Orientadores: Anete Pereira de Souza, Antonio Augusto Franco Garcia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Economia / Made available in DSpace on 2018-08-20T23:12:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_LiviaMourade_D.pdf: 2370923 bytes, checksum: b0c800b4425fab2c0c9fda9cbbb4798d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A seringueira é uma espécie de cruzamento misto e com um longo ciclo de vida, o que dificulta a geração de linhagens endogâmicas e, por consequência, a construção e integração de mapas de ligação usando as metodologias convencionais. A exemplo do que tem sido feito em outras espécies vegetais que apresentam limitações para a obtenção de linhagens endogâmicas, os mapas genéticos existentes para seringueira foram construídos utilizando populações F1 (com diferentes tipos de segregação). A integração dos mapas obtidos para cada um dos genitores é possível com base em marcadores bi-parental, onde ambos os genitores são heterozigóticos podendo segregar nas proporções 1:1:1:1, 1:2:1 e 3:1 na progênie F1. Além disso, o uso de marcadores codominantes e multialélicos, como os microssatélites, acrescentam muito à construção do mapa, uma vez que permite a obtenção de estimativas de frequência de recombinação e da fase de ligação com um menor viés. Os microssatélites são marcadores moleculares consagrados, sendo eles a ferramenta de escolha no estudo de diversos organismos pela simplicidade de uso e de análise. Entretanto, para espécies que ainda não têm grande parte de seu genoma sequenciado, a obtenção de marcadores desse tipo passa pela necessidade de desenvolvimento via bibliotecas genômicas. Esse trabalho objetivou desenvolver, caracterizar e mapear microssatélites em Hevea brasiliensis para possibilitar estudos genético-moleculares da variação morfológica, identificação de regiões genômicas associadas a fenótipos de interesse, bem como análises genético-populacionais. Uma biblioteca genômica enriquecida em motivos repetitivos foi construída, a partir da qual foram desenvolvidos os microssatélites utilizados nesse trabalho. A utilização dos microssatélites de Hevea brasiliensis em amplificações heterólogas envolvendo seis espécies do gênero Hevea resultou em aproximadamente 98% de sucesso nas amplificações, sugerindo a existência de um complexo formado pelas diferentes espécies do gênero. Um mapa genético-molecular foi construído utilizando-se 284 marcadores microssatélites na análise de uma população segregante F1 com 270 indivíduos, a partir do cruzamento entre os genitores PB217 e PR255. Por meio da utilização do programa ONEMAP foi possível a construção de um mapa de ligação integrado que revelou 2840 cM de extensão, distribuídos em 23 grupos de ligação. O mapeamento de QTLs realizado utilizando metodologia de mapeamento por intervalo composto (CIM) detectou 24 QTLs para altura e circunferência das plantas entre as estações de verão e inverno. Este trabalho é pioneiro na construção de um mapa integrado para seringueira pelo fato dele ter sido construído unicamente com marcadores microssatélites, os quais são altamente informativos. Além disso, é também o primeiro estudo envolvendo análise de QTL para características relacionadas ao crescimento de plantas em seringueira, bem como é inédita a aplicação da metodologia CIM para população F1 segregante / Abstract: The rubber tree is an mixed crossing species with a long life cycle, which makes it difficult for the generation of inbred lines, and, therefore, the construction and integration of linkage maps by using conventional methodologies. Similar to what has been reported from other plant species that have limitations to obtain inbred lines, the genetic maps for rubber tree have been constructed by using F1 populations (with different types of segregation). The integration of maps obtained for each of the genitors is possible based on bi-parental markers, where both genitors are heterozygous, being able to segregate in ratios 1:1:1:1, 1:2:1 and 3:1 in the F1 progeny. Moreover, the use of co-dominant and multi-allele markers, such as microsatellites, adds a lot to the construction of maps, since it allows the obtainment of estimates of recombination frequency and linkage phase with less bias. The microsatellites are established molecular markers which are the tool of choice in the study of various organisms for their simplicity of use and analysis. Nevertheless, their application in species whose genomes have not yet been sequenced requires a prior development phase. The present study intended to develop, characterize and map microsatellites for the species Hevea brasiliensis so that initiatives concerning morphological variation, identification of genomic regions linked to phenotypes of interest, as well as population genetic analysis. A repetitive DNA-enriched library was constructed from which it was developed the microsatellites used in this work. The use of Hevea brasiliensis microsatellites for heterologous amplification in other six Hevea species was done with approximately 98% of success ratio, suggesting the existence of a complex formed by different species. A molecular genetic map was constructed using 284 microsatellite markers in the analysis of an F1 segregating population with 270 individuals from a cross between the parents PB217 and PR255. By using the program ONEMAP it was possible the construction of an integrated linkage map that revealed 2840 cm in length, divided into 23 linkage groups. The QTL mapping methodology was performed using composite interval mapping (CIM) and detected 24 QTLs for plant height and circumference between summer and winter. This work is a pioneer in building an integrated map for rubber because it was built only with microsatellite markers, which are highly informative. Furthermore, it is also the first one involving the analysis of QTL for characteristics related to the growth of rubber tree plants, as well as novel application of the CIM methodology for this type of population / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 820068 bytes, checksum: d168e3825b15e5ad2fd3ea75fc70307b (MD5) Previous issue date: 2011-07-04 / Identification of soybean cultivars in Brazil is currently based on 30 morphological descriptors. Microsatellite markers are widely used for determination of genetic diversity, paternity tests, varietal purity and genetic mapping. Some variations of the conventional technique for microsatellite genotyping have been developed in order to match the speed and automation of current techniques with quality and low cost. Among them, there is a multiplex genotyping system in semi-automatic DNA sequencers, using universal tail extended primers (UTEP). This study aimed to standardize a robust system of semi-automatic molecular genotyping based on the UTEP methodology for soybean identification, to evaluate differences between this method and the conventional genotyping system using polyacrylamide gel electrophoresis and to characterize 30 soybean cultivars with a set of selected markers, estimating their allelic frequencies. These descriptors can be used as genotypic tool for cultivar identification and provide subsidies for the protection of intellectual property, determination and testing of varietal purity. Thirty commercial soybean cultivars were evaluated with a group of 22 microsatellite markers described in the literature. Genotyping was performed in a semi-automatic sequencer (UTEP) or by polyacrylamide gel electrophoresis (conventional). Among the loci analyzed, 13 were selected because they presented good amplification profiles, with few stutter products, and a large number of alleles. The allelic profile of each cultivar was first defined by the genotyping conventional system, and then by the semi- automated sequencer. For the UTEP genotyping methodology, the total number of alleles found was 50, ranging from 2 (Satt045) to 7 (Satt005). The polymorphic information content (PIC) ranged from 0.40 (Satt045) to 0.74 (Satt005) with an average of 0.62. For the conventional method the number of alleles found was 38 with a range of 2 (Satt045, Satt070 and AF162283) to 5 (Satt005) alleles. The PIC had a range 0.39 (Satt045) to 0.67 (Satt079), with an average of 0.56. The values of probability for random identity differed between the methods being <10-5 (UTEP) and <10-4 (conventional). Despite slight differences, there was a high correlation between genetic dissimilarity matrices obtained by the two methods (0.8026), and the groups formed also showed high similarity among them and they were coherent with the phenotypic data used for varietal registration and with the genealogies of the cultivars. In addition to the high sensitivity for detection of alleles of very close sizes, the UTEP method allowed a more accurate identification of amplification artifacts. The marker selected for both methods allowed the distinction of all cultivars analyzed. The UTEP method has a low cost when compared to common techniques of fluorescence tagging, in addition, its high accuracy makes this an advantageous method for cultivar characterization and determination of genetic purity. The set of markers tested in this work can be used as a set of genotype descriptors complementary to the phenotypic descriptors already used for cultivar protection in distinctness tests. / O desenvolvimento de sistemas de identificação molecular para determinar e rastrear a identidade genética de um cultivar representa um grande desafio ao sistema de proteção utilizado no país, até então fundamentado em descritores fenotípicos. A identificação de cultivares de soja é feita atualmente no Brasil com base em 30 descritores morfológicos. Marcadores moleculares do tipo microssatélite são largamente utilizados para fins de determinação da diversidade genética, paternidade, análises de pureza varietal e mapeamento genético. Algumas variações da técnica de genotipagem convencional por microssatélite vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de adequar a velocidade e automatização de técnicas atuais, com qualidade de análise e baixo custo. Dentre elas, destaca-se um sistema multiplex de genotipagem em sequenciador semi-automático de DNA, que utiliza primers com cauda estendida universal (PCEU). O presente trabalho teve como objetivos padronizar um sistema reprodutível de genotipagem molecular semi-automatizado baseado na metodologia PCEU para a cultura da soja, avaliar diferenças em relação ao sistema de genotipagem convencional, em gel de poliacrilamida e caracterizar com o conjunto de marcadores selecionados, 30 cultivares de soja estimando suas frequências alélicas. Estes descritores genotípicos poderão ser utilizados como ferramenta para a identificação de cultivares e fornecer subsídios para a proteção da propriedade intelectual, determinação e comprovação de pureza varietal. Foram utilizados 30 cultivares comerciais de soja avaliados com um grupo de 22 marcadores microssatélites já descritos na literatura. A genotipagem foi realizada em sequenciador semi- automático (PCEU) e em gel de poliacrilamida (convencional). Dentre os locos analisados, 13 foram selecionados por apresentarem melhor perfil de amplificação, menos produtos stutter, e maior número de alelos. O perfil alélico de cada cultivar foi definido primeiramente em sistema tradicional de genotipagem por eletroforese em gel de poliacrilamida, e depois no sequenciador semi-automatizado. Para a metodologia de genotipagem PCEU, o número total de alelos encontrados foi de 50, variando de 2 (Satt045) a 7 (Satt005). O conteúdo de informação polimórfica (PIC) variou de 0,40 (Satt045) a 0,74 (Satt005) com média de 0,62. Para a metodologia convencional o número de alelos encontrados foi de 38 com uma variação de 2 (Satt045, Satt070 e AF162283) a 5 (Satt005) alelos. O PIC apresentou uma faixa 0,39 (Satt045) a 0,67 (Satt079), com média de 0,56. Os valores de probabilidade de identidade ao acaso diferiram entre os métodos, sendo <10-5 (PCEU) e <10-4 (Convencional). Apesar de diferenças pontuais, observou-se alta correlação entre as matrizes de dissimilaridade genética entre os métodos (0,8026), e os grupos formados apresentaram também alta similaridade e foram concordantes com dados fenotípicos de registro varietal e de genealogia. Além da alta sensibilidade na detecção de alelos de tamanhos muito próximos, o método PCEU permitiu uma identificação mais criteriosa dos artefatos de amplificação. Os grupos de marcadores selecionados em ambas as metodologias permitiram distinguir todas as cultivares analisadas. O método PCEU possui baixo custo quando comparado a técnicas comuns de marcação por fluorescência, além disso, sua alta precisão faz deste um método vantajoso para a caracterização de cultivares e determinação da pureza genética. O grupo de marcadores analisados pode ser usado como um conjunto de descritores genotípicos complementar aos descritores fenotípicos obrigatórios utilizados para fim de proteção de cultivares em testes de distinguibilidade.