Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont impliquées dans les phénomènes de résistance aux traitements et de récidives dans les cancers du sein. Les neurotrophines comprennent le NGF et le BDNF, synthétisés sous forme de pro-neurotrophines. Elles se lient au récepteur commun p75NTR et à TrkA ou TrkB, fixant préférentiellement une (pro)neurotrophine. Récemment, le laboratoire Inserm U908 a démontré que le NGF/proNGF sont capables d’enrichir plusieurs lignées épithéliales cancéreuses de sein en CSC. L’objectif de ma thèse était de comprendre le rôle des neurotrophines dans la régulation des CSC de sein chez l’homme et dans le modèle canin. Nous avons montré que le BDNF/proBDNF peuvent également enrichir des lignées cancéreuses de sein en CSC in vitro. De plus, l’enrichissement en CSC induit par le NGF implique p75NTR et TrkA tandis que les effets du proNGF impliquent également EphA2.Sur 96 tumeurs mammaires canines issues de la biobanque d’OCR (Oncovet Clinical Research, Lille Métropole, France), nous avons montré par immunohistochimie que le phénotype CD44+/CD24- seul n’est pas adapté pour détecter les CSC. CD24 est associé à des paramètres clinicopathologiques défavorables. Le proNGF, TrkA, et le BDNF sont exprimés dans une majorité des tumeurs, mais ne sont pas associés avec des paramètres clinicopathologiques. P75NTR et TrkB sont associés à des paramètres clinicopathologiques favorables et à une meilleure survie globale. De plus, p75NTR semble être un marqueur de cellules myoépithéliales. Ces résultats sont en accord avec les données obtenues dans le cancer du sein, soulignant la pertinence du modèle canin dans le développement de nouvelles thérapies ciblées. / Cancer stem cells (CSC) are implied in resistance to treatment and recurrences in breast cancer. Neurotrophins include NGF and BDNF, synthetized as proneurotrophins. They bind to common receptor p75NTR and to TrkA or TrkB, which bind specifically one (pro)neurotrophin. Recently, INSERM U908 demonstrated that NGF/proNGF are able to enrich several breast cancer cell lines in CSC. The objective of my PhD was to better understand the role of neurotrophins in the regulation of breast cancer stem cells both in human breast cancer and in the canine model.We showed that BDNF/proBDNF could also enrich the pool of CSC in several breast cancer cell lines in vitro. Furthermore, the action of NGF on the enrichment of CSC pool is mediated by p75NTR and TrkA, while the effects of proNGF also depend on EphA2. On 96 paraffin-embedded canine mammary tumors samples coming from the biobank of OCR (Oncovet Clinical Research, Lille Métropole, France), we showed by immunohistochemistry that the phenotype CD44+/CD24- alone is not suitable to detect CSC. CD24 is associated with poor clinicopathological parameters. ProNGF, TrkA and BDNF are expressed in a majority of tumors, but are not associated with clinicopathological parameters. Positive correlation between P75NTR and TrkB expression and favorable clinicopathological parameters as well as better overall survival has been observed. Moreover, p75NTR seems to be a marker of myoepithelial cells. These results are consistent with the results obtained in human breast cancer, which underlines the relevance of the canine model in the development of new targeted therapies.

Lors de ma thèse, je me suis intéressée à la recherche d’altérations somatiques dans deux sarcomes : le sarcome histiocytaire (SH) et le dermatofibrosarcome protubérant (DP). Pour étudier ces cancers sur les plans moléculaire et thérapeutique le chien apparaît comme un modèle naturel unique. En effet, il développe spontanément des cancers homologues aux cancers humains avec de fortes prédispositions raciales. De plus, le chien partage notre environnement et est l’espèce la mieux suivie médicalement après l’Homme, ce qui en fait un modèle de tumeurs spontanées inégalable. Le SH est rare chez l’Homme, mais fréquent dans une race de chien en particulier : le bouvier bernois. Ce cancer a fait l’objet d’études antérieures dans l’équipe et dans ce contexte j’ai identifié des mutations somatiques récurrentes dans 102 cas de SH canin. Un gène de la voie MAPK a particulièrement retenu notre attention, je l’ai retrouvé muté dans 54 cas de SH canin, soit 53%. En collaboration avec le « groupe de travail des histiocytoses humaines », nous avons aussi montré la présence de mutations de ce gène dans 1 cas sur 16 cas de SH humain. Par la suite, j’ai (1) montré le rôle activateur de ces mutations de la voie MAPK dans le SH (2) ciblé cette voie de signalisation par 4 molécules inhibitrices sur 8 lignées cellulaires de SH canin, dont 7 développées dans l’équipe. J’ai alors montré que le tramétinib possédait le meilleur potentiel thérapeutique pour le SH, et l’équipe projette maintenant de tester cette molécule dans un essai préclinique chez le chien. En ce qui concerne le DP, c’est un fibrosarcome déjà bien décrit chez l’Homme mais dont le diagnostic n’est pas réalisé en médecine vétérinaire. J’ai pu mettre en évidence, dans un cas de DP canin, l’existence d’une fusion de gènes similaire à la fusion pathognomonique des DP humains. En effet, cette fusion implique les mêmes mécanismes : des points de cassures similaires, plaçant le gène PDGFB sous le contrôle du promoteur d’un gène de collagène, et a pour conséquence une surexpression du facteur de croissance PDGFB. Une thérapie ciblée étant utilisée pour les DP humains porteurs de cette fusion, nous supposons qu’elle pourrait l’être aussi pour les DP canins. Ainsi, ces travaux ont permis de mieux caractériser ces sarcomes sur le plan moléculaire et ouvrent des perspectives diagnostiques et thérapeutiques profitant à la recherche translationnelle à fois en médecine vétérinaire et humaine. / During my thesis I searched for somatic alterations in two sarcomas: histiocytic sarcoma (HS) and dermatofibrosarcoma protuberans (DP). To study these cancers on the molecular and therapeutic aspects, the dog appears as a unique natural model. Indeed, dogs spontaneously develop cancers that are homologous to human cancers with strong racial predispositions. In addition, dogs share our environment and it is the species with the best medical care after humans. HS is rare in humans, but frequent in a particular dog breed: Bernese mountain dog. This cancer has been the subject of previous studies in the team and in this context I identified recurrent somatic mutations in 102 cases of canine HS. A gene of the MAPK pathway has caught our attention, I found mutations in 53% of canine HS cases. In collaboration with the “working group on human histiocytosis”, we also showed the presence of mutations of this gene in 1 case out of 16 human cases of HS. Subsequently, I showed the activating role of these mutations in the MAPK pathway and I targeted this pathway by 4 inhibiting molecules on 8 canine HS cell lines, including 7 developed in the team. I then highlighted the trametinib with the best therapeutic potential for HS and the team now plans to test this molecule in preclinical assays in dogs. Regarding the DP, it is a fibrosarcoma already well described in humans but the diagnosis is not routinely made in veterinary medicine. In one case of canine DP, I was able to highlight the existence of a similar gene fusion to the pathognomonic fusion of the human DP. Indeed, this fusion involves the same mechanisms: similar breakpoints placing the PDGFB gene under the control of the promoter of a collagen gene, resulting in the overexpression of the growth factor PDGFB. A targeted therapy is available for human patients carrying this gene fusion; thus, we suppose it could also be used in therapy for canine DP. In conclusion, this work has further characterized these sarcomas at the molecular level and now opens diagnostic and therapeutic opportunities, benefiting to the translational research in both veterinary and human medicine.

L'espèce canine (Canis lupus familiaris) rassemble plus de 350 races issues d'une sélection artificielle drastique menée par l'Homme au cours des derniers siècles. De ce fait, chaque race peut être considérée comme un isolat génétique développant chacune des affections génétiques de manière spontanée avec parfois de fortes fréquences. Ainsi, l'espèce canine constitue un modèle puissant pour identifier les gènes et allèles responsables de ces affections homologues à certaines maladies génétiques humaines. Mon premier projet a porté sur la recherche des causes génétiques de deux kératodermies plantaires chez le terrier irlandais et le dogue de Bordeaux. En combinant plusieurs analyses d'association (GWAS : « Genome Wide Association Study ») et des techniques de séquençage NGS (Next Generation Sequencing), un nouveau gène muté a été identifié pour le terrier irlandais. Concernant les dogues de Bordeaux, nous avons génotypé plus de 170 000 SNPs sur plus de 200 dogues. Une analyse de liaison génétique a permis d'identifier un locus de 20 Mb sur le chromosome 9 contenant un cluster de kératines. En combinant les données cliniques et génétiques, la kératine 16 s'avérait le meilleur gène candidat. Son séquençage complet a permis d'identifier une mutation complexe générant une protéine tronquée. Des analyses de PCR quantitatives ont révélé que ce gène muté était sous exprimé chez les individus atteints. Ce travail nous permet donc de proposer cette race de chien comme le premier modèle animal spontané de kératodermie focale non-épidermolytique (FNEPPK). En parallèle de ce projet, j'ai mené des recherches sur les bases moléculaires d'un syndrome d'automutilation acrale décrit dans plusieurs races. Cette neuropathie est homologue aux neuropathies héréditaires sensitives et autonomes (HSANs) chez l'Homme et se caractérise par une perte de sensibilité à la douleur au niveau des membres. A partir d'un GWAS, j'ai pu identifier un locus de 1,5 Mb chez le chien, dont l'orthologue humain n'est pas encore décrit chez des patients HSANs. Le séquençage complet de ce locus a mené à l'identification d'un variant situé dans une région cis-enhancer en amont d'un gène candidat. La mise en évidence d'une sous-expression du gène candidat indique que ce variant régulateur semblerait modifier l'activité de l'enhancer nous permettant de le proposer comme la mutation causale chez le chien. Cette découverte offre donc de nouvelles perspectives de recherche pour des patients humains atteints de neuropathies héréditaires sensitives. En combinant des approches génétiques complémentaires sur des modèles spontanés de maladies bien caractérisées chez le chien, j'ai pu participer à l'identification de trois nouveaux gènes, dont deux excellents candidats pour ces maladies homologues humaines. Le troisième représente un vrai modèle spontané de kératodermie K16, ouvrant ainsi des perspectives thérapeutiques qui bénéficieront à l'Homme et au chien. / The dog species (Canis lupus familiaris) contains more than 350 distinct breeds resulting from human drastic selection during the last centuries. Each breed can then be considered as a genetic isolate, developing specific spontaneous genetic diseases with high frequencies. Thus, dogs constitute a powerful model to identify new genes and alleles involved in disorders homologous to human diseases. For my thesis, I worked on two main topics. The first one focused on the search of the genetic causes of two footpad keratodermas in the Irish terrier and the dogue de Bordeaux breeds. Concerning the Irish terrier, the work was conduced by Tosso Leeb’s team in the University of Berne, in collaboration with the Antagene Company. Using a Genome Wide Association Study (GWAS) and Next Generation Sequencing (NGS), the mutation in a new gene has been identified in footpad hyperkeratosis in this breed. For the dogue de Bordeaux project, we genotyped more than 170 000 SNPs on over 200 dogs. We then performed a genetic linkage study with a subset of 68 dogs, including 14 affected dogs. We identified a significant locus of 20 Mb on the canine chromosome 9 containing one keratin cluster. Comparing clinical, histopathological and immunochemistry data, keratin 16 appeared as an excellent candidate. The sequencing of the gene revealed a complex mutation leading to a non-functional truncated K16 protein. Quantitative RT-PCR analyses showed a strong decrease of the level of KRT16 expression in affected footpads. These results led to propose the dogue de Bordeaux footpad hyperkeratosis as the first spontaneous model of focal non-epidermolytic palmoplantar keratoderma (FNEPPK). In parallel, I studied an acral mutilation syndrome described in several hunting dog breeds. This neuropathy corresponds to human hereditary sensory and autonomic neuropathies (HSANs) and is characterized by an insensitivity to pain only in the limb. With a classical GWAS strategy, using 24 affected and 30 unaffected dogs, we identified a 1.5 Mb locus in dogs, the human orthologous locus being still unknown in human patients. Targeted sequencing of this locus revealed one single variant localized in a cis-enhancer region closed to a strong candidate gene. A lower level of expression of the candidate gene in affected dogs seems to show a functional effect of the mutation in the enhancer activity. These results led to propose this variant as the causative mutation for this canine neuropathy, and so this canine model as an opportunity to identify a new human HSAN gene. Combining complementary genetic approaches on spontaneous models of well characterized canine diseases, I did participated to the identification of three new genes, two of which being novel excellent candidates for the homologous human diseases. The third represents a true homologous model of KRT16 human keratoderma, opening the field to the development of new treatments benefiting to both humans and dogs.

La malformation de Chiari type 1 (MCI) est une anomalie congénitale de la jonction cranio-cérébrale fréquente avec une incidence de 1:1280. MCI est caractérisée par la descente des amygdales cérébelleuses à travers le foramen magnum et est souvent associée à la syringomyélie. Les causes de cette maladie semblent être multifactorielles incluant des facteurs génétiques. La MCI est similaire à une malformation fréquente chez la race des Griffon Bruxellois (GB) connue sous le nom de Malformation Chiari-like (MCL). Le modèle canin offre l’avantage d’une forte homogénéité génétique réduisant ainsi la complexité de la maladie et facilitant l’identification d’un locus causatif. Une étude d’association du génome entier sur une cohorte de 56 GB suivie d’une cartographie fine sur une cohorte de 217 GB a identifié un locus fortement associé à la MCL sur le chromosome 2 (22 SNPs, valeur P= 7 x 10-8) avec un haplotype de 1.9 Mb plus fréquent chez les non affectés. Une seconde étude d’association du génome entier sur une cohorte de 113 GB a permis d’identifier un 2 ème locus fortement associé à la MCL sur le chromosome 13 (25 SNPs , valeur P= 3 x 10 -7) avec un haplotype de 4 Mb surreprésenté chez les non affectés. Ces régions candidates constituent la première étape vers l’identification de gènes causatifs pour la MCL. Notre étude offre un point d’entrée vers une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-tendant la pathogénèse de la MCI humaine. / Chiari I malformation (CMI) represents a common congenital abnormality of the craniocerebral junction with an estimated incidence of 1 in 1280. CMI is characterized by a descent of the cerebellar tonsils into the foramen magnum, often in association with syringomyelia. The developmental defect in CMI is thought to be the result of an underdeveloped occipital bone and small posterior fossa. The etiology of CMI is thought to be multifactorial involving genetic factors. CMI in humans is similar to a condition in the dog called Chiari-like malformation (CM) that is particularly common in the Griffon Bruxellois (GB) breeds. A genome wide association study on a 56 GB cohort followed by a fine mapping in a 217 GB cohort have identified a locus on chromosome 2 that was strongly associated with CM (22 SNPs, P value= 7 x 10-8). Haploview analysis of this locus identified a haplotype of 1.9 Mb that was more frequent in non-affected dogs. A second genome wide association study in a 113 GB cohort lead to the identification of another locus on chromosome 13 that was strongly associated with CM (25 SNPs , P value= 3 x 10-7). Analysis of this region identified a 4Mb haplotype that was more frequent in non-affected dogs. Our study constitutes the first essential step towards identification of the causative genes in CM. Our study provides an entry point for better understanding of the molecular genetic mechanisms underlying the pathogenesis of human CMI.

La malformation de Chiari type 1 (MCI) est une anomalie congénitale de la jonction cranio-cérébrale fréquente avec une incidence de 1:1280. MCI est caractérisée par la descente des amygdales cérébelleuses à travers le foramen magnum et est souvent associée à la syringomyélie. Les causes de cette maladie semblent être multifactorielles incluant des facteurs génétiques. La MCI est similaire à une malformation fréquente chez la race des Griffon Bruxellois (GB) connue sous le nom de Malformation Chiari-like (MCL). Le modèle canin offre l’avantage d’une forte homogénéité génétique réduisant ainsi la complexité de la maladie et facilitant l’identification d’un locus causatif. Une étude d’association du génome entier sur une cohorte de 56 GB suivie d’une cartographie fine sur une cohorte de 217 GB a identifié un locus fortement associé à la MCL sur le chromosome 2 (22 SNPs, valeur P= 7 x 10-8) avec un haplotype de 1.9 Mb plus fréquent chez les non affectés. Une seconde étude d’association du génome entier sur une cohorte de 113 GB a permis d’identifier un 2 ème locus fortement associé à la MCL sur le chromosome 13 (25 SNPs , valeur P= 3 x 10 -7) avec un haplotype de 4 Mb surreprésenté chez les non affectés. Ces régions candidates constituent la première étape vers l’identification de gènes causatifs pour la MCL. Notre étude offre un point d’entrée vers une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-tendant la pathogénèse de la MCI humaine. / Chiari I malformation (CMI) represents a common congenital abnormality of the craniocerebral junction with an estimated incidence of 1 in 1280. CMI is characterized by a descent of the cerebellar tonsils into the foramen magnum, often in association with syringomyelia. The developmental defect in CMI is thought to be the result of an underdeveloped occipital bone and small posterior fossa. The etiology of CMI is thought to be multifactorial involving genetic factors. CMI in humans is similar to a condition in the dog called Chiari-like malformation (CM) that is particularly common in the Griffon Bruxellois (GB) breeds. A genome wide association study on a 56 GB cohort followed by a fine mapping in a 217 GB cohort have identified a locus on chromosome 2 that was strongly associated with CM (22 SNPs, P value= 7 x 10-8). Haploview analysis of this locus identified a haplotype of 1.9 Mb that was more frequent in non-affected dogs. A second genome wide association study in a 113 GB cohort lead to the identification of another locus on chromosome 13 that was strongly associated with CM (25 SNPs , P value= 3 x 10-7). Analysis of this region identified a 4Mb haplotype that was more frequent in non-affected dogs. Our study constitutes the first essential step towards identification of the causative genes in CM. Our study provides an entry point for better understanding of the molecular genetic mechanisms underlying the pathogenesis of human CMI.