京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第19935号 / 工博第4218号 / 新制||工||1652(附属図書館) / 33021 / 京都大学大学院工学研究科マイクロエンジニアリング専攻 / (主査)教授 小寺 秀俊, 教授 中部 主敬, 准教授 横川 隆司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DGAM

Neurodegenerative diseases have become one of the most common causes of death worldwide over the last couple of decades, with increasing tendency. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common neurodegenerative disease affecting specifically spinal (lower) and cortical (upper) motor neurons in the spinal cord and brainstem, respectively. It is usually a late onset disorder (average age of onset in Germany is 61 years) and leads to death within 2-5 years after symptoms onset due to respiratory failure. To date, there is no cure for ALS and only two drugs have been approved for its treatment, which prolong the lifespan for up to six months or slow down disease progression in a subpopulation of patients. About 90 % of ALS cases are sporadic, while about 10 % are familial and hence caused by mutations in specific genes, among them fused in sarcoma (FUS), a DNA- and RNA-binding protein. Mutations in FUS account for roughly 5 % of familial cases and occur predominantly in its nuclear localization sequence (NLS), such as the FUS-P525L mutation. Neurons expressing this variant display a strong cytoplasmic mislocalization of FUS and hence a loss of its nuclear function. Among other pathological events, defects in axonal transport along microtubules have been observed early in disease progression in several models of FUS-ALS, indicating its role as a major hallmark of the disease. However, the mechanism of how transport is impaired within these neurons remains unknown to date. This study aimed at investigating two possible mechanisms how the FUS-P525L mutant variant affects microtubule-based axonal transport. First, it was analyzed whether FUS directly interacts with microtubules or motors and if the mislocalized, mutant variant alters this interaction. Secondly, cytoplasmic mislocalized FUS-P525L can no longer fulfil its regular role in the splicing of pre-mRNAs, among them the mRNA coding for the microtubule-associated protein tau. This reportedly leads to an increased ratio of translated tau isoforms containing four microtubule binding repeats (4R) to those containing three repeats (3R). 4R tau isoforms are known to have a stronger binding affinity towards microtubules and may hence impair transport more severely by acting as a roadblock for motor proteins. Towards this end, this study investigated whether an increase in 4R:3R tau isoform ratio is sufficient to impair microtubule based transport. Axonal transport was reconstituted in vitro using a kinesin-1-dependent microtubule gliding assays, in which microtubules are propelled by surface-immobilized kinesin-1 motors. The assay was modified and optimized to operate sensitively and robust in the presence of complex solutions such as whole cell lysates and the microtubule gliding velocity analyzed as a measure for motility of the underlying motors. To determine the direct interaction of FUS variants with kinesin-1 or microtubules, recombinant human wildtype FUS-GFP and FUS-P525L-GFP was added to the assay. In addition, ALS patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) expressing the same FUS variants were differentiated towards spinal motor neurons and their cell lysates applied to this assay in order to determine whether FUS variants need endogenous adaptors or interaction partners to interfere with kinesin-1 motility on microtubules. Further, to investigate the interference of tau isoforms with kinesin-1 motility, recombinant human 2N3R tau-GFP and 2N4R tau-mScarlet was purified from insect cells and added to the modified kinesin-1-dependent microtubule gliding assay, either individually or combined at different ratios. In addition, the binding of these tau variants to microtubules was assessed. The kinesin-1-dependent microtubule gliding assays was modified to operate sensitively and robustly in the presence of β-glycerophosphate (to inhibit endogenous phosphatases in whole cell lysates), and methylcellulose (to prevent microtubule detachment from kinesin-1 motors due to presence of β-glycerophosphate). Under these conditions, neither recombinant human FUS-GFP nor endogenous FUS-GFP variants in lysates of spinal motor neurons bound to microtubules or interfered with kinesin-1 motility. In contrast, both tau isoforms used in the present study bound to microtubules and impaired kinesin-1 motility, while 2N4R tau-mScarlet was a much more potent inhibitor of microtubule gliding and displayed a 20-fold stronger binding affinity to microtubules compared to 2N3R tau-GFP. Interestingly, increasing ratios of 4R:3R tau isoforms impaired kinesin-1-dependent microtubule gliding. In addition, the presence of 2N4R tau-mScarlet strongly prevented 2N3R tau-GFP from binding to microtubules. This study provides evidence that neither wildtype FUS nor the FUS-P525L variant directly interfere with axonal transport by interacting with kinesin-1 motors or microtubules. Further, the present data suggests that neither FUS variant impedes kinesin-1 motility on microtubules by interacting with endogenous adaptor proteins present in cell lysates of iPSC-derived spinal motor neurons. Therefore, it is proposed that axonal transport defects are not directly caused by interaction of cytoplasmic mislocalized FUS with the motors or microtubules, but rather arise as a consequence of other pathological events triggered by mutant FUS variants. In particular, this study demonstrates that an increased ratio of 4R:3R tau isoforms is sufficient to impair kinesin-1 motility on microtubules due to increased decoration of microtubules with 4R tau isoforms, preventing 3R tau isoforms from binding to microtubules. This strongly suggests that an increased ratio of 4R:3R tau isoforms, since FUS no longer regulates splicing of tau pre-mRNA upon its cytoplasmic mislocalization, may be sufficient to cause or contribute to the axonal transport defects observed early in FUS-ALS pathology. / Neurodegenerative Erkrankungen sind in den letzten Jahrzehnten mit zunehmender Tendenz zu einer der häufigsten Todesursachen weltweit geworden. Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung, die spezifisch spinale (untere) und kortikale (obere) Motoneuronen im Rückenmark bzw. im Hirnstamm betrifft. Es handelt sich in der Regel um eine spät einsetzende Krankheit (das mittlere Erkrankungsalter in Deutschland beträgt 61 Jahre) und führt innerhalb von 2-5 Jahren nach Auftreten der Symptome zum Tod aufgrund von Atemversagen. Bisher gibt es keine Heilung für ALS und es wurden nur zwei Medikamente für die Behandlung zugelassen, die die Lebensdauer um bis zu sechs Monate verlängern oder das Fortschreiten der Krankheit bei einer Subpopulation von Patienten verlangsamen. Ungefähr 90% der ALS-Fälle sind sporadisch, während ungefähr 10% familiär sind und daher durch Mutationen in bestimmten Genen verursacht werden, darunter fused in sarcoma (FUS), einem DNA- und RNA-bindenden Protein. Mutationen in FUS machen etwa 5% der familiären Fälle aus und treten überwiegend in der Kernlokalisierungssequenz (NLS) auf, wie beispielsweise die FUS-P525L Mutation. Neuronen, die diese Mutante exprimieren, zeigen eine starke zytoplasmatische Fehllokalisierung von FUS und damit einen Verlust seiner Funktionen im Zellkern. Neben anderen pathologischen Ereignissen wurden in mehreren FUS-ALS Modellsystemen Defekte im Mikrotubuli-basierenden axonalen Transport früh im Krankheitsverlauf beobachtet, was auf seine Rolle als eines der Hauptmerkmale dieser Krankheit hindeutet. Der Mechanismus, wie der Transport innerhalb dieser Neuronen beeinträchtigt wird, ist jedoch bis heute unbekannt. Ziel dieser Studie ist es, zwei mögliche Mechanismen zu untersuchen, wie das mutierte FUS-P525L Protein den axonalen Transport entlang von Mikrotubuli beeinflusst. Zunächst wurde analysiert, ob FUS direkt mit Mikrotubuli oder Motorproteinen interagiert und ob zytoplasmatische fehllokalisierte FUS-P525L Protein diese Interaktion verändert. Ferner kann zytoplasmatische fehllokalisiertes FUS-P525L seine reguläre Rolle beim Spleißen von Prä-mRNAs nicht mehr erfüllen, darunter die mRNA, die für das mit Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau kodiert. Dies führt zu einem erhöhten Verhältnis von translatierten Tau-Isoformen, die vier Mikrotubuli-Bindestellen (4R) enthalten, zu solchen mit drei Bindestellen (3R). Es ist bekannt, dass 4R-Tau-Isoformen eine stärkere Bindungsaffinität zu Mikrotubuli im Vergleich zu 3R-Tau-Isoformen aufweisen und daher den Transport stärker beeinträchtigen können, indem sie als Hindernis für Motorproteine agieren. In dieser Studie wurde daher untersucht, ob eine Erhöhung des Verhältnisses von 4R:3R-Tau-Isoform ausreicht, um den Mikrotubuli-basierenden Transport zu beeinträchtigen. Der axonale Transport wurde in vitro unter Verwendung eines Kinesin-1-gestuerten Mikrotubuli Motilitätsassay rekonstruiert, bei welchem Mikrotubuli von darunterliegenden oberflächenimmobilisierte Kinesin-1 Motorproteinen transportiert werden, also über die Oberfläche gleiten. Der Assay wurde modifiziert und optimiert, um in Gegenwart komplexer Lösungen wie Ganzzelllysaten sensitiv und robust zu funktionieren, und die Gleitgeschwindigkeit der Mikrotubuli wurde als Maß für die Motilität der darunterliegenden Motoren analysiert. Um die direkte Wechselwirkung von FUS-Varianten mit Kinesin-1 Motorproteinen oder Mikrotubuli zu bestimmen, wurde dem Assay rekombinantes menschliches Wildtyp-FUS-GFP und FUS-P525L-GFP hinzugegeben. Zusätzlich wurden ALS-patientenspezifische, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), welche dieselben FUS-Varianten exprimieren, zu spinalen Motoneuronen differenziert und ihre Zelllysate in diesem Assay angewendet, um zu bestimmen, ob FUS-Varianten endogene Adapter oder Interaktionspartner für die Interaction mit Kinesin-1 oder Mikrotubuli benötigen. Um den Einfluss von Tau-Isoformen auf die Kinesin-1 Motilität zu untersuchen, wurde rekombinantes menschliches 2N3R Tau-GFP und 2N4R Tau-mScarlet aus Insektenzellen aufgereinigt und dem modifizierten Kinesin-1-gesteuerten Mikrotubuli Motilitätsassay entweder einzeln oder in unterschiedlichen Verhältnissen kombiniert hinzugegeben. Zusätzlich wurde die Bindung dieser Tau-Varianten an Mikrotubuli analysiert. Der Kinesin-1-gesteuerte Mikrotubuli Motilitätsassay wurden so modifiziert, dass er in Gegenwart von β-Glycerophosphat (zur Hemmung endogener Phosphatasen in Ganzzelllysaten) und Methylcellulose (zur Verhinderung der Ablösung von Mikrotubuli von Kinesin-1 Motoren aufgrund von β-Glycerophosphat) empfindlich und robust funktioniert. Unter diesen Bedingungen zeigten weder rekombinantes menschliches FUS-GFP noch endogene FUS-GFP-Varianten in Lysaten von spinalen Motoneuronen eine Wechselwirkung mit Mikrotubuli und beeinträchtigten auch nicht die Kinesin-1 Motilität. Im Gegensatz dazu banden beide in der vorliegenden Studie verwendeten Tau-Isoformen an Mikrotubuli und beeinträchtigten die Kinesin-1-Motilität, wobei 2N4R Tau-mScarlet das Gleiten von Mikrotubuli viel stärkerer beeinträchtigte und eine 20-fach stärkere Bindungsaffinität zu Mikrotubuli im Vergleich zu 2N3R Tau-GFP zeigte. Ferner beeinträchtigten steigende Verhältnisse von 4R:3R Tau-Isoformen über Kinesin-1 gleitende Mikrotubuli, während die Präsenz von 2N4R Tau-mScarlet die Bindung von 2N3R Tau-GFP an Mikrotubuli stark verminderte. Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass weder Wildtyp-FUS noch die FUS P525L-Variante den axonalen Transport direkt beeinflussen, da sie nicht mit Kinesin-1 Motorproteinen oder Mikrotubuli interagieren. Ferner legen die vorliegenden Daten nahe, dass keine der FUS-Varianten die Kinesin-1 Motilität auf Mikrotubuli durch Wechselwirkung mit endogenen Adapterproteinen behindert, die in Zelllysaten von iPSC-differenzierte spinalen Motoneuronen vorhanden sind. Dies legt nahe, dass axonale Transportdefekte nicht durch direkte Wechselwirkung von zytoplasmatisch fehllokalisiertem FUS Protein mit Motorproteinen oder Mikrotubuli verursacht werden, sondern als Folge anderer pathologischer Ereignisse auftreten, die durch mutierte FUS-Varianten entstehen. Insbesondere zeigt diese Studie, dass ein erhöhtes Verhältnis von 4R:3R Tau-Isoformen ausreicht, um die Kinesin-1 Motilität auf Mikrotubuli zu behindern. Dies geschieht vermutlich aufgrund der erhöhten Bindung von 4R Tau-Isoformen an Mikrotubuli, weil dadurch die Bindung von 3R Tau-Isoformen an Mikrotubuli verhindert wird. Dies deutet stark darauf hin, dass ein erhöhtes Verhältnis von 4R:3R Tau-Isoformen, verursacht durch die fehlende regulatorische Beteiligung von FUS am Spleißen von Tau-Prä-mRNA aufgrund der zytoplasmatischen Fehllokalisation von FUS, wahrscheinlich zu den axonalen Transportdefekten beiträgt, die früh in der FUS-ALS-Pathologie beobachtet wurden.