Les copépodes sont des petits crustacés de longueur autour de 1 mm en stade adulte. Leurs réponses à différents facteurs de stress tels que la salinité et la température peuvent être observées à différentes échelles d’organisation allant du gène, cellule jusqu’à l’organisme. Jusqu'à présent, aucune observation des effets de stress de température ou de salinité sur les copépodes n’a été faite par microscopie optique. Dans ce travail, nous avons mis en œuvre pour l'étude de ces copépodes les techniques de microscopie linéaire et non linéaires. D’abord avec la technique CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) nous avons pu étudier, caractériser et quantifier les effets de stress appliqués sur le copépode calanoïde Pseudodiaptomus marinus maintenu en culture pendant plusieurs générations dans le laboratoire à des conditions favorables et stables de salinité (30 psu) et de température (18 °C). Ces différents stress appliqués sont: une forte diminution de la température (18 à 4 ° C), des diminutions mineure et majeure de la salinité (de 30 respectivement à 15 PSU et à 0 PSU) et enfin, un stress mélangé d’une baisse simultané de la température et de la salinité (de 18 ° C et 30 psu à 4 ° C et 0 PSU). Nos observations ont été concentrées sur le muscle du copépode.Cette étude a été complétée par la technique SHG/TPEF qui nous a répondu à quelques questions à propos de la disparition des stries musculaires. Cette technique a été suivie par la technique de transformation de Fourier (FFT) appliquée sur les profils des stries musculaires pour mieux comprendre l’état des stries dans chaque stress. Enfin, nous avons appliqué la microscopie CARS qui a été développée dans notre laboratoire à l'imagerie de ces échantillons. Avec cette technique d’imagerie on a pu identifier les stries musculaires et les réserves lipidiques. / Copepods are small crustaceans with length about 1mm in adult stage. Their responses to different external strain factors such as salinity and temperature can be observed at different scales from genes to organism (individual). Until now, no observation of the effects of temperature or salinity stresses on copepods has been done by light microscopy In this work we exploited optical imaging techniques and specifically nonlinear microscopy linear and nonlinear. First of all CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) allow studying, characterisation and quantifying stress effect applied on calanoid Pseudodiaptomus marinus copepod maintained during several generations in the laboratory at favorable and stable condition of salinity (30 psu) and temperature (18° C). These stresses applied were: a sharp decrease in temperature (18 to 4°C), a moderate and a major decrease in salinity (from 30 respectively to 15 psu and 0 psu), and finally a mixed stress with a decrease both in temperature and salinity (from 18°C and 30 psu to 4°C and 0 psu). Our observations are concentrated on copepod muscles regions.This study has been completed with SHG/TPEF techniques to answer some questions about stripes disappearance. This technique was followed by Fourier transformation (FFT) applied on the stripes muscles profiles to more understanding about stripes situations in each stress. Finally, we applied CARS microscopy which was developed in our laboratory to image these samples. With this technique we were able to identify these muscles stripes and also lipid reserves.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 octobre 2023) / Le mémoire s'inscrit dans un contexte de segmentation vasculaire en trois dimensions. Il s'intéresse à l'analyse d'angiogrammes cérébraux de souris acquis par microscopie deux photons in vivo. Le projet vise à départager automatiquement l'appartenance d'un voxel à l'architecture vasculaire cérébrale ou aux autres tissus. La littérature spécifique à la segmentation vasculaire d'angiogrammes acquis par microscopie deux-photons est émergente. Les modèles existants tentent de s'adapter aux limites physiques et biologiques de cette modalité afin d'extraire l'information vasculaire. La performance d'un modèle d'apprentissage profond récent est quantifiée. Les résultats motivent l'exploration des paramètres susceptibles de limiter la qualité et la robustesse de la segmentation. Un nouvel algorithme de segmentation est développé en intégrant la géométrie des vaisseaux sanguins au sein du processus de classification. La pertinence des métriques de segmentation est discutée dans un contexte de débalancement entre la classe vasculaire et les tissus. Le mémoire vise à fournir et comparer des outils numériques permettant de guider la segmentation automatique d'angiogrammes cérébraux acquis par microscopie deux-photons.

Titre de l'écran-titre (visionné le 6 novembre 2023) / Ce présent projet de maîtrise porte sur l'étude du couplage neurovasculaire, soit la relation entre l'activité neuronale et la dilatation/constriction des vaisseaux sanguins, car une dysfonction dans le couplage neurovasculaire est une des caractéristiques de certaines pathologies cérébrales telles que la maladie d'Alzheimer, l'hypertension intracrânienne et l'AVC ischémique, mais aucune technique d'imagerie existe pour mesurer l'activité neuronale et l'oxygénation vasculaire cérébrale simultanément et indépendamment. Ce projet de recherche a pour buts principaux de développer un modèle animal de souris et un protocole d'imagerie pour étudier le couplage neurovasculaire in vivo injectées d'un adénovirus associé (AAV) à l'aide d'un microscope 2-photons. Cette modalité d'imagerie, permet d'exciter et d'imager des structures fluorescentes à haute résolution spatiale. Cette méthode de microscopie a l'avantage de produire des images contenant l'information venant uniquement du plan focal, et de permettre une plus grande profondeur de pénétration par rapport aux autres techniques de microscopie standards. Dans ce projet, un modèle animal a été développé et optimisé pour exprimer la protéine fluorescente GCaMP6s dans le corps cellulaire des neurones excitateurs et inhibiteurs chez des souris adultes. Ce modèle animal exprime aussi le fluorophore Texas Red qui est un marqueur de plasma sanguin. Les paramètres du microscope 2-photons ont été déterminés pour imager et mesurer l'activité neuronale ainsi que pour imager la vasculature cérébrale simultanément et indépendamment dans le cortex somatosensoriel qui est relié aux mouvements des moustaches. Les mesures acquises démontrent que cette technique d'imagerie et ce modèle animal permettent d'obtenir de l'information sur l'activité neuronale avec et sans stimulation sur des souris anesthésiées ou éveillées. Les stimulations externes appliquées à la souris imagée sont des bouffées d'air envoyées sur les moustaches d'un côté du museau de la souris. Des images de la structure vasculaire ont été obtenues avec le faisceau gaussien du microscope 2-photons, mais aussi avec le faisceau de Bessel qui permet d'acquérir des images volumiques. L'étude du couplage neurovasculaire de ce modèle animal a été faite au microscope 2-photons en corrélant l'intensité des signaux émis par GCaMP6s et par Texas Red. De plus, la microscopie à champ large a été exploitée pour quantifier l'hémodynamique dans l'ensemble du cortex, puis ainsi vérifier la corrélation entre l'oxygénation du sang et l'activité neuronale. Finalement, la possibilité de mesurer le débit sanguin au microscope 2-photons et de détecter l'activité neuronale au microscope à champ large a été évaluée. / This present master's project focuses on the study of neurovascular coupling, i.e. the relationship between neuronal activity and the dilation/constriction of blood vessels, because a dysfunction in neurovascular coupling is one of the characteristics of certain cerebral pathologies like Alzheimer's disease, intracranial hypertension and ischemic stroke, but no imaging technique exists to measure neuronal activity and cerebral vascular oxygenation simultaneously and independently. The main goals of this research project are to develop an animal mouse model injected with an associated adenovirus (AAV) and an imaging protocol to study neurovascular coupling in vivo using 2-photon microscopy. This imaging modality makes it possible to excite and image fluorescent structures at high spatial resolution. This method of microscopy has the advantage of producing images containing information coming only from the focal plane, and of allowing a greater depth of penetration compared to other standard microscopy techniques. In this project, an animal model was developed and optimized to express the fluorescent protein GCaMP6s in the cell body of excitatory and inhibitory neurons in adult mice. This animal model also expresses the Texas Red fluorophore which is a blood plasma marker. The parameters of the 2-photon microscope were determined to image and measure neuronal activity as well as to image the cerebral vasculature simultaneously and independently in the somatosensory cortex which is connected to the movements of the whiskers. The measurements acquired demonstrate that this imaging technique and this animal model make it possible to obtain information on neuronal activity with and without stimulation in anesthetized or awake mice. The external stimuli applied to the imaged mouse are puffs of air delivered to the whiskers on one side of the mouse's muzzle. Images of the vascular structure were obtained with the Gaussian beam of the 2-photon microscope, but also with the Bessel beam which makes it possible to acquire volumetric images. The study of the neurovascular coupling of this animal model was made under a 2-photon microscope by correlating the intensity of the signals emitted by GCaMP6s and by Texas Red. In addition, wide-field microscopy has been used to quantify hemodynamics throughout the cortex, and thus verify the correlation between blood oxygenation and neuronal activity. Finally, the possibility of measuring blood flow under a 2-photon microscope and detecting neuronal activity under a wide-field microscope was evaluated.

Titre de l'écran-titre (visionné le 16 août 2023) / Certaines caractéristiques de la larve de poisson-zèbre, telles que sa petite taille et sa transparence optique, en font un modèle stratégique en neurophotonique, en particulier avec la perspective d'études de l'activité du cerveau entier à l'échelle cellulaire. Malgré le relativement petit nombre de neurones présents dans le cerveau du poisson-zèbre, son organisation comprend plusieurs régions anatomiquement, biochimiquement et fonctionnellement analogues à celles présentes chez d'autres vertébrés, incluant l'humain. Les comportements émergeant de cette organisation forment un registre riche ouvrant la porte à la recherche en neurosciences. Par exemple, le système dopaminergique du poisson-zèbre régule plusieurs fonctions analogues chez l'humain, telles que les émotions et les fonctions motrices. Au cours de mon projet, j'ai modifié puis optimisé un microscope à fluorescence par excitation à deux photons, ce qui m'a permis de mesurer l'activité de plus de 60 000 neurones dans une lignée de poisson-zèbre transgénique exprimant un indicateur de calcium fluorescent (GCaMP6s) panneuronal. Pour identifier les neurones dopaminergiques, j'ai fait appel au marquage immunohistochimique des larves fixées suivant leur imagerie calcique. En projetant la localisation des neurones marqués sur les données fonctionnelles par recalage d'images, j'ai pu quantifier l'activité neuronale de la population dopaminergique. Enfin, pour mesurer les manifestations comportementales correspondant à l'activité neuronale, j'ai intégré au microscope un montage incluant un écran, projetant des stimuli visuels, et une caméra haute vitesse, captant les battements de queue. Ce montage a permis de corréler le comportement de nage de spécimens avec l'activité de neurones dont la distribution spatiale est cohérente avec la littérature. Mes travaux de maîtrise ont ainsi mis en place un modèle intégré d'imagerie neuronale, de stimulation sensorielle, et de comportement chez la larve de poisson-zèbre qui permettra d'explorer le rôle des différents circuits neuronaux dans le fonctionnement du cerveau ainsi que l'influence de l'exposome sur leur fonction.