotas en la invasión del epitelio respiratorio humano por HiNT, mediante la infección de células epiteliales humanas en cultivo en combinación con la interferencia de moléculas eucariotas ad hoc. Mediante esta disección, presentamos un modelo que integra un conjunto de eventos moleculares, incluyendo receptores y elementos de cascadas de señalización eucariota con un papel esencial en la invasión epitelial por este patógeno respiratorio. En conjunto, la identificación de moléculas, tanto bacterianas como celulares, implicadas en la infección por HiNT nos ha permitido ampliar nuestro conocimiento sobre la patogénesis de HiNT, así como la identificación de potenciales dianas terapeúticas para combatir la infección por este patógeno respiratorio.

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OBJECTIVE: To analyze the effect of environmental surfaces and non-critical health products contamination for Staphylococcus spp. for the safety of dressing rooms workers and users in primary health care. METHODOLOGY: Cross-sectional study of microbiological nature, conducted from July to November 2013 in dressing rooms references in the treatment of chronic wounds of primary health care in Goiás, Brazil. Approved by the Federal University of Goiás Research Ethics Committee (protocol 178/2012). It is began collecting direct observation of ambience processing. Then, have been done the interview, guided by semistructured instrument. The specimens collection from environmental surfaces and noncritical health products was performed using a sterile swab, rubbed on the research site and sent to the laboratory for processing. The microbiological procedures were performed according to standard methodologies. Was used SPSS 19.0 (Statistical Package for Social Sciences for Windows®) and the data were analyzed using descriptive statistical procedures. RESULTS: 38 articles were analyzed, including 32 environmental surfaces and six noncritical health products. It was found at the microbiological testing seven (18.4%) environmental surfaces and products were contaminated by Staphylococcus spp. Eight bacteria were isolated, which of seven (87.5%) were identified as coagulase negative Staphylococcus (CoNS) and one (12.5%), as S. aureus. Staphylococcus spp. were resistant to penicillin G (87.5%) and CoNS, presented a constitutive resistance to macrolidelincosamide-streptogramin B group (MLSBc) (28.6%) and resistance to oxacillin (42.9%). All micro-organisms were resistant to at least one antimicrobial agent. Of the three units investigated, the process of cleaning and disinfection was done by 91.7% of the 12 workers in the study. Nonetheless, was at unconformity with current guidelines. CONCLUSION: The results demonstrate the presence of multidrugresistant pathogens in the ambience of the dressing rooms, which denotes failure in articles processing. These failures may be due to lack of supervision and/or the worker unpreparedness to perform the procedure. Also exposes workers and service users at risk for colonization and eventual infection by these bacterias. This situation benefits cross-contamination and spread of multiresistant microorganisms in primary health care. / INTRODUCCIÓN: Salas de curativo asisten a usuarios portadores de heridas crónicas colonizadas e infectadas y el ambiente puede contaminarse por agentes patógenos presentes en estas lesiones durante la asistencia. La literatura envidencia el papel de las superficies que corroboran la cadena epidemiológica de la infección y se han identificado bajos niveles de higiene ambiental. Este tema ha sido explorado con énfasis en media y alta complejidad. Sin embargo, se percibe que las embestidas dirigidas hacia la atención primaria de salud son escasas. OBJETIVO: Analizar el efecto de contaminación de superficies ambientales y productos de salud no críticos por Staphylococcus spp. para seguridad de trabajadores y usuarios de salas de curativo de la atención primaria de salud. METODOLOGÍA: Estudio transversal de naturaleza microbiológica, realizado entre julio y noviembre de 2013, en salas de curativo referencias en el tratamiento de heridas crónicas de la atención primaria de salud en Goiás, Brasil. Aprobado por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad Federal de Goiás (protocolo 178/2012). Comenzó la obtención de datos por observación directa del procesamiento de ambiente. A continuación, se ha hecho la entrevista, guiada por instrumento semi-estructurado. La recolección de espécimen de superficies ambientales y productos para salud no críticos se realizó con una torunda estéril, frotado en el sitio de investigación y enviado al laboratorio para su procesamiento. Los procedimientos microbiológicos se realizaron de acuerdo con metodologías estandarizadas. Se utilizó el programa SPSS 19.0 (Statistical Package for Social Sciences para Windows®) y los datos se analizaron mediante procedimientos estadísticos descriptivos. RESULTADOS: Se analizaron 38 artefactos, incluyendo 32 superficies ambientales y seis productos para salud no críticos. Se encontró, en las pruebas microbiológicas, siete (18,4%) de las superficies ambientales y de los productos estaban contaminados por Staphylococcus spp. Se aislaron ocho bacterias, de cuales siete (87,5%) fueron identificadas como Staphylococcus coagulasa negativo (CoNS) y uno (12,5%) como S. aureus. Staphylococcus spp. eran resistentes a penicilina G (87,5%) y los CoNS, presentarón resistencia constitutiva a el grupo macrólidos, lincosamidas, estreptogramina B (MLSBc) (28,6%) y resistencia a oxacilina (42,9%). De las tres unidades investigadas, el proceso de limpieza y desinfección se realizaba por 91,7% de los 12 trabajadores en el estudio. Sin embargo, estaba en desacuerdo con las directrices actuales. CONCLUSIÓN: Los resultados demuestran la presencia de patógenos resistentes a múltiples fármacos en el ambiente de salas de curativo, que denota el fracaso en el procesamiento de los artefactos. Estas fallas pueden deberse a falta de supervisión y falta de preparación del trabajador para realizar el procedimiento. Además expone a los trabajadores y usuarios del servicio en situación de riesgo para la colonización y la infección posterior por estas bacterias. Esta situación promueve la contaminación cruzada y propagación de microorganismos multirresistentes en la atención primaria de salud. / INTRODUÇÃO: Salas de curativo atendem usuários portadores de feridas crônicas colonizadas e infectadas e a ambiência pode ser contaminada por patógenos presentes nessas lesões durante a assistência. A literatura evidencia o papel das superfícies corroborando a cadeia epidemiológica da infecção e tem identificado baixos padrões de higiene ambiental. Essa temática tem sido explorada com maior ênfase nos serviços de média e alta complexidade. Entretanto, percebe-se que os investimentos direcionados para a atenção primária à saúde são escassos. OBJETIVO: Analisar as repercussões da contaminação de superfícies ambientais e produtos para saúde não críticos por Staphylococcus spp. para a segurança de trabalhadores e usuários de salas de curativo da atenção primária à saúde. MÉTODOLOGIA: Estudo do tipo transversal de natureza microbiológica, realizado de julho a novembro de 2013 em salas de curativo referências em tratamento de feridas crônicas da atenção primária à saúde em Goiás, Brasil. Aprovado em Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás (protocolo 178/2012). Iniciou-se a coleta com observação direta do processamento da ambiência. Em seguida, realizou-se a entrevista, norteada por formulário semiestruturado. A coleta dos espécimes de superfícies ambientais e de produtos para saúde não críticos foi realizada por meio swab estéril, friccionado sobre o sítio de investigação e enviado ao laboratório para processamento. Os procedimentos microbiológicos foram realizados conforme metodologias padronizadas. Utilizou-se o SPSS 19.0 (Statistical Package for the Social Sciences for Windows®) e os dados foram analisados mediante procedimentos de estatística descritiva. RESULTADOS: Foram analisados 38 artefatos, sendo 32 superfícies ambientais e seis produtos para saúde não críticos. Verificou-se, à análise microbiológica, que sete (18,4%) das superfícies ambientais e dos produtos estavam contaminadas por Staphylococcus spp. Foram isoladas oito bactérias, das quais sete (87,5%) foram identificadas como Staphylococcus coagulase negativos (CoNS) e uma (12,5%), como S. aureus. Os Staphylococcus spp. apresentaram resistência à penicilina G (87,5%) e os CoNS, resistência constitutiva ao grupo macrolídeo, lincosamida, estreptogramina B (MLSBc) (28,6%) e à oxacilina (42,9%). Todos os micro-organismos apresentaram resistência a, pelo menos, um antimicrobiano. Das três unidades pesquisadas, o processo de limpeza e desinfecção era realizado por 91,7% dos 12 trabalhadores do estudo. No entanto, estava em desacordo com as diretrizes vigentes. CONCLUSÃO: Os resultados demonstram presença de patógenos multirresistentes na ambiência das salas de curativo, o que denota falhas no processamento dos artefatos. Essas falhas podem ser decorrentes da falta de supervisão e/ou despreparo do trabalhador para executar o procedimento. Igualmente, expõe trabalhadores e usuários do serviço aos riscos de colonização e eventual infecção por essas bactérias. Essa situação beneficia a contaminação cruzada e disseminação de micro-organismos multirresistentes na atenção primária à saúde.