Les copépodes sont des petits crustacés de longueur autour de 1 mm en stade adulte. Leurs réponses à différents facteurs de stress tels que la salinité et la température peuvent être observées à différentes échelles d’organisation allant du gène, cellule jusqu’à l’organisme. Jusqu'à présent, aucune observation des effets de stress de température ou de salinité sur les copépodes n’a été faite par microscopie optique. Dans ce travail, nous avons mis en œuvre pour l'étude de ces copépodes les techniques de microscopie linéaire et non linéaires. D’abord avec la technique CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) nous avons pu étudier, caractériser et quantifier les effets de stress appliqués sur le copépode calanoïde Pseudodiaptomus marinus maintenu en culture pendant plusieurs générations dans le laboratoire à des conditions favorables et stables de salinité (30 psu) et de température (18 °C). Ces différents stress appliqués sont: une forte diminution de la température (18 à 4 ° C), des diminutions mineure et majeure de la salinité (de 30 respectivement à 15 PSU et à 0 PSU) et enfin, un stress mélangé d’une baisse simultané de la température et de la salinité (de 18 ° C et 30 psu à 4 ° C et 0 PSU). Nos observations ont été concentrées sur le muscle du copépode.Cette étude a été complétée par la technique SHG/TPEF qui nous a répondu à quelques questions à propos de la disparition des stries musculaires. Cette technique a été suivie par la technique de transformation de Fourier (FFT) appliquée sur les profils des stries musculaires pour mieux comprendre l’état des stries dans chaque stress. Enfin, nous avons appliqué la microscopie CARS qui a été développée dans notre laboratoire à l'imagerie de ces échantillons. Avec cette technique d’imagerie on a pu identifier les stries musculaires et les réserves lipidiques. / Copepods are small crustaceans with length about 1mm in adult stage. Their responses to different external strain factors such as salinity and temperature can be observed at different scales from genes to organism (individual). Until now, no observation of the effects of temperature or salinity stresses on copepods has been done by light microscopy In this work we exploited optical imaging techniques and specifically nonlinear microscopy linear and nonlinear. First of all CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) allow studying, characterisation and quantifying stress effect applied on calanoid Pseudodiaptomus marinus copepod maintained during several generations in the laboratory at favorable and stable condition of salinity (30 psu) and temperature (18° C). These stresses applied were: a sharp decrease in temperature (18 to 4°C), a moderate and a major decrease in salinity (from 30 respectively to 15 psu and 0 psu), and finally a mixed stress with a decrease both in temperature and salinity (from 18°C and 30 psu to 4°C and 0 psu). Our observations are concentrated on copepod muscles regions.This study has been completed with SHG/TPEF techniques to answer some questions about stripes disappearance. This technique was followed by Fourier transformation (FFT) applied on the stripes muscles profiles to more understanding about stripes situations in each stress. Finally, we applied CARS microscopy which was developed in our laboratory to image these samples. With this technique we were able to identify these muscles stripes and also lipid reserves.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 octobre 2023) / Le mémoire s'inscrit dans un contexte de segmentation vasculaire en trois dimensions. Il s'intéresse à l'analyse d'angiogrammes cérébraux de souris acquis par microscopie deux photons in vivo. Le projet vise à départager automatiquement l'appartenance d'un voxel à l'architecture vasculaire cérébrale ou aux autres tissus. La littérature spécifique à la segmentation vasculaire d'angiogrammes acquis par microscopie deux-photons est émergente. Les modèles existants tentent de s'adapter aux limites physiques et biologiques de cette modalité afin d'extraire l'information vasculaire. La performance d'un modèle d'apprentissage profond récent est quantifiée. Les résultats motivent l'exploration des paramètres susceptibles de limiter la qualité et la robustesse de la segmentation. Un nouvel algorithme de segmentation est développé en intégrant la géométrie des vaisseaux sanguins au sein du processus de classification. La pertinence des métriques de segmentation est discutée dans un contexte de débalancement entre la classe vasculaire et les tissus. Le mémoire vise à fournir et comparer des outils numériques permettant de guider la segmentation automatique d'angiogrammes cérébraux acquis par microscopie deux-photons.

Les avancées technologiques concernant la microscopie ont permis la création d'une grande variété de systèmes optiques dédiés à l'investigation du comportement dynamique des cellules in vivo. En neuroscience, le dé réside dans l'observation des interactions entre des neurones marqués d'un fluorophore qui sont situés à différentes profondeurs dans le tissu. Afin d'y arriver, il est nécessaire de balayer l'échantillon sur plusieurs plans transverses pour couvrir entièrement son volume. Puisque cette procédure diminue la résolution temporelle, il a été proposé d'utiliser un axicon pour augmenter la profondeur de champ du microscope et réduire le nombre de balayages à effectuer. Cependant, l'axicon est di cile à fabriquer et possède généralement des défauts sur la pointe du cône, dégradant ainsi la qualité de la composante. En vue de remplacer l'axicon par une autre composante optique dont la fabrication n'entraîne pas de défaut, il a été envisagé d'utiliser une lentille à gradient d'indice couplée à une lentille simple (GRIN-axicon). Des simulations ont montré que le GRIN-axicon a le potentiel de produire un faisceau Bessel de bonne qualité. Toutefois, les tests expérimentaux ont été très brefs et il est nécessaire d'investiguer davantage le comportement de cette nouvelle composante en laboratoire. L'objectif de ce projet de maîtrise est donc de concevoir, fabriquer et caractériser un GRIN-axicon pour une application en microscopie multiphotonique. Comme objectif secondaire, on souhaite approfondir la théorie reliée à cette nouvelle composante. / Technological advances in microscopy have led to the creation of a wide variety of optical systems dedicated to the investigation of the dynamic behavior of cells in vivo. In neuroscience, the challenge lies in the observation of interactions between labeled neurons located at different depths in the tissue. In order to achieve this, it is necessary to scan the sample on several transverse planes to fully cover its volume. Since this procedure decreases the temporal resolution, it has been proposed to use an axicon to increase the depth of field of the microscope and reduce the number of scans to be performed. However, the axicon is di cult to manufacture and usually has defects on the tip of the cone, thus degrading the quality of the component. In order to replace the axicon by another optical component easier to manufacture, the use of a graded index lens coupled to a single lens (GRIN-axicon) was considered. Simulations have shown that the GRIN-axicon has the potential to produce a good quality Bessel beam. However, experimental tests have been very limited and it is necessary to further investigate the behaviour of this new component in the laboratory. The objective of this master's project is therefore to design, manufacture and characterize a GRIN-axicon for application in multiphoton microscopy. As a secondary objective, we wish to deepen the theory related to this new component.

Titre de l'écran-titre (visionné le 6 novembre 2023) / Ce présent projet de maîtrise porte sur l'étude du couplage neurovasculaire, soit la relation entre l'activité neuronale et la dilatation/constriction des vaisseaux sanguins, car une dysfonction dans le couplage neurovasculaire est une des caractéristiques de certaines pathologies cérébrales telles que la maladie d'Alzheimer, l'hypertension intracrânienne et l'AVC ischémique, mais aucune technique d'imagerie existe pour mesurer l'activité neuronale et l'oxygénation vasculaire cérébrale simultanément et indépendamment. Ce projet de recherche a pour buts principaux de développer un modèle animal de souris et un protocole d'imagerie pour étudier le couplage neurovasculaire in vivo injectées d'un adénovirus associé (AAV) à l'aide d'un microscope 2-photons. Cette modalité d'imagerie, permet d'exciter et d'imager des structures fluorescentes à haute résolution spatiale. Cette méthode de microscopie a l'avantage de produire des images contenant l'information venant uniquement du plan focal, et de permettre une plus grande profondeur de pénétration par rapport aux autres techniques de microscopie standards. Dans ce projet, un modèle animal a été développé et optimisé pour exprimer la protéine fluorescente GCaMP6s dans le corps cellulaire des neurones excitateurs et inhibiteurs chez des souris adultes. Ce modèle animal exprime aussi le fluorophore Texas Red qui est un marqueur de plasma sanguin. Les paramètres du microscope 2-photons ont été déterminés pour imager et mesurer l'activité neuronale ainsi que pour imager la vasculature cérébrale simultanément et indépendamment dans le cortex somatosensoriel qui est relié aux mouvements des moustaches. Les mesures acquises démontrent que cette technique d'imagerie et ce modèle animal permettent d'obtenir de l'information sur l'activité neuronale avec et sans stimulation sur des souris anesthésiées ou éveillées. Les stimulations externes appliquées à la souris imagée sont des bouffées d'air envoyées sur les moustaches d'un côté du museau de la souris. Des images de la structure vasculaire ont été obtenues avec le faisceau gaussien du microscope 2-photons, mais aussi avec le faisceau de Bessel qui permet d'acquérir des images volumiques. L'étude du couplage neurovasculaire de ce modèle animal a été faite au microscope 2-photons en corrélant l'intensité des signaux émis par GCaMP6s et par Texas Red. De plus, la microscopie à champ large a été exploitée pour quantifier l'hémodynamique dans l'ensemble du cortex, puis ainsi vérifier la corrélation entre l'oxygénation du sang et l'activité neuronale. Finalement, la possibilité de mesurer le débit sanguin au microscope 2-photons et de détecter l'activité neuronale au microscope à champ large a été évaluée. / This present master's project focuses on the study of neurovascular coupling, i.e. the relationship between neuronal activity and the dilation/constriction of blood vessels, because a dysfunction in neurovascular coupling is one of the characteristics of certain cerebral pathologies like Alzheimer's disease, intracranial hypertension and ischemic stroke, but no imaging technique exists to measure neuronal activity and cerebral vascular oxygenation simultaneously and independently. The main goals of this research project are to develop an animal mouse model injected with an associated adenovirus (AAV) and an imaging protocol to study neurovascular coupling in vivo using 2-photon microscopy. This imaging modality makes it possible to excite and image fluorescent structures at high spatial resolution. This method of microscopy has the advantage of producing images containing information coming only from the focal plane, and of allowing a greater depth of penetration compared to other standard microscopy techniques. In this project, an animal model was developed and optimized to express the fluorescent protein GCaMP6s in the cell body of excitatory and inhibitory neurons in adult mice. This animal model also expresses the Texas Red fluorophore which is a blood plasma marker. The parameters of the 2-photon microscope were determined to image and measure neuronal activity as well as to image the cerebral vasculature simultaneously and independently in the somatosensory cortex which is connected to the movements of the whiskers. The measurements acquired demonstrate that this imaging technique and this animal model make it possible to obtain information on neuronal activity with and without stimulation in anesthetized or awake mice. The external stimuli applied to the imaged mouse are puffs of air delivered to the whiskers on one side of the mouse's muzzle. Images of the vascular structure were obtained with the Gaussian beam of the 2-photon microscope, but also with the Bessel beam which makes it possible to acquire volumetric images. The study of the neurovascular coupling of this animal model was made under a 2-photon microscope by correlating the intensity of the signals emitted by GCaMP6s and by Texas Red. In addition, wide-field microscopy has been used to quantify hemodynamics throughout the cortex, and thus verify the correlation between blood oxygenation and neuronal activity. Finally, the possibility of measuring blood flow under a 2-photon microscope and detecting neuronal activity under a wide-field microscope was evaluated.

La microscopie à balayage laser est limitée en résolution par la limite de diffraction de la lumière. Plusieurs méthodes de superrésolution ont été développées depuis les années 90 pour franchir cette limite. Cependant, la superrésolution est souvent obtenue au prix d'une grande complexité (laser de haute puissance pulsé, temps d'acquisition long, fluorophores spécifiques) ainsi que des limitations dans le type d'échantillon observé (observation en surface uniquement). Dans certains cas, comme pour l'illumination structurée et la microscopie SLAM, une amélioration en résolution plus modeste est obtenue, mais avec une complexité et des limites d'utilisation fortement réduites par rapport aux autres méthodes de superrésolution. Les mé- thodes que nous proposons ici sont des méthodes d'augmentation de résolution qui visent à minimiser les contraintes expérimentales et à garder un maximum des avantages des techniques d'imagerie conventionnelles. Dans les cas que nous avons étudiés, les méthodes proposées sont basées sur la microscopie confocale. Nous allons montrer dans un premier temps qu'il est possible d'augmenter de 20% la résolution d'un microscope confocal en changeant le faisceau laser utilisé pour l'excitation par un faisceau Bessel-Gauss tout en ayant un sténopé de la bonne taille (soit 1 Airy Unit). Les avantages de la méthode proposée résident dans sa simplicité d'installation et d'utilisation et sa compatibilité avec d'autres méthodes d'augmentation de résolution. Nous avons démontré les capacités d'augmentation de résolution des faisceaux Bessel-Gauss théoriquement puis exp érimentalement sur des échantillons de nano-sphères et de tissus biologiques obtenant ainsi une résolution de 0.39. Nous avons également montré que l'amélioration en résolution des faisceaux Bessel-Gauss donne une analyse statistique de la colocalisation avec un taux plus faible de faux positifs. Nous avons utilisé des faisceaux Bessel-Gauss de différents ordres pour améliorer la méthode de la microscopie SLAM et ainsi obtenir une résolution descendant à 0.17 (90 nm avec une longueur d'onde de 532 nm). La méthode proposée est entièrement basée sur la microscopie confocale et seul un module permettant de changer le faisceau laser doit être ajouté au montage. Dans un second temps, nous proposons une méthode permettant de bénéficier au maximum des propriétés de la déconvolution pour augmenter la résolution de la microscopie confocale. Pour cela, nous avons utilisé différents modes laser pour l'acquisition d'images et ces images sont utilisées comme données d'entrée pour la déconvolution (avec des mesures des PSF respectives). Les faisceaux laser utilisés apportent ainsi des informations complémentaires à l'algorithme de déconvolution permettant ainsi d'obtenir des images avec une résolution encore meilleure que si une simple déconvolution (utilisant le même algorithme) était utilisée sur l'image confocale. Par la suite, nous avons changé les faisceaux laser par des faisceaux Bessel-Gauss pour augmenter davantage l'ecacité de la déconvolution. Encore une fois, la méthode proposée est entièrement basée sur la microscopie confocale et seul un module permettant de changer le faisceau laser doit être ajouté au montage. Enfin, nous proposons d'aborder une méthode de reconstruction en trois dimensions par tomographie basée sur des projections obtenues en microscopie à deux photons utilisant les faisceaux Bessel-Gauss. En focalisant des faisceaux Bessel-Gauss à angle en microscopie deux photons, on obtient une série de projections utilisables pour une reconstruction tomographique. Le but est de tester la faisabilité de la méthode qui permettrait de reconstruire un volume, en nécessitant moins d'images que dans le cas d'une acquisition plan par plan, en microscopie deux photons classique. / Laser scanning microscopy is limited in lateral resolution by the diffraction of light. Superresolution methods have been developed since the 90s to overcome this limitation. However, superresolution is generally achieved at the cost of a greater complexity (high power lasers, very long acquisition times, specic uorophores) and limitations on the observable samples. In some cases, such as Structured Illumination Microscopy (SIM) and Switching Laser Modes (SLAM), a more modest improvement in resolution is obtained with a reduced complexity and fewer limitations. We propose here methods which improve the resolution while minimizing the experimental constraints and keeping most of the advantages of classical microscopy. First, we show that we can improve by twenty percent the resolution of confocal microscopy by using Bessel-Gauss beams, and by having the right pinhole size (1 Airy Unit), compared to conventional Gaussian beam based confocal microscopy. The advantages of this strategy include simplicity of installation and use, linear polarization compatibility, possibility to combine it with other resolution enhancement and superresolution strategies. We demonstrate the resolution enhancement capabilities of Bessel-Gauss beams both theoretically and experimentally on nano-spheres and biological tissue samples with a resolution of 0.39. We achieved these resolutions without any residual artifacts coming from the Bessel-Gauss beam side lobes. We also show that the resolution enhancement of Bessel-Gauss beams leads to a better statistical colocalization analysis with fewer false positive results than when using Gaussian beams. We have also used Bessel-Gauss beams of different orders to further improve the resolution by combining them in SLAM microscopy achieving a resolution of 0.17 (90 nm with a wavelength of 532 nm). In a second step, we propose a method to improve the resolution of confocal microscopy by combining different laser modes and deconvolution. Two images of the same eld are acquired with the confocal microscope using different laser modes and are used as inputs to a deconvolution algorithm. The two laser modes have different Point Spread Functions and thus provide complementary information leading to an image with enhanced resolution compared to using a single confocal image as input to the same deconvolution algorithm. By changing the laser modes to Bessel-Gauss beams, we were able to improve the effciency of the deconvolution algorithm and to obtain images with a residual Point Spread Function having a width smaller than 100 nm. The proposed method requires only a few add-ons to the classic confocal or two photon microscopes. Finally, we propose a three dimensional tomography reconstruction method using Bessel-Gauss beams as projection tools in two-photon microscopy. While focussing Bessel-Gauss beams at an angle in two photon microscopy, we can obtain a series of projections that can be used for tomography reconstruction. The aim is to test the practicality of the methods allowing to reconstruct a volume while using fewer images than plane by plane acquisitions as in classic two-photon microscopy.

Titre de l'écran-titre (visionné le 16 août 2023) / Certaines caractéristiques de la larve de poisson-zèbre, telles que sa petite taille et sa transparence optique, en font un modèle stratégique en neurophotonique, en particulier avec la perspective d'études de l'activité du cerveau entier à l'échelle cellulaire. Malgré le relativement petit nombre de neurones présents dans le cerveau du poisson-zèbre, son organisation comprend plusieurs régions anatomiquement, biochimiquement et fonctionnellement analogues à celles présentes chez d'autres vertébrés, incluant l'humain. Les comportements émergeant de cette organisation forment un registre riche ouvrant la porte à la recherche en neurosciences. Par exemple, le système dopaminergique du poisson-zèbre régule plusieurs fonctions analogues chez l'humain, telles que les émotions et les fonctions motrices. Au cours de mon projet, j'ai modifié puis optimisé un microscope à fluorescence par excitation à deux photons, ce qui m'a permis de mesurer l'activité de plus de 60 000 neurones dans une lignée de poisson-zèbre transgénique exprimant un indicateur de calcium fluorescent (GCaMP6s) panneuronal. Pour identifier les neurones dopaminergiques, j'ai fait appel au marquage immunohistochimique des larves fixées suivant leur imagerie calcique. En projetant la localisation des neurones marqués sur les données fonctionnelles par recalage d'images, j'ai pu quantifier l'activité neuronale de la population dopaminergique. Enfin, pour mesurer les manifestations comportementales correspondant à l'activité neuronale, j'ai intégré au microscope un montage incluant un écran, projetant des stimuli visuels, et une caméra haute vitesse, captant les battements de queue. Ce montage a permis de corréler le comportement de nage de spécimens avec l'activité de neurones dont la distribution spatiale est cohérente avec la littérature. Mes travaux de maîtrise ont ainsi mis en place un modèle intégré d'imagerie neuronale, de stimulation sensorielle, et de comportement chez la larve de poisson-zèbre qui permettra d'explorer le rôle des différents circuits neuronaux dans le fonctionnement du cerveau ainsi que l'influence de l'exposome sur leur fonction.