La contamination microbiologique des systèmes de récolte de l'eau d'érable est une préoccupation majeure de l'industrie acéricole. L'objectif de ce projet était d'identifier et d'estimer l'abondance relative des micro-organismes présents dans la sève à différents moments de la saison de récolte de six régions québécoises. A cette fin, deux méthodes de biologie moléculaire ont été utilisées, soit l'analyse de fragments de restriction terminaux et la création de banques de clones. Les résultats de cette étude ont montré que la diversité microbienne était plus élevée en début de saison (0 et 25 %), puis diminuait à la mi-saison (50 %), pour finalement augmenter à nouveau en fin de saison (75 et 100 %). D'une érablière à l'autre, la composition de la communauté bactérienne de la sève était assez stable. Ainsi, 34 genres ont été recensés dans les banques de clones. Pseudomonas spp. dominaient les échantillons à tous les temps de la saison, suivi de Rahnella spp.

Le microbiote intestinal humain est un important réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques qui demeure toutefois méconnu. Dans cette étude, nous avons exploré les gènes de résistance du microbiote intestinal de participants sains avant et après une exposition à l’antibiotique cefprozil. Trois approches ont été utilisées pour caractériser ces gènes et examiner leur altération par les antimicrobiens : la métagénomique, la culturomique et la sélectomique recombinante. Le séquençage métagénomique et la culturomique ont permis d’identifier plusieurs gènes de résistance aux β-lactamines et à d’autres antibiotiques. Cependant, la culturomique a permis d’identifier ces gènes chez un plus grand nombre de participants. La culturomique a mis en évidence la présence de gènes de résistance à la vancomycine de type vanD dans les microbiotes de 46% des participants comparativement à 8% avec le séquençage métagénomique. La culturomique a aussi montré que l’exposition in vitro et in vivo à une β-lactamine stimule l’émergence des gènes vanD. La sélectomique recombinante, qui repose sur la construction de banques d’expression à partir de l’ADN des bactéries, a été utilisée pour caractériser de manière fonctionnelle les gènes de résistance aux β-lactamines chez les bactéries cultivables de l’intestin. Elle a permis d’identifier et caractériser cinq β-lactamases différentes dont deux montrant une activité à spectre étendu. La majorité des gènes de β-lactamases étaient associés à d’autres gènes de résistance et/ou des éléments mobiles. Ces travaux ont montré que la culture favorise l’identification de gènes non détectés par le séquençage métagénomique et que la sélectomique recombinante est un outil puissant pour caractériser les fonctions des gènes. Cette étude a aussi révélé que la prise d’une β-lactamine communément utilisée peut influencer l’abondance des bactéries qui contiennent des gènes de résistance à un antibiotique d’une autre classe, comme la vancomycine, un antibiotique de dernier recours dans l’arsenal des antimicrobiens. / The human intestinal microbiota is an important and poorly known antibiotic resistance genes reservoir. In this study, we explored resistance genes from the microbiota of healthy volunteers before and after exposure to the β-lactam cefprozil antibiotic. Three approaches were used to characterise resistance genes in the human microbiota and examine alteration by antimicrobials: metagenomics, culturomics and recombinant selectomics. Metagenomic and culturomic sequencing of intestinal microbiota enabled identification of several genes for resistance to β-lactams and other antibiotics. However, culturomics allowed identification of these genes in more participants than metagenomics. Culturomics highlighted the presence of the clinically important vancomycin resistance vanD-like genes in the microbiota of about 46% of participants compared to 8% with metagenomics. Culturomics also showed that in vitro and in vivo β-lactams exposition stimulates the emergence of vanD genes. Recombinant selectomics, which is based on the construction of expression libraries made with bacterial DNA, was also used to functionally characterise β-lactam resistance genes from the cultivable intestinal bacteria. It allowed identification and characterisation of five different β-lactamases including two with an extended-spectrum activity. The majority of β-lactamases genes was associated with other resistance genes and/or mobile elements. This study demonstrated that culture favors the identification of genes undetected by direct metagenomic sequencing and selectomics was a powerful tool to characterise gene functions. It also demonstrated that intake of a commonly used antibiotic of the β-lactam family can influence the abundance of bacteria containing resistance genes to an antibiotic from another class, such as vancomycin, which is a last resort antibiotic.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / La biodiversité des clostridies dans l'écosystème laitier a été étudiée par une approche moléculaire (PCR-DGGE). combinée à des méthodes classiques (dénombrements et analyses chimiques). L'ADN des clostridies s'est avéré être très présent et diversifié sur la ferme. La diversité et la composition taxonomique des communautés ont varié selon les environnements. Tous les ribotypes détectés dans le lait ont également été retrouvés dans un autre environnement. Il apparaît que les facteurs extrinsèques et agronomiques examinés dans cette étude ont contribué à la définition taxonomique d'un réservoir de clostridies. propre à chaque ferme, et dont une partie seulement a été transférée au lait. L'accès des clostridies au lait était limité par des barrières sanitaires et il est apparu que les clostridies devaient posséder certains attributs particuliers pour atteindre le lait et y survivre. L'espèce Clostridium tyrobutyricum a été détectée dans tous les environnements examinés, mais sa distribution a varié selon la ferme. Sa présence dans le lait n'était pas toujours corrélée à sa détection dans l'ensilage.

Les parodontites sont des maladies inflammatoires de nature infectieuse affectant les tissus de soutien de la dent. La présence de bactéries parodontopathogènes dans le sillon gingival représente le facteur étiologique primaire responsable du déclenchement de la parodontite. La réponse immunitaire de l'hôte face à l'agression par ces parodontopathogènes détermine l'évolution de la maladie vers la destruction tissulaire ou la guérison. En effet, la stimulation des cellules immunitaires et mucosales par les bactéries et leurs facteurs de virulence engendre une forte production de médiateurs inflammatoires et de métalloprotéinases matricielles. Ce phénomène a pour conséquence d'activer diverses voies de dégradation tissulaire et osseuse. Le système du complément est l'un des éléments importants de la réaction immunitaire puisqu'il permet l'élimination de microorganismes pathogènes. Pour éviter un effet néfaste du système du complément, les cellules de mammifères expriment à leur surface des protéines régulatrices du complément (CRPs) qui neutralisent les composantes du complément. Le but de cette étude était d'investiguer la capacité des bactéries parodontopathogènes à déjouer le système de défense de l'hôte et/ou de contribuer à l'inflammation et à la destruction tissulaire, en interagissant avec les CRPs. D'une part, nous avons démontré que Porphyromonas gingivalis, une bactérie anaérobie stricte à Gram négatif fortement associée à la parodontite chronique, peut induire le largage de la protéine CD46 de la surface des cellules épithéliales buccales. Une fois détachée des cellules, cette protéine est dégradée par les enzymes protéolytiques sécrétées par P. gingivalis. D'autre part, Fasobacterhim nucleatum, une bactérie cohabitant avec P. gingivalis, a montré une capacité à lier à sa surface la protéine CD46 soluble. F. nucleatum couvert de la protéine CD46 s'est avéré capable d'induire une sécrétion de cytokines proinflammatoires par les cellules épithéliales. Enfin, une stimulation des cellules épithéliales par le lipopolysaccharide des parodontopathogènes a révélé une surexpression des gènes codant pour les CRPs, dont CD46, CD55 et CD59. L'ensemble de ces résultats ont mené à une meilleure compréhension des interactions des interactions des bactéries parodontopathogènes avec le système du complément et des mécanismes contribuant à l'inflammation et à la destruction tissulaire.

Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida est une bactérie à Gram négatif causant la furonculose, une infection opportuniste des salmonidés d'élevage. Les méthodes actuelles de traitement contre la furonculose reposent fortement sur l'antibiothérapie. Cependant, une proportion importante des souches de cet agent pathogène opportuniste des poissons possède des gènes de résistance aux principaux antibiotiques utilisés pour guérir la furonculose. La présente thèse discute en détail de l'importance des interactions hôte-microbiote chez les salmonidés d'élevage et des mesures pouvant améliorer la résistance aux infections chez les salmonidés. Ces mesures peuvent être à large échelle (p. ex. la mise à place d'un système de recirculation de l'eau) ou à petite échelle (p. ex. l'administration de bactéries mutualistes aux poissons). Il y est également illustré comment des symbiontes endogènes de l'Omble de fontaine (ML11A et TM18) et une bactérie à acide lactique exogène (Bactocell) peuvent être mis à profit pour inhiber A. salmonicida subsp. salmonicida, augmenter la croissance et l'immunité innée d'Omble de fontaine et rétablir l'interaction fonctionnelle hôte-microbiote chez l'Omble de fontaine infecté à la furonculose. Lorsqu'ils sont administrés quotidiennement à des alevins vivants d'omble de fontaine, ML11A, TM18 et Bactocell ont contribué à améliorer plusieurs paramètres de leur état physiologique tels que le poids corporel moyen, le facteur de condition de Fulton et l'activité du lysozyme plasmatique (un indicateur de l'activité immunitaire innée). En contexte d'infection expérimentale de furonculose, les Ombles qui ont reçu des doses quotidiennes de TM18 et de Bactocell avaient deux fois moins de mortalité que le groupe témoin « infecté-non traité », mais seulement dans de l'eau à 13,6 °C. Dans l'eau à 15,6 °C, il n'y a pas eu de réduction significative de la mortalité. ML11A n'a pas réduit de manière significative la mortalité à l'une ou l'autre de ces deux températures. L'Omble de fontaine infecté traité avec Bactocell avait un transcriptome microbien intestinal extrêmement différent des poissons non infectés et infectés. Bactocell semble favoriser la restauration de l'expression génique nominale de l'hôte, mais en remodelant le transcriptome microbien intestinal dans un état d'eubiose différent de celui des ombles sains (non infectés). ML11A et TM18 semblent agir selon un mécanisme opposé à celui du Bactocell, c'est-à-dire en modulant l'expression des gènes de l'hôte impliqués dans la réponse à l'infection, sans altérer le transcriptome du microbiote (tous tissus confondus). Des perspectives intéressantes aux travaux de la présente thèse, par exemple combiner des souches probiotiques en un ou plusieurs traitements, vérifier la réactivité croisée de ces derniers avec d'autres traitements (conventionnels ou expérimentaux), considérer l'apport de différentes conditions environnementales sur le système Omble de fontaine - microbiote, sont également explorées. / Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida is a gram-negative bacterium that causes furunculosis, an opportunistic infection of farmed salmonids. Current treatment methods for furunculosis rely heavily on antibiotic therapy. However, a large proportion of strains of this opportunistic pathogen possesses genes for resistance to the main antibiotics used to cure furunculosis. This thesis discusses in detail the importance of host-microbiota interactions in farmed salmonids and discusses measures that can improve resistance to infections in salmonids. These measures can be large-scale (e.g. setting up a water recirculation system) or small-scale (e.g. administering mutualistic bacteria to fish). It is also illustrated how endogenous brook trout symbionts (ML11Aand TM18) and an exogenous lactic acid bacterium (Bactocell) can be used to inhibit A. salmonicida subsp. salmonicida, stimulate the growth and innate immunity of brook trout, and re-establishing the host-microbiota functional interaction in brook trout infected with furunculosis. When administered daily to live brook trout fry, ML11A, TM18 and Bactocell helped improve several parameters of their physiological state such as mean body weight, Fulton condition factor and plasma lysozyme activity (an indicator of innate immune activity). In the context of an experimental furunculosis infection, brook charr that received daily doses of TM18 and Bactocell had twice less mortality than the "infected-untreated" control group, but only in 13.6 °C water. In water at 15.6 °C, there was no significant reduction in mortality. ML11A did not significantly reduce mortality at either of these two temperatures. Infected brook trout treated with Bactocell had an extremely different gut microbial transcriptome from uninfected and infected fish. Bactocell appears to promote the restoration of nominal host gene expression, but by remodeling the gut microbial transcriptome into a different eubiotic state from that of healthy (uninfected) charr. The brook trout probionts ML11A and TM18 appear to act according to a mechanism opposite to that of Bactocell, i.e. by modulating the expression of the host genes involved in the response to infection, without altering the microbiota transcriptome (for all tissues combined). Interesting perspectives for the work of this thesis are also explored like combining probiotic strains in one or more treatments, assessing the cross-reactivity of these with other treatments (conventional or experimental), or considering the contribution of different environmental conditions to the brook charr-microbiota system.

La flore intestinale, composée de l’ensemble des microorganismes retrouvés dans le tractus digestif, joue un rôle essentiel dans le développement et l’homéostasie du système immunitaire. Son altération est associée à de multiples maladies inflammatoires ayant des répercussions non seulement à l’intestin, mais bien dans l’ensemble de l’organisme. Les causes de cette dérégulation restent toutefois méconnues. Parmi les multiples facteurs susceptibles de moduler sa composition, on retrouve plusieurs enzymes bactéricides produites à l’intestin. L’une de ces protéines, la phospholipase A2-IIA sécrétée (sPLA2-IIA), est fortement surexprimée en condition inflammatoire. Nous avons émis l’hypothèse que la surexpression de la sPLA2-IIA à l’intestin au cours de maladies inflammatoires pourrait altérer la composition de la flore intestinale, contribuant ainsi à la physiopathologie de ces maladies. L’utilisation de souris surexprimant la sPLA2-IIA humaine (sPLA2-IIATGN) nous a permis d’observer l’apparition spontanée d’un désordre immunitaire encore jamais caractérisé dans ce modèle. En nous intéressant à l’impact de cette enzyme sur la flore intestinale, nous avons pu identifier plusieurs altérations dans le microbiome de ces souris. Nos résultats suggèrent également que l’environnement, et plus spécifiquement le microbiote intestinal, joue un important rôle dans le développement de ce désordre immunitaire. Nos résultats suggèrent que la modulation de l’inflammation systémique par la sPLA2-IIA est dépendante de la flore intestinale. / The mammalian digestive tract harbors trillions of microorganisms that collectively form the intestinal microbiota. This flora has been shown to play a prominent role in the development and homeostasis of the immune system. As such, its alteration was associated with a wide array of inflammatory diseases with intestinal and systemic afflictions. However, the cause of this unbalance remains poorly understood. While the intestinal flora may be regulated by a large number of environmental factors, multiple endogenous intestinal enzymes have been shown or proposed to play an important part in the shaping of its composition. One of those enzymes, the secreted phospholipase A2-IIA (sPLA2-IIA), possesses great bactericidal properties and is overexpressed during multiple inflammatory disorders. We hypothesized that the overexpression of sPLA2-IIA in the intestine during inflammatory processes could alter the composition of the intestinal microbiota, thereby contributing to the pathophysiology of those diseases. To verify this hypothesis, we used transgenic mice overexpressing the human sPLA2- IIA (sPLA2-IIATGN) and observed a yet uncharacterized spontaneous immune disorder in this model. We aimed to evaluate the impact of sPLA2-IIA on the intestinal flora in this model. We identified multiple alterations in the microbiome of sPLA2-IIATGN mice. Our results also suggest that the environment, and more specifically the intestinal microbiota, play a prominent role in the development of this immune disorder. Our results suggest that the modulation of systemic inflammation by sPLA2-IIA is dependent upon the intestinal flora.

La connaissance du microbiote du lait est importante pour contrôler la qualité microbiologique du lait. Le but de cette étude était d'évaluer la diversité et la dynamique de la communauté microbienne de laits traités et non traités entreposés à basse température par les méthodes d'empreintes moléculaires telles que la banque de clones d'ADNr 16S, la PCR quantitative (qPCR), le polymorphisme des longueurs des fragments de restriction terminaux (T-RFLP) et l'électrophorèse sur gel de gradient dénaturant (DGGE). Des laits crus (UT) ont été traités par addition de gaz carbonique (CO₂), thermisation (TH) ou microfiltration (MF) et ont été entreposés à 4 °C et à 8 °C pendant 7 jours. Les banques de clones ont permis de déterminer la composition de la population bactérienne des laits. Les deux unités taxonomiques opérationnelles (UTOs) les plus abondantes dans la banque de clones appartenaient aux classes Gammaproteobacteria et Bacilli. Les genres bactériens dominants dans les laits traités (UT, CO₂ et TH) ont été affiliés à Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Aerococcus, Facklamia, Corynebacterium, Acinetobacter et Trichococcus. Les bactéries dominantes dans les laits microfiltrés étaient associées à Stenotrophomonas maltophilia et Delftia acidovorans tandis que Staphylococcus aureus dominait dans les laits thermisés. La qPCR a été utilisée pour quantifier les bactéries dominantes dans les laits traités. Pseudomonas fluorescens dominait la population bactérienne dans les laits UT et CO₂ entreposés pendant 7 jours tandis que Streptococcus uberis dominait dans les laits CO₂ entreposés à 8 °C Les profils de PCR-DGGE ont démontré l'effet des traitements (TH, CO₂ et MF) sur les bactéries dominantes des laits traités. Les profils de T-RFLP ont démontré que l'abondance et la diversité de la communauté bactérienne a été affectée par les traitements. Le T-RFLP a démontré la dynamique des bactéries spécifiques dans les laits traités. Ces bactéries pourraient être ainsi utilisées comme marqueur dans les laits traités. Le T-RFLP a une résolution plus élevée que la PCR-DGGE lors de l'analyse des laits traités. Cette étude montre que des bactéries spécifiques peuvent se développer pendant l'entreposage à basse température des laits traités. Les objectifs fixés dans cette étude ont été atteints avec succès en employant des méthodes moléculaires. Ce projet a ainsi mis en évidence le potentiel des méthodes moléculaires dans l'analyse de la population microbienne du lait.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / La fréquentation des spas peut entraîner des infections par les bactéries Legionella (pneumonies sévères) et Pseudomonas aeruginosa (lésions cutanées). Peu de données sont toutefois disponibles sur la contamination microbiologique de ces bassins. Des paramètres microbiologiques et physicochimiques de l'eau de 95 spas du Québec ont été mesurés durant l'été 2008. Les gestionnaires ont aussi répondu à un questionnaire sur leur entretien. Une proportion de 2% des spas était contaminée par Escherichia' coli, 41% par Pseudomonas aeruginosa et 22% par Legionella. Dans 25% des spas, des bactéries ont été détectées en concentrations préoccupantes. Les paramètres physicochimiques s'écartaient fréquemment des valeurs recommandées. Seulement quatre gestionnaires étaient formés (4%). Une bonne filtration, un nettoyage fréquent du spa et une désinfection adéquate limitaient efficacement la contamination microbiologique. Des efforts devraient être faits pour adapter les réglementations aux spas qui abritent un écosystème différent des piscines. Une meilleure formation des gestionnaires est également nécessaire.

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène opportuniste ubiquitaire. Les souches LES (Liverpool Epidemic Strain), associées à des infections pulmonaires chroniques, ont initialement été isolées en 1988 des expectorations de patients souffrant de fibrose kystique. Leurs nombreux facteurs de virulence, comme l'importante production de biofilm, rendent ces bactéries particulièrement difficiles à éradiquer. Des mutants de la souche LESB58, une souche LES, ont été obtenus grâce à la mutagenèse par étiquette. Trois mutants sélectionnés suite à leur avirulence chez le rat, l'amibe et la drosophile ont été obtenus: L70T18G, L138T21T et L155T7T. L'objectif de cette maîtrise est d'établir un lien entre la perte de virulence et les gènes mutés via l'analyse phénotypique des mutants. Une caractérisation des mutants a été réalisée par analyse du biofilm en microfluidique, des tests de détection des lipases, de pigmentation et de prédation en utilisant l'amibe. L'effet de l'ion magnésium (Mg²⁺) sur certains facteurs de virulence a également été mesuré. En microfluidique, la morphologie générale du biofilm attaché varie peu d'une souche à l'autre. L155T7T ne semble pas être capable de produire du biofilm en condition de microfluidique tandis que L138T21T s'établit plus rapidement que la souche sauvage. Un défaut de pigmentation chez la souche L138T21T est observable sur les différents milieux utilisés. Les mutants ne semblent pas présenter de défaut au niveau de leur sécrétion de lipases. De plus, suite à l'ajout de l'ion Mg²⁺, L70T18G, voit sa résistance à la prédation amibienne augmenter tandis que la souche sauvage perd de sa résistance. Chaque mutant présente un profil phénotypique distinct qui suggère que la virulence de la souche LESB58 est une combinaison de différents facteurs. Pour compléter la caractérisation et mieux jauger l'importance relative des différents facteurs de virulence, il serait intéressant d'effectuer d'autres tests comme l'ajout d'ions en microfluidique. / Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous opportunistic pathogen. The LES (Liverpool Epidemic Strain) strains, associated with chronic pulmonary infections, were initially isolated in 1988 from the sputum of patients suffering from cystic fibrosis. Their many virulence factors, such as the high production of biofilm, make these bacteria particularly difficult to eradicate. Mutants of the LESB58 strain, a LES strain, were obtained by signature-tagged mutagenesis. Three mutants selected for their avirulence in rats, amoeba and drosophila were obtained: L70T18G, L138T21T and L155T7T. In order to establish a link between these genes and the loss of virulence of the corresponding mutants, a phenotypic analysis of the mutants constitutes the objective of this project. Characterization of the mutants was performed by microfluidic biofilm analysis as well as lipase detection, pigmentation and amoeba-based predation tests. The effect of the magnesium ion (Mg²⁺) on some virulence factors was also measured. In microfluidics, the general morphology of the attached biofilm slightly varies from one strain to another. L155T7T does not appear to be able to produce biofilm under microfluidic conditions while L138T21T establishes a biofilm faster than the wild strain inside the channels. A pigmentation defect in the L138T21T strain is observable on the various media used. The mutants do not seem to present any defect in their secretion of lipases. Moreover, following the addition of the Mg²⁺ ion, L70T18G sees its resistance to predation by amoebae increased while the wild strain loses resistance. Each mutant exhibits a distinct phenotypic profile which suggests that the virulence of strain LESB58 is a combination of different factors. To complete the characterization and better gauge the relative importance of the different virulence factors, it would be interesting to perform othertests such as the addition of ions in microfluidics.

La bactérie Aeromonas salmonicida utilise le système de sécrétion de type trois (SSTT) pour injecter des effecteurs à l'intérieur des cellules de l'hôte lors de l'infection. L'étude du génome d'A. salmonicida a révélé l'existence d'Ati2, un nouvel effecteur du SSTT. Ce projet avait pour but d'étudier la relation structure-fonction d'Ati2 afin de déterminer son rôle dans la virulence d'A. salmonicida. Des analyses biochimiques et en modélisation moléculaire ont permis de démontrer qu'Ati2 est une inositol polyphosphate 5-phosphatase qui hydrolyse les PtdIns(4,5)P₂ et les PtdIns(3,4,5)P₃. Divers mutants d'Ati2 ont été produits et clones dans des vecteurs d'expression chez l'amibe Dictyostelium discoideum. Les tests d'expression ont démontré qu'Ati2 est toxique pour l'amibe et que cela est lié à son activité catalytique. Ce projet de recherche a ainsi permis de démontrer l'existence d'un nouvel effecteur du SSTT et d'en spécifier la fonction dans la pathogénicité d'A. salmonicida.