La maladie de Parkinson (MP) est marquée par la présence d'une inflammation, pouvant être bénéfique ou délétère à la neurodégénérescence dopaminergique (DAgique). Nous avons adressé la nature des interactions pathologiques entre neurones DAgiques, cellules gliales et leucocytes infiltrant, nécessaire à la mise en place de cette inflammation. Dans un modèle MPTP murin de la MP, les objectifs de ma thèse ont été 1) d'identifier des signaux inflammatoires neuronaux et gliaux, par une approche transcriptomique associée à de la microdissection laser et 2) de déterminer leurs rôles dans la neuroinflammation ainsi que leurs effets sur la perte DAgique. Nous avons retenu parmi les candidats identifiés: les axes CXCL16-CXCR6 et CCL2-CCR2. Nous reportons dans le modèle MPTP, une expression microgliale de CXCL16 ainsi qu'une infiltration de population lymphocytaire CXCR6. Bien que la déplétion de CXCR6 permette de réduire cette infiltration, aucun effet n'est observé sur la perte DAgique. Nous décrivons une infiltration de monocyte CCR2 en concomitance avec une expression astrocytaire précoce de CCL2 dans le modèle MPTP murin, ainsi qu'une expression plus prolongée de CCL2 chez le primate non-humain MPTP, suggérant une relevance de l'axe CCL2-CCR2 dans la MP. En effet nous montrons que des souris surexprimant CCL2, intoxiquées au MPTP, ont non seulement une augmentation accrue de l'infiltrat monocytaire CCR2, mais également de la lésion DAgique. De manière inattendue, nous montrons que la neurotoxicité accrue observée chez des souris CX3CR1-/- MPTP passe indirectement par la voie CCL2-CCR2. Ainsi, nos données supportent l'hypothèse d'une neurotoxicité des monocytes CCR2 dans la MP. / Parkinson's disease (PD) presents signs of neuroinflammation, which can be beneficial or deleterious for dopaminergic (DA) neurodegeneration. We have analyzed the characteristics of such pathological interactions between DA neurons, glial cells and infiltrating immune cells. Using the neurotoxic MPTP mouse model of PD and focusing on chemokines, my thesis objectives were: 1) to identify using laser-microdissection and RNA profiling, the neuronal and glial inflammatory signals in the affected Substantia Nigra (SN) and 2) to assess the role of promising identified chemokine candidates during DA neurodegeneration. We have focused on the lymphocytic CXCL16-CXCR6 and the monocytic CCL2-CCR2 axes. We have found early microglial CXCL16 induction and parallel SN infiltration of CXCR6 lymphocyte subpopulations. CXCR6-deletion reduced infiltration of specific lymphocyte subpopulations, but did not affect the known deleterious infiltration of CD4 T-lymphocytes. For the CCL2-CCR2 axis, we found evidence for limited SN infiltration of CCR2 monocytes, which was preceded by transient astrocytic CCL2 induction in MPTP mice, but a prolonged CCL2 induction in MPTP monkeys, suggesting a potential relevance for human PD. While CCR2-gene deletion did not affect loss of DA neurons, astrocytic CCL2 overexpression increased MPTP induced DA neural loss, revealing the principally neurotoxic nature of infiltrating CCR2 monocytes in a PD-like environment. Unexpectedly, we also found that the known increased DA loss in CX3CR1-KO mice was mediated indirectly via over-induction of the CCL2-CCR2 axis. Combined, our results suggest a potential deleterious role of the CCL2-CCR2 axis in actual human PD.

Le carcinome épidermoïde cutané (CEC) représente un enjeu important par sa fréquence et sa gravité potentielle.L’agressivité de ce cancer est liée à l’invasion péri-nerveuse (IPN), mode d’envahissement tumoral reconnu comme un facteur de mauvais pronostic.L’objectif de ce travail est de s’intéresser aux mécanismes favorisant l’IPN, en comparant 2 groupes appariés de CEC humains, avec et sans IPN.Pour cela nous avons réalisé une étude de facteurs et récepteurs neurotrophiques, de marqueurs de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), et de la molécule NCAM1, par analyse immunohistochimique à partir de pièces chirurgicales de CEC et par analyse moléculaire en droplet digital PCR sur des cellules tumorales microdisséquées.L’analyse immunohistochimique a trouvé une forte expression de BDNF, TrkB, p75NGFR, Snail 1 et NCMA1 dans les cellules tumorales péri-nerveuses, contrastant avec une faible expression de ces marqueurs dans les cellules tumorales à distance du nerf. L’E-cadhérine était diminuée dans les cellules tumorales péri-nerveuses.L’analyse moléculaire en ddPCR montrait une diminution d’expression de l’E-cadhérine et une surexpression de BDNF, TrkB, p75NGFR, Snail1, Slug, Zeb2, Twist1 et NCAM1 dans les cellules tumorales péri-nerveuses par rapport aux cellules tumorales distantes du nerf.Nous avons démontré dans ce travail que l’invasion péri-nerveuse dans les CEC humains est liée aux neurotrophines, à la TEM et implique NCAM1. / Cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) is an important issue because of its frequency and potential severity.The aggressiveness of this cancer is related to perineural invasion (PNI), a mode of tumor dissemination recognized as a poor prognosis factor.The aim of this work is to study the mechanisms of PNI, comparing 2 matched- groups of human SCC with and without PNI.For this, we studied neurotrophins, epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers, and the NCAM1 molecule, by immunohistochemistry analysis on surgical pieces of SCC and by molecular analysis with digital-droplet PCR on laser-microdissected tumor cells.Immunohistochemistry analysis found strong expression of BDNF, TrkB, p75NGFR, Snail 1 and NCMA1 in perineural tumor cells, contrasting with weak expression of these markers in tumor cells distant from the nerves. E-cadherin was decreased in perineural tumor cells.Molecular analysis in ddPCR showed decreased expression for E-cadherin and overexpression of BDNF, TrkB, p75NGFR, Snail1, Slug, Zeb2, Twist1 and NCAM1 in perineural tumor cells compared to tumor cells distant from the nerves.We have demonstrated in this work that PNI in human SCC is linked to neurotrophins and EMT, and involves NCAM1.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la forme la plus fréquente de cancer du foie et l’une des principales causes de mortalité par cancer dans le monde. Il s’agit d’une maladie de mauvais pronostic, aux ressources thérapeutiques limitées, hétérogène sur le plan immunophénotypique et génomique, qui se développe très souvent sur un foie remanié cirrhotique. Les études moléculaires ont révélé plusieurs sous-classes de CHC caractérisés par des signatures génomiques et protéomiques distinctes. Au cours de mon travail de thèse, nous avons contribué à améliorer notre compréhension de la biologie des CHC et des classifications moléculaires en cartographiant le génome non-codant de tumeurs de CHC induites par des virus hépatotropes (VHB, VHC) et en étudiant la sous-classe moléculaire de CHC la plus agressive KRT19-positif. Nous avons établi la première carte de transcriptome à ARN non codants du CHC et révélé une forte activation intra-tumorale des rétrotransposons à LTR, qui sont principalement inhibés dans les cellules hépatiques normales, dans des CHC induits par les VHB et VHC. Certains des transcrits dérivés de LTR se sont révélés être des régulateurs clés de l’expression génique et donc activer la croissance cellulaire. Dans la deuxième étude, nous identifions une nouvelle voie de régulation des CHC KRT19-positif affectant le métabolisme énergétique de ces tumeurs. Les CHC KRT19-positif sont des tumeurs fortement glycolytiques liée à une activation de la réponse à l’hypoxie. L’excès de production par les CHC KRT19-positif de l’oncométabolite 2-hydroxyglutarate en absence de mutation des gènes IDH1 et IDH2 était associé à un profil aberrant hyperméthylé sur la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3) suggérant une répression de la transcription notamment des gènes impliqués dans la différenciation cellulaire. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the main primary liver cancer and one of the most leading cause of cancer-related death worldwide. This heterogeneous disease with a worse prognosis has been subjected of numerous studies aimed to establish global phenotypic profiles. During my thesis, I dedicated my work to improve these classifications by identifying signatures on the non-coding genome and working on a very aggressive form of HCC expressing progenitors markers. With help of a Japanese team, we demonstrated that LTR-derived ncRNAs were active in HCC and that correlation correlates with expression of common cancer markers (GPC3) ans TP53 mutations. This signature can also be used to discriminate HCCs at high risk of recurrence. Finally, we have showed that these LTRs are detectable on prenoplastic stages in the Mdr2 KO mouse model. In parallel, I worked on HCC that expresses progenitor markers such as cytokeratin 19. Using proteomic and transcriptionnal approaches and in silico analyses, we propose that the occurrence of this type of cancer id due to an hypoxic event likely related to trans-arterial chemoembolization. These tumors have a highly glycolytic phenotype with production of an oncometabolite (2-hydroxyglutarate) that has been generally foubd in IDH1/2 mutated cholangiocarcinomas. Finally we suggest the use of metformin, type 2 diabetes drug, to reverse metabolic reprogramming and restore sensitivity to chemotherapy

Durant ma thèse, j’ai étudié dans le bulbe olfactif (BO) de souris adulte, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’apprentissage et de la mémorisation olfactive. Le BO est le premier relai central de l’information olfactive. A ce niveau, des phénomènes de plasticité locaux interviendraient dans la conservation d’une trace mnésique de l’apprentissage. J’ai tout d’abord évalué, dans la couche granulaire, les conséquences d’un apprentissage olfactif associatif sur l’expression de l’IEG Zif268 induite par une stimulation odorante. Les souris ayant une expérience préalable avec l’odorant ne présentent pas d’augmentation de l’expression de Zif268. Cependant, le patron d’expression cellulaire de Zif268 est modifié par l’apprentissage. J’ai ensuite isolé par microdissection laser, à partir des patrons d’expression de Zif268, les populations de cellules de la couche granulaire impliquées dans le traitement de l’odorant suite à l’apprentissage. Dans ces régions, l’étude de l’expression des gènes à large échelle m’a permis de mettre en évidence que la voie des neurotrophines était modulée dans la phase précoce de l’apprentissage alors que les acteurs de la LTP étaient modulés lors de la phase tardive. Enfin, j’ai montré que des souris inactivées pour zif268 présentaient des déficits d’acquisition et de consolidation de l’apprentissage olfactif ainsi que de discrimination d’odorants perceptivement proches. Ces résultats indiquent que l’acquisition par l’odorant d’une signification lors d’un apprentissage olfactif modifie son traitement dans le BO. D’autre part, des acteurs moléculaires potentiellement impliqués dans ces modifications cellulaires ont été identifiés. / My research was about cellular and molecular mechanisms implicated in olfactory learning and memory in the adult mouse olfactory bulb (OB). The OB is the first relay of olfactory information in the central nervous system. At this level, phenomenon of local plasticity could be involved in the conservation of a memory trace associated with learning process. First, I evaluated in the granule cell layer, the consequences of an olfactory associative learning on the IEG Zif268 odour-induced expression. Mice with a prior behavioural experience with the odour do not show increase in Zif268 expression. However, the specific odour-induced Zif268 expression pattern is modified by learning. Then, I isolated using laser capture microdissection activated cell populations of the granule cell layer, based on Zif268 expression patterns, after an olfactory associative learning. In those regions, I studied gene expression at a large scale. I found that neurotrophine pathway was modulated during the early phase of learning process whereas molecular actors of LTP are modulated during the consolidation phase. Finally, I showed that Zif268 knock-out mice exhibit associative learning and memory deficits. Those mice also present deficits to discriminate between closely related odorants. Those results indicate that acquisition by odorant of a behavioural meaning during olfactory learning modify odorant processing at the level of OB. Moreover we identified candidate genes that could be implicated in the cellular modifications.

Les services de Neurochirurgie du Groupement Hospitalier Est de Lyon ont une expérience reconnue pour l’exérèse des tumeurs des régions périventriculaires du système nerveux central notamment au niveau de la région pinéale. Dans ce contexte neurochirurgical favorable et avec l’opportunité d’utiliser des techniques de biologie moléculaire, notre objectif a été l’identification de marqueurs diagnostiques pour chaque type tumoral par une étude transcriptomique en microarray, la caractérisation d’un sous-type de tumeur du parenchyme pinéal (TPP) pléïomorphe, l’évaluation de la synthèse de mélatonine par les TPP et l’étude du transcriptome de certains organes circumventriculaires (OCV) microdisséqués chez le rat. L’analyse du transcriptome des tumeurs périventriculaires a permis de regrouper les tumeurs par leur signature moléculaire et d’identifier des marqueurs diagnostiques pour chaque type tumoral. De nouveaux marqueurs pronostiques potentiels (HoxD13, Prame, CD24 et Pou4f2 et gènes de la voie Aurora kinase B) sont proposés en vue d’améliorer la classification des TPP. Pour ces dernières, une étude multicentrique a permis de caractériser un sous-type tumoral, les tumeurs pléïomorphes, souvent surgradées. L’étude des TPP ex vivo et in vivo montre leur capacité de synthèse de mélatonine. Toutefois, nous n’avons pu obtenir une lignée de cellules tumorales stable. La microdissection des OCV du rat, parfois vestigiaux chez l’homme et qui pourraient être à l’origine de tumeurs périventriculaires, a permis d’étudier leur transcriptome et de mettre en évidence des marqueurs nouveaux ou déjà associés dans la littérature à ces structures / Neurosurgery of periventricular tumors, especially of pineal region tumors, is well developed at the Neurosurgical Hospital in Lyon. Taking opportunity of this background, our objective was identification of new diagnostic markers for each of these tumors using microarray transcriptome analysis, characterisation of a pleomorphic pineal parenchyma tumor (PPT) subtype, evaluation of melatonin synthesis in PPTs and the microarray analysis of molecular signature of some of circumventricular organs (CVO) after their laser microdissection in rat. The microarray analysis of periventricular tumors allowed molecular classification of the tumours and revealed different diagnostic markers for each type of tumors. Potentially new prognostic candidate genes (HoxD13, Prame, CD24 and Pou4f2 and Aurora kinase B pathway genes) are proposed for improvement of PPT classification. A PPT multicenter study allowed the characterisation of a pleomorphic subtype frequently managed as a higher grade tumour in the literature. The study of PPT ex vivo and in vivo showed their preserved capacity for melatonin production. However a stable PPT cell line culture could not be obtained. The laser microdissection of OCV in rat, sometimes vestigial in humans and potentially at the origin of the periventricular tumors, associated with a microarray study highlighted some potentially new or already described specific markers of these structures

L’apport de fer est essentiel pour la plupart des organismes vivants, incluant la majorité des bactéries pathogènes. Cependant, le fer libre est toxique : il est lié à des protéines de stockage et de transport (e.g. ferritine, hémoprotéines…) et voit son homéostasie finement régulée. Afin d’extraire le fer de ces protéines, les bactéries utilisent divers systèmes tels que des protéines de surface ou encore des sidérophores. Bacillus cereus est une bactérie Gram-positive sporulante, pathogène opportuniste chez l’homme, 2ème cause en France de toxi-infection alimentaire collective. Chez B. cereus, la protéine de surface IlsA et le sidérophore bacillibactine (BB) sont impliqués dans l’acquisition du fer de la ferritine exogène et elles sont importantes pour l’infection de l’insecte modèle Galleria mellonella. Mes travaux présentaient deux parties : tout d’abord, l’étude de l’import du complexe BB-Fe3+ dans la cellule par FeuA, protéine de liaison de ce complexe à la surface de la bactérie, souligne le rôle central du couple BB-FeuA. La délétion des gènes codants pour ces deux molécules limite l’acquisition par B. cereus du fer de la ferritine, de l’hème, de l’hémoglobine et du fer inorganique in vitro. En revanche, elle présente un phénotype de virulence in vivo comparable à la souche de référence dans le cas d’injection intra-hémocœlique de larves de G. mellonella. Ce résultat surprenant suggère un probable rétrocontrôle sur l’expression de facteurs de virulence lorsque B. cereus ne produit ni BB ni FeuA, et se trouve par conséquent fortement carencé en fer. Le second volet de mes travaux s’intéresse à l’expression des gènes liés à l’homéostasie du fer in vivo, au cours de l’infection de l’intestin de larves de G. mellonella axéniques. Nous avons choisi une approche de type microgénomique, en prélevant les échantillons par microdissection laser, sur de façon à prélever de petits échantillons dans une zone définie, puis en analysant l’expression de quelques gènes ciblés par RT-qPCR et ddPCR à 3h et 16h post ingestion. Nos résultats montrent que : i) la colonisation intestinale de G. mellonella est impactée lorsque B. cereus est dépourvu du couple BB-FeuA ; ii) ilsA est exprimé lors de l’infection intestinale ; iii) les gènes ciblés impliqués dans l’homéostasie du fer sont activés dès le début de l’infection, suggérant un rôle dans l’adaptation et la pathogénicité ; iv) une faible modulation de l’expression est observée entre les deux temps. Ces travaux ouvrent de nouvelles connaissances fondamentales sur l’homéostasie du fer et des perspectives quant à l’utilisation de nouvelles techniques pour l’étude in situ des interactions hôte-pathogène. / Iron acquisition is essential for most living organisms, including many pathogenic bacteria. However, free iron is toxic: it is bound into storage or transport proteins (e.g. ferritin, hemoproteins…) and iron homeostasis is tightly regulated. To scavenge iron from these sources, bacteria possess several systems to acquire the bound iron, by surface proteins or siderophores. Bacillus cereus is a sporeforming Gram-positive bacterium, opportunistic human pathogen, 2nd cause of food-borne disease in France. It has been demonstrated that the B. cereus surface protein IlsA and the siderophore bacillibactin (BB) are involved in iron acquisition from ferritin and that these two molecules are important for infection of the insect model G. mellonella. My thesis project focused on two parts: first the study of the BB-Fe3+ complex import into the cell by the siderophore binding protein FeuA highlights the central role of both BB and FeuA. The deletion of the genes encoding for these two molecules limits iron acquisition by B. cereus from ferritin, heme, hemoglobin and inorganic iron in vitro. On the other hand, the virulence phenotype during intra-haemocelic infection of G. mellonella is similar to the Wild-type strain. These results suggest a possible feedback on the expression of virulence factor genes when B. cereus is unable to synthetize both BB and FeuA, and therefore are under high stress. The second part of my work focused on the expression of genes involved in iron homeostasis in vivo, during gut infection of germ-free larvae of G. mellonella. We chose to perform a microgenomic approach, using laser-capture microdissection to get small samples in targeted areas, and then analysing the expression of chosen genes by RT-qPCR and ddPCR at two time points post ingestion The results show that : i) the colonisation of G. mellonella gut is impacted when B. cereus is deprived of both BB and FeuA ; ii) ilsA is expressed during gut infection ; iii) iron homeostasis is involved in adaptation and pathogenicity from the early step of infection of the insect gut ; iv) only weak gene expression modulation occured between the two timepoints This work gives new fundamental knowledge about B. cereus iron homeostasis, and highlights the use of new techniques regarding the in situ study of host-pathogen interactions.