Lors des deux dernières décennies, Enterococcus faecalis a émergé comme une cause majeure d'infections nosocomiales. E. faecalis est une des rares bactéries presque complètement résistante à l'un des composés les plus importants et les plus répandus du système immunitaire inné : le lysozyme. C'est donc l'étude des causes de cette résistance qui nous a intéressé au cours de ce travail de thèse. Nous avons identifié deux gènes nommés EF0783 et EF1843, potentiellement impliqués dans la résistance au lysozyme. Les protéines codées par ces gènes partagent respectivement des homologies avec une O-acétyltransférase du peptidoglycane (OatA) de Staphylococcus aureus et une N-acétylglucosamine déacétylase (PgdA) de Streptococcus pneumoniae. Nous avons construit les mutants correspondants (DEF0783 et DEF1843) et le double mutant DEF0783-DEF1843. Nous avons montré que la mutation de EF0783 entraînait la perte des groupements O-acétyles du peptidoglycane ainsi qu'une diminution de la résistance au lysozyme. Par contre, aucun effet sur la résistance au lysozyme n'a été associé au gène EF1843. De plus, la délétion de EF0783 et/ou de EF1843 affecte significativement la capacité d'E. faecalis à survivre dans des macrophages murins. Bien que EF0783 soit effectivement impliqué dans la résistance au lysozyme, la Oacétylation et la dé-N-acétylation ne sont pas les principaux mécanismes conférant les hauts niveaux de résistance au lysozyme à E. faecalis. Des expériences pour identifier d'autres facteurs expliquant cette résistance au lysozyme sont à envisager.

Le travail présenté dans cette thèse porte sur l'adaptation bactérienne aux molécules chlorées, tant au niveau des ressources génétiques nécessaires à la mise en place des gênes de dégradation qu'au niveau de la structure de la communauté microbienne observée durant la dégradation de ces composés. La première partie de ce document est une bibliographie qui se focalise sur les mécanismes développés par les bactéries pour répondre aux stress environnementaux, et sur les possibles origines des gènes responsables des premières étapes de dégradation des composés chlorés : les dehalogenases (qui réalisent les étapes de dechloration). Le deuxième chapitre de cette thèse porte sur des essais expérimentaux de remodelage génétique, dans le but de valider les hypothèses présentées lors de la bibliographie quant aux mécanismes qui ont pu conduire à la génération de nouveaux gênes de dégradation. Ces remodelages in vitro et in vivo ont été effectués en utilisant les gènes linB et dhaA. Le chapitre suivant examine la structure de la communauté bactérienne lors de la dégradation réductive du tetrachloroéthylène (PCE). Pour cette étude, des outils de biologie moléculaire, plus spécifiquement des puces phylogénétiques, ont été utilisés pour étudier la structure de la communauté microbienne depuis l'introduction du polluant jusqu'à sa dégradation. Afin d'élucider les fonctions métaboliques qui peuvent être corrélées avec la dégradation du PCE, les résultats des puces phylogénétiques ont été comparés avec un suivi chimique des métabolites de dégradation de ce composé, lors d'une étude en microcosmes. L'objectif du dernier chapitre de la thèse a été de relier la structure de la communauté microbienne avec la cinétique de dégradation des composés chimiques étudiés. Pour cela, une étude globale comportant à la fois un suivi chimique des métabolites de dégradation, une quantification des gènes de dégradation impliqués dans la déchloration réductive du PCE ainsi que l'étude de la structure de la communauté microbienne ont été mis en place. Cette étude a permis de corréler les conditions environnementales nécessaires à la déchloration et la communauté microbienne associée avec l'expression des déhalogénases quantifiées. En résumé, cette thèse explore à la fois les mécanismes mis en place par les bactéries pour dégrader ces composés polluants et la structure de la communauté bactérienne durant la dégradation de ce polluant. Comprendre ces deux étapes dans l'adaptation bactérienne peut contribuer à améliorer l'utilisation des capacités bactériennes utilisées en bioremédiation.

Un modèle a été développé pour prédire l'évolution de contamination de L. monocytogenes, dans de la viande de porc, soumise au procédé de fabrications des lardons. Les expériences ont été réalisées dans de la viande de porc hachée et ionisée (aliment modèle des lardons). Elles ont permis de développer un modèle combiné composé :- d'un modèle de transfert thermique, qui prédit l'évolution de la température ; - de modèles de microbiologie prévisionnelle, prédisant la destruction thermique et la croissance de L. monocytogenes. L'évolution de la température est correctement prédite par le modèle de transfert de chaleur. Le modèle combiné prédit correctement , dans de nombreuses conditions, la destruction thermique de Listeria au cours de l'étuvage, puis sa croissance ou sa survie, en fonction de la température, du pH, de l'a indice w, de la nature et de la concentration en inhibiteur(s). Le modèle combiné prédit également la frontière entre les domaines de croissance et d'absence de croissance

Rim101p est un facteur de transcription qui est activé par cleavage N-terminale à pH alcalin. Il régule ainsi la réponse au pH et joue aussi un rôle majeur dans la pathogenèse de la levure Candida albicans. Mon projet est d'identifier et d'étudier des gènes de surface régulés par Rim101p qui ont une fonction dans l'interaction hôte-levure.<br />Une analyse du transcriptome suite à l'induction d'une forme tronquée et constitutivement active de Rim101p nous avait permis d'identifier et de classer 133 gènes qui semblent être des cibles de Rim101p. Les données des microarrays ont été confirmées pour 20 gènes par PCR quantitative, en utilisant des conditions plus physiologiques. <br />Plusieurs adhésines de la famille des gènes ALS (Agglutinin-Like-Sequence) qui comporte 8 gènes semblent être régulé par Rim101p. Certaines jouent un rôle important dans la formation des biofilms et ainsi dans la virulence de C.albicans. Malgré la grande ressemblance des gènes au niveau de leur séquence nous avons pu confirmer le rôle de Rim101p dans la régulation d'au moins deux gènes ALS (ALS1 et ALS4) dans une analyse de la famille entière en PCR quantitative avec des oligos gène-spécifiques. <br />Pour analyser la régulation de ces gènes au niveau de leur promoteur, des fusions avec le gène rapporteur « LacZ » ont été intégré dans le génome de C. albicans et l'activité de la Β-Galactosidase a été quantifiée en fonction du pH et de la présence ou absence de Rim101p. Nous avons abandonné ce projet car les résultats n'étaient pas reproductibles et cohérents avec les quantifications directes des transcripts. <br />Finalement nous avons utilisé une souche qui porte une version étiquetée de Rim101 avec l'étiquette V5 pour essayer de mettre en évidence par in vivo chromatine immunoprécipitation (ChIP) que les promoteurs sont des cibles directes de Rim101p. Nos résultats indiquaient un enrichissement <br />Dans un dernier projet, nous avons essayé de mettre en évidence par des approches d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) que les promoteurs étient des cibles directes de Rim101p en utilisant une souche qui exprimait une version de Rim101p étiquetée avec l'épitope V5. Nous avons observé un plus grand nombre des promoteurs cibles dans les échantillons pris à pH alcalin que dans ceux pris à pH acides. Toutefois, ces résultats n'étaient pas très solides, car la reproductibilité était faible et nous avons occasionnellement observé un enrichissement similaire pour des promoteurs non-régulés utilisés comme contrôles dans ces expériences.

La géochimie est souvent influencée par l'activité biologique. Des logiciels tels que CHESS et HYTEC modélisent la plupart des processus géochimiques et hydrodynamiques et permettent d'analyser, puis de prédire, l'évolution de systèmes complexes comme les anciens sites miniers. L'objectif est d'étendre ces outils à la prise en compte de l'activité bactérienne. Dans CHESS, la méthode de Newton-Raphson, qui calcule la spéciation géochimique à l'équilibre, a été étendue à la modélisation de systèmes réactionnels composés de cinétiques biologiques (lois de Monod, d'inhibition, thermodynamique). Les autres options de cet outil comme le couplage avec le module de transport (HYTEC) ont été maintenues. L'implémentation du code a été vérifiée par la modélisation de quelques cas tirés de la littérature. L'outil a ensuite été utilisé pour la modélisation d'expériences de dissolution réductives biologiques d'hydroxydes de fer (HFO) riches en As, réalisées au BRGM. La mobilisation non congruente de Fe et As est expliquée par la sorption sur l'HFO et par les réductions biologiques de Fe et As. L'ancien site minier de Carnoulès (Gard, France) a été étudié lors d'expériences, réalisées à l'université de Montpellier, qui retracent l'évolution géochimique de l'eau acide de drainage minier. Leur modélisation prend en compte les oxydations aérobies biologiques de Fe et As et la précipitation d'une phase amorphe de FeIII et d'AsV. Les expériences ont permis de fixer les paramètres thermodynamiques et cinétiques utilisés pour la modélisation à l'échelle du terrain. Au delà de l'étude de l'interface eau-minéral, l'extension des outils CHESS et HYTEC va permettre d'étendre considérablement le champs de leurs applications.

Thèse de doctorat : Pharmacie. Chimie et Microbiologie de l'Eau : Nancy 1 : 2003. / Thèse : 2003NAN12501. Titre provenant de l'écran-titre.

Reproduction de : Habilitation à diriger des recherches : Sciences naturelles. Biologie : Lille 1 : 2006. / N° d'ordre (Lille 1) : 510. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. p. 41-56.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Physiologie, Biologie des organismes, populations, interactions : Lille 2 : 2008. / Résumé en français et en anglais. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 143-175.

Le système Tat (pour Twin Arginine Translocation) exporte des protéines repliées depuis le cytoplasme vers le périplasme des bactéries. L'adressage des protéines à exporter au système Tat repose sur une séquence signal spécifique amino terminale clivée après exportation. Chez le phytopathogène Dickeya dadantii, l'homologue de pectine lyase PnlH possède une séquence signal Tat qui assure son adressage au système Tat mais qui n'est pas clivée après exportation et ancre la protéine dans la membrane externe. Chez les protéobactéries, la majorité des protéines de membrane externe sont soit des lipoprotéines soit des protéines intégrales de membrane en tonneau β. L'adressage de ces protéines à la membrane externe repose sur des voies spécifiques du type de protéine : la voie Lol pour les lipoprotéines et la combinaison des chaperons périplasmiques SurA, Skp et DegP et du complexe de membrane externe Bam (β barrel assembly machinery) pour les protéines en tonneau β. Au cours de ce travail, l'étude de l'adressage de PnlH à la membrane externe a montré que SurA se liait à la séquence signal hydrophobe de PnlH pour la protéger de l'environnement hydrophile au cours de son transit dans le périplasme. La séquence signal de PnlH (41 acides aminés) porte l'intégralité de l'information nécessaire à son adressage à la membrane externe. La nature de l'information adressant les protéines au système Tat est bien connue et dans ce travail nous nous sommes efforcés d'identifier les informations requises pour les deux dernières étapes de l'adressage de PnlH à la membrane externe : la traversée du périplasme et l'insertion dans la membrane externe. La délétion d'une région conservée comprise entre les résidus 28 et 41 de la séquence signal de PnlH affecte l'adressage de cette dernière à la membrane externe. Des substitutions des acides aminés conservés de cette région ne semblent pas affecter l'adressage de PnlH, indiquant que l'information nécessaire à l'adressage de PnlH à la membrane externe après exportation ne réside pas dans la séquence en acides aminés de la séquence signal de PnlH. En revanche, nos données suggèrent que la présence d'une hélice α hydrophobe dans la séquence signal de PnlH est importante pour son adressage à la membrane externe. Cette observation est particulièrement intéressante puisqu'une telle structure est généralement considérée comme une caractéristique des protéines de membrane interne.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pour sécréter divers facteurs de virulence depuis le périplasme vers le milieu extra-cellulaire. La bactérie phytopathogène Dickeya dadanti (ex. Erwinia chrysanthemi) utilise ce système, appelé Out, pour la sécrétion de pectinases responsable de la maladie de la pourriture molle chez de nombreuses plantes. Les deux composants essentiels du système Out, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD, formant un pore dans la membrane externe, sont impliqués dans la spécificité de sécrétion. L'interaction entre OutC et OutD pourrait assurer l'intégrité structurelle et fonctionnelle du système de sécrétion en reliant les deux membranes. Nous avons entrepris une étude structure-fonction de ces deux composants afin d'identifier et caractériser leurs sites d'interaction et de mieux comprendre leurs rôles. Nous avons appliqué une approche intégrative impliquant une analyse in vivo par cystéine-scanning et pontage disulfure, une analyse in vitro par GST pull down et une analyse structurale d'OutC et OutD et de leurs interactions par RMN. Nos résultats indiquent la présence d'au moins trois sites d'interaction entre les régions périplasmiques d'OutC et d'OutD et suggèrent que ces interactions s'établissent par un mécanisme d'addition des brins β. Nous avons démontré qu'un site situé sur le domaine HR d'OutC pouvait interagir avec deux sites distincts d'OutD suggérant un mode d'interaction alternatif. La présence d'exoprotéines et/ou des composants de membrane interne du système OutE-L-M, modifie différemment l'affinité de ces trois sites d'interaction entre OutC et OutD. Nous proposons que ces interactions alternatives entre divers sites d'OutC et OutD pourraient refléter une succession d'étapes fonctionnelles lors du processus de sécrétion. Pour étudier le mécanisme d'adressage et d'assemblage de la sécrétine OutD dans la membrane externe, nous avons exploité les interactions entre OutD et deux composants auxiliaires du T2SS, la protéine de la membrane interne OutB et la lipoprotéine de la membrane externe OutS. Nous avons montré une interaction directe entre le domaine périplasmique d'OutB et le domaine N0 d'OutD. Une analyse structure-fonction du complexe OutS-OutD a révélé que la pilotine OutS interagit fortement avec 18 résidus à l'extrémité C-terminale de la sécrétine, entraînant la structuration sous forme hélicoïdale de cette région initialement non structurée. Ce travail nous permet de mieux comprendre le mécanisme d'assemblage et de fonctionnement du système de sécrétion de type II.