Ce présent projet de maîtrise porte sur le développement et l'optimisation d'une technique d'imagerie volumétrique rapide à grand champ, appelée la microscopie HiLo, pour imager l'activité calcique du cerveau de poisson-zèbres transgéniques GCaMP au stade juvénile. La microscopie HiLo peut effectivement amener divers avantages au domaine, tels que les faibles coûts et la facilité de conception et d'alignement, tout en procurant des performances d'imagerie similaires aux techniques déjà utilisées dans le domaine. Elle produit des images sectionnées optiquement en combinant deux images à grand champ pour extraire les informations provenant uniquement du plan focal : une à illumination uniforme et l'autre à illumination à tavelures laser. Le contraste des tavelures laser est un paramètre intéressant pour moduler l'épaisseur du sectionnement optique selon les besoins. Dans ce projet, un module Python est développé pour aider à la conception optique, ce qui est employé pour concevoir et construire le microscope HiLo avec les composantes optiques optimales. Le microscope est testé de multiple façon expérimentalement, définissant ses paramètres d'imagerie et démontrant ses performances. Un des aspects les plus intéressants du système est l'incorporation d'une lentille à focale variable pour produire des images volumétriques ainsi qu'un réducteur de tavelures laser pour alterner entre les deux types d'illumination. Beaucoup de travail est fait en ce qui concerne leur optimisation et synchronisation dans le système HiLo. L'algorithme permettant de produire des images sectionnées optiquement avec les deux images brutes à grand champ est développé en langage de programmation Python pour faciliter son utilisation future. Finalement, l'utilisation du microscope HiLo pour acquérir des images d'activité calcique du cerveau de poisson-zèbres permet de conclure que cette technique est prometteuse pour obtenir de l'information sur les connectivités du cerveau selon différents stimuli et stades de développement compte tenu de sa rapidité d'acquisition, son sectionnement optique et son faible coût. / The goal of this master's project is to optimize and develop a widefield imaging technique called HiLo microscopy for fast volumetric calcium imaging in a juvenile transgenic zebrafish brain expressing GCaMP. HiLo microscopy brings multiple advantages to the field, such as the low cost and the ease to design and align it and its performance is comparable to techniques already used in the field. The HiLo technique produces optically sectioned images by combining two raw widefield images to extract the information coming exclusively from the focal plane only. The first of the two images is acquired with a uniform illumination and the second is acquired with a speckle illumination. The speckle contrast is an interesting parameter to tune the optical sectioning thickness because they are indicators of objects' depth position. In this project, a Python module is developed to simulate optical design and calculations, which is then used to design the HiLo microscope with the most optimal optical components. The microscope's function is also tested with many different experiments that define its imaging parameters and demonstrates its performances. Some of the most interesting aspects of this system are the use of an electrically tunable lens to scan the sample in depth and a laser speckle reducer that is used to switch between the uniform and speckle illumination patterns. A significant amount of work is done to optimize and synchronize the components in the system. Next, the algorithm used to produce the optically sectioned images is also developed in this project with the Python programming language to facilitate its future usage. Finally, the HiLo microscope is used to produce calcium imaging acquisitions of zebrafish brains, which show that HiLo microscopy is promising to obtain connectivity information of the brain with different stimuli and at different developmental stages due to its fast acquisition speed, optical sectioning and low cost.

Titre de l'écran-titre (visionné le 4 décembre 2024) / De par son implication dans plusieurs maladies neurologiques ainsi que dans les mécanismes sous jacents de la mémoire et de l'apprentissage, il est capital d'étudier la plasticité synaptique. Ce projet a cherché à développer des outils et protocoles permettant d'étudier les synapses et leur développement en utilisant le modèle du poisson-zèbre larvaire. À cet égard, j'ai exploité des techniques de biologie moléculaire pour concevoir et créer des plasmides codant pour l'expression de biomarqueurs synaptiques fluorescents. FingR-PSD95 (Fibronectin intrabody generated with mRNA display) est une protéine génétiquement encodée agissant à la manière d'un anticorps capable de cibler la protéine post-synaptique PSD95 localisée au niveau de l'espace post-synaptique des synapses excitatrices. Lorsqu'associé à une protéine fluorescente, FingR-PSD95 rend donc l'observation de synapses excitatrices en microscopie possible. Pour permettre au poisson-zèbre d'exprimer ces biomarqueurs, j'ai injecté des plasmides encodant FingR-PSD9 couplé à une protéine fluorescente verte (GFP) dans des œufs fécondés de poisson-zèbre au stade unicellulaire. Pour observer les prolongements neuronaux, j'ai utilisé un marquage membranaire rouge couplé au système FingR-PSD95. L'intégration de l'ADN plasmidique au génome du poisson-zèbre se fait par le système de transposase Tol2. Par la suite, j'ai employé des techniques de microscopie à fluorescence pour réaliser de l'imagerie synaptique sur des larves de poisson-zèbre vivantes. La caractérisation de ce marquage synaptique et de son efficacité chez le poisson-zèbre a alors permis de déterminer les stratégies d'optimisation nécessaires pour éventuellement développer une nouvelle lignée transgénique.Dans le cadre d'expériences de suivi de développement synaptique chez le poisson-zèbre, il est souhaitable de pouvoir imager des larves à des stades avancés de développement alors que leur répertoire comportemental se complexifie et leur organisation synaptique se développe considérablement. Il est nécessaire de développer des protocoles d'imagerie adaptés aux changements physiologiques dus à la maturation des larves. Ainsi, il sera possible d'étudier l'organisation synaptique du poisson-zèbre au travers d'expériences comportementales, d'apprentissage, et de manipulations de l'exposome (microbiote, toxines, stress, environnement social) à différents stades de développement.

Le développement de l'obésité et des complications associées sont intimement liés à la composition du microbiote intestinal. En plus des études chez l'humain, plusieurs modèles animaux sont utilisés pour comprendre la dynamique et l'impact des organismes qui habitent notre intestin, dont le plus utilisé est le rongeur. Récemment, d'autres modèles animaux plus simples s'imposent dans l'étude du microbiote intestinal, comme le poisson-zèbre. L'étude proposée dans ce mémoire avait pour but de reproduire et d'optimiser une diète induisant l'obésité chez la larve de poisson-zèbre, ainsi que d'observer l'effet d'une diète riche en sucre et en gras sur la monocolonisation de l'intestin de la larve par la bactérie Escherichia coli isolé d'un enfant danois dans laquelle a été inséré un plasmide portant un gène codant pour la protéine fluorescente mCherry2. Les résultats démontrent qu'il est possible d'induire un développement similaire à de l'obésité chez la larve. Les critères utilisés (longueur, largeur, ratio largeur/longueur et aire) sont augmentés chez les larves ayant reçu la diète riche en sucre et en gras. De plus, les larves ayant reçu cette même diète présentent une colonisation bactérienne plus importante de leur intestin lors de l'observation en microscopie, mais ce résultat reste toutefois à confirmer par dénombrement bactérien.

L'utilisation de fluorofores sensibles au calcium permet de mesurer de manière non invasive l'activité des neurones. En effet, les potentiels d'actions font augmenter la concentration de calcium à l'intérieur d'une cellule, ce qui à son tour fait augmenter la fluorescence. Un dé important est de retrouver la séquence de potentiels d'actions à partir d'une mesure de fluorescence. Dans ce mémoire, nous verrons comment utiliser la fluorescence calcique pour déterminer une séquence de potentiels d'actions. Nous appliquons un algorithme basé sur l'algorithme de Viterbi et les chaînes de Markov à états cachés, développés par Deneux et al. À l'aide de cet algorithme, nous estimons les trains de potentiels d'actions ayant lieu dans un ensemble de neurones de poisson zèbres in vivo.

L’étude expérimentale de la résilience d’un réseau complexe repose sur la capacité à reproduire l’organisation structurelle et fonctionnelle du réseau à l’étude. Ayant choisi le réseau neuronal du poisson-zèbre larvaire comme modèle animal pour sa transparence, on peut utiliser des techniques telles que l’imagerie calcique par feuillet de lumière pour imager son cerveau complet plus de deux fois par seconde à une résolution spatiale cellulaire. De par les bonnes résolutions spatiale et temporelle, les données à segmenter représentent par le fait même un gros volume de données qui ne peuvent être traitées manuellement. On doit donc avoir recours à des techniques numériques pour segmenter les neurones et extraire leur activité.Trois techniques de segmentation ont été comparées, soit le seuil adaptatif (AT), la forêtd’arbres décisionnels (ML), ainsi qu’un réseau de neurones à convolution (CNN) déjà entrainé. Alors que la technique du seuil adaptatif permet l’identification rapide et presque sans erreurdes neurones les plus actifs, elle génère beaucoup plus de faux négatifs que les deux autres méthodes. Au contraire, la méthode de réseaux de neurones à convolution identifie plus deneurones, mais en effectuant plus de faux positifs qui pourront, dans tous les cas, être filtrés parla suite. En utilisant le score F1 comme métrique de comparaison, les performances moyennes de la technique de réseau de neurones (F1= 59,2%) surpassent celles du seuil adaptatif (F1= 25,4%) et de forêt d’arbres de décisions (F1= 48,8%). Bien que les performances semblent faibles comparativement aux performances généralement présentées pour les réseauxde neurones profonds, il s’agit ici d’une performance similaire à celle de la meilleure techniquede segmentation connue à ce jour, soit celle du 3dCNN, présentée dans le cadre du concours neurofinder (F1= 65.9%). / The experimental study of the resilience of a complex network lies on our capacity to reproduceits structural and functional organization. Having chosen the neuronal network of the larvalzebrafish as our animal model for its transparency, we can use techniques such as light-sheet microscopy combined with calcium imaging to image its whole brain more than twice every second, with a cellular spatial resolution. Having both those spatial and temporal resolutions, we have to process and segment a great quantity of data, which can’t be done manually. Wethus have to resort to numerical techniques to segment the neurons and extract their activity. Three segmentation techniques have been compared : adaptive threshold (AT), random deci-sion forests (ML), and a pretrained deep convolutional neural network. While the adaptive threshold technique allow rapid identification and with almost no error of the more active neurons, it generates many more false negatives than the two other methods. On the contrary, the deep convolutional neural network method identify more neurons, but generates more false positives which can be filtered later in the proces. Using the F1 score as our comparison metrics, the neural network (F1= 59,2%) out performs the adaptive threshold (F1= 25,4%) and random decision forests (F1= 48,8%). Even though the performances seem lower compared to results generally shown for deep neural network, we are competitive with the best technique known to this day for neurons segmentation, which is 3dCNN (F1= 65.9%), an algorithm presented in the neurofinder challenge.

Titre de l'écran-titre (visionné le 16 août 2023) / Certaines caractéristiques de la larve de poisson-zèbre, telles que sa petite taille et sa transparence optique, en font un modèle stratégique en neurophotonique, en particulier avec la perspective d'études de l'activité du cerveau entier à l'échelle cellulaire. Malgré le relativement petit nombre de neurones présents dans le cerveau du poisson-zèbre, son organisation comprend plusieurs régions anatomiquement, biochimiquement et fonctionnellement analogues à celles présentes chez d'autres vertébrés, incluant l'humain. Les comportements émergeant de cette organisation forment un registre riche ouvrant la porte à la recherche en neurosciences. Par exemple, le système dopaminergique du poisson-zèbre régule plusieurs fonctions analogues chez l'humain, telles que les émotions et les fonctions motrices. Au cours de mon projet, j'ai modifié puis optimisé un microscope à fluorescence par excitation à deux photons, ce qui m'a permis de mesurer l'activité de plus de 60 000 neurones dans une lignée de poisson-zèbre transgénique exprimant un indicateur de calcium fluorescent (GCaMP6s) panneuronal. Pour identifier les neurones dopaminergiques, j'ai fait appel au marquage immunohistochimique des larves fixées suivant leur imagerie calcique. En projetant la localisation des neurones marqués sur les données fonctionnelles par recalage d'images, j'ai pu quantifier l'activité neuronale de la population dopaminergique. Enfin, pour mesurer les manifestations comportementales correspondant à l'activité neuronale, j'ai intégré au microscope un montage incluant un écran, projetant des stimuli visuels, et une caméra haute vitesse, captant les battements de queue. Ce montage a permis de corréler le comportement de nage de spécimens avec l'activité de neurones dont la distribution spatiale est cohérente avec la littérature. Mes travaux de maîtrise ont ainsi mis en place un modèle intégré d'imagerie neuronale, de stimulation sensorielle, et de comportement chez la larve de poisson-zèbre qui permettra d'explorer le rôle des différents circuits neuronaux dans le fonctionnement du cerveau ainsi que l'influence de l'exposome sur leur fonction.

Le poisson zèbre Danio rerio a été utilisé dans cette étude comme organisme modèle, dans un projet visant à développer une méthode de confinement biologique des poissons d'élevage fondée sur les interactions entre la biotine et l'avidine. Les objectifs de cette thèse étaient de i) estimer les besoins en biotine chez le poisson zèbre; ii) étudier les effets d'une complémentation en biotine et en avidine sur la croissance, la survie, la conversion des aliments, le statut de la biotine et l'expression des gènes chez le poisson zèbre; iii) évaluer la contribution de la microflore intestinale dans l'approvisionnement en biotine chez le poisson zèbre; et iv) évaluer les effets de la biotine sur la reproduction du poisson zèbre. La première étude de cette thèse a démontré que la biotine est essentielle pour la croissance du poisson zèbre et que le niveau de biotine à inclure dans l'aliment pour une croissance maximale est de 0,51 mg kg-1 d'aliment. La seconde étude a confirmé le caractère essentiel de la biotine pour ce poisson, tel que démontré précédemment. Elle a aussi révélé que l’alimentation du poisson zèbre avec une ration contenant 60 fois plus d'avidine que le niveau requis de biotine induit des signes de carence en biotine. La troisième étude a suggéré que la synthèse microbienne intestinale est une source significative de biotine chez le poisson zèbre. Les poissons nourris avec la ration contenant un antibiotique (1% succinylsulfathiazole, masse/masse) ont présenté une croissance, une condition générale, des teneurs en biotine totale du corps, une survie et une utilisation des aliments moindres que ceux nourris avec les rations ne contenant pas d'antibiotique. Les résultats de la quatrième étude ont démontré que les mâles carencés en biotine présentent un faible indice gonado-somatique et de faibles qualité et quantité du sperme, tandis que les femelles carencées en biotine ont une faible fertilité. Les résultats de cette thèse ont fourni des informations de base pour la compréhension des interactions entre la biotine et l'avidine alimentaires chez le poisson zèbre. Ces données pourront servir à développer des stratégies de confinement biologique en utilisant ces interactions. / Zebrafish Danio rerio was used as model organism in the first step of a project aiming at developing a biological confinement method of farmed fish based on the interactions between biotin and avidin. The objectives of this thesis were i) to estimate the dietary biotin requirements of zebrafish; ii) to study the effects of dietary biotin and avidin on growth, survival, feed conversion, biotin status and gene expression in zebrafish; iii) to assess the contribution of the intestinal microflora to biotin supply in zebrafish, and iv) to investigate the effects of biotin on zebrafish reproduction. The first study of this thesis has demonstrated that biotin is essential for zebrafish growth and that the optimum dietary biotin requirement for maximal growth is 0.51 mg kg-1 diet. The second study confirmed the essentiality of biotin for zebrafish growth found in the first study. This study also revealed that feeding zebrafish a diet containing avidin in 60-fold excess of biotin requirement induces biotin deficiency signs in zebrafish such as retarded growth, high mortality, low condition factor, and decreased steady-state level of acetyl CoA carboxylase-A (acca) transcripts in the liver. The third study suggested that intestinal microbial synthesis is a significant source of biotin to zebrafish. Fish fed the antibiotic-supplemented diet (1% succinylsulfathiazole, mass/mass) showed lower growth, health condition, whole-body biotin content, survival and feed utilization than fish fed the biotin unsupplemented and biotin supplemented diets. The results of the fourth study demonstrated that dietary biotin affect both male and female reproductive performances; the biotin-deficient male showed lower gonadosomatic index as well as lower sperm quality and quantity, while biotin-deficient female showed reduced fertility. The results of this thesis constitute a baseline in the understanding of the interactions between dietary biotin and avidin in zebrafish nutrition on the one hand, and in the potential use of these interactions in order to develop a biological confinement strategy of farmed fish on the other hand.

Pouvoir visualiser de nouveaux éléments pathogéniques est un but standard dans la monde de l’imagerie médicale. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est le développement d’une modalité en microscopie optique qui permet la caractérisation de l’intégrité de la structure moléculaire de la myéline in vivo. Cet outil sera utilisé pour la recherche sur la sclérose en plaques. En utilisant la dépendance en polarisation présente en diffusion Raman cohérente, nous avons été en mesure de quantifier le degré d’ordre de la myéline. Représenter cet ordre à tous les pixels d’une image résulte en imagerie de la structure moléculaire. L’imagerie de la structure moléculaire de la myé- line est similaire à la microscopie électronique, sauf qu’elle peut être appliquée sur des tissus biologiques épais et vivants. L’indice qui décrit l’organisation de la myéline est l’amplitude de modulation. L’imagerie de la structure moléculaire a été utilisée pour étudier le modèle animal EAE de la sclérose en plaques. Un nouveau type de lésions focales de la membrane de myéline a été identifié. Aucune autre technique existante permet une description de l’organisation moléculaire de la myéline à une si grande échelle dans du tissu vivant. L’imagerie de la structure moléculaire de la myéline a aussi été utilisée pour l’étude du développement de la moelle épinière de dard-perches (zebrafish), une espèce de poisson, et pour évaluer l’impact de certaines drogues sur ce dernier. Nous avons pu mesurer une fine, mais néanmoins généralisée, réorganisation de la membrane de myéline et ce malgré l’absence de modification morphologique. Cette capacité d’observer de subtiles modifications de la myéline se révélera certainement utile pour l’étude de la remyélinisation. / Being able to visualize new pathogenic features is a gold standard in the biological imag- ing community. The principal goal of this master’s project is to develop a new optical microscopy modality capable of characterizing myelin molecular structural integrity in vivo. This tool is to be used in multiple sclerosis research. Using the polarization de- pendence of coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS), we were able to quantify the degree of myelin ordering. Mapping this ordering for every pixels in an image results in molecular structural imaging. Optical molecular structural imaging is, to some ex- tent, similar to electron microscopy, but has the distinct advantage that it can be used on thick and live tissue which provides better context. The index describing myelin ordering is the amplitude modulation. After a full analysis of the amplitude modula- tion, myelin molecular structural imaging was used to study the EAE animal model of multiple sclerosis. A new type of focal myelin membrane disruption was identified. No other existing technique can describe the myelin molecular structure at such a large scale and in live biological tissue. Myelin molecular imaging was also applied to study the spinal cord development in zebrafish. We were able to quantitatively describe a fine but nonetheless generalized reorganization of the myelin sheath through early stages of development although no microscopic morphological changes were apparent. This capacity of observing subtle myelin modification will certainly reveal itself useful in the monitoring of remyelination.

Congenital Hypothyroidism (CH) is the most common endocrine disorder, affecting one out of 2000-4000 newborns. Most CH are due to a defect in thyroid embryonic development and they can lead to severe phenotypes if not treated correctly. Multiple observations argue in favor of a genetic cause in a minority of thyroid dysgenesis, but to date, only few cases could be explained by a mutation in one of the genes coding for the factors known to be important in thyroid development and/or function (NKX2-1, PAX8, FOXE1, TSHR). This is the reason why it was important to develop new models allowing the discovery of new genes/mechanisms potentially implicated in the gland organogenesis. To that purpose, we set up in the laboratory a structure enabling the use of zebrafish as an animal model. The latter is indeed more and more used by developmental biologists, including by scientists interested in thyroid development.<p><p>The first step of our project consisted in a deeper characterization of the model, notably by the study of the expression patterns of the thyroid functional differentiation markers. Furthermore, the exact role of the Tsh/Tshr signaling – main regulator of thyroid growth and function in mammals – was dissected. In a second part of the project, we generated a stable transgenic line (tg(tg:mCherry)) allowing the visualization of thyroid development in living embryos and in a dynamic manner, thanks to real-time imaging techniques. On the one hand, this tool enabled us to better understand the morphological aspect of the different stages of thyroid development, such as the budding, evagination, relocalization or folliculogenesis. On the other hand, the use of double transgenic fishes obtained by crossing tg(tg:mCherry) with other lines expressing GFP in surrounding structures of interest, allowed us to highlight the contacts between the cardiovascular system and thyroid, and this along the whole gland development. The introduction of this model within the laboratory paves the way for the discovery and the study of thyroid intrinsic and extrinsic genes/mechanisms which might play a role on its development.<p><p>L’hypothyroïdie congénitale (HC) est une maladie relativement fréquente, touchant un nouveau-né sur 2000-4000. La majorité des HC sont dues à un défaut dans le développement embryonnaire de la glande, et peuvent mener à des phénotypes sévères si elles ne sont pas correctement traitées. Il existe plusieurs arguments en faveur d’une cause génétique dans une minorité de ces dysgénésies thyroïdiennes mais, à ce jour, seuls quelques cas ont pu être reliés à une mutation dans un des gènes codant pour des facteurs connus pour être importants dans le développement/la fonction de la glande (NKX2-1, PAX8, FOXE1, TSHR). C’est pour cette raison qu’il est important de développer de nouveaux modèles pouvant permettre la découverte de nouveaux gènes/mécanismes potentiellement impliqués dans l’organogénèse de la glande. A cette fin, nous avons mis en place au sein du laboratoire une structure permettant l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle animal. Ce dernier est en effet de plus en plus utilisé par les biologistes du développement, y compris par les scientifiques qui s’intéressent au développement thyroïdien.<p><p>La première étape de notre travail a consisté en une caractérisation approfondie du modèle, notamment par l’étude du réseau d’expression des marqueurs de différenciation fonctionnelle de la glande. En outre, le rôle exact de la signalisation par la TSH – principal régulateur de la croissance et de la fonction de la thyroïde des mammifères – a été étudié. Dans la deuxième partie du projet, nous avons généré une ligne transgénique stable (tg(tg:mCherry)) permettant la visualisation du développement thyroïdien dans des embryons vivants et ce, de manière dynamique, grâce au principe d’imagerie en temps réel. D’une part, cet outil nous a permis de mieux comprendre l’aspect morphologique des différentes étapes du développement thyroïdien, telles que la formation du bourgeon, l’invagination, la relocalisation ou la folliculogénèse. D’autre part, l’utilisation de poissons doublement transgéniques obtenus par le croisement de tg(tg:mCherry) avec d’autres lignées où les structures environnantes d’intérêt expriment la GFP nous a permis de mettre en avant les contacts entre le système cardiovasculaire et la thyroïde, et ce, tout au long de son développement. La mise en place de ce modèle au sein de notre laboratoire ouvre la voie à la découverte et à l’étude de mécanismes/gènes extrinsèques à la thyroïde mais pouvant jouer un rôle sur son développement. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished