A exposição excessiva à radiação Ultravioleta (UV) resulta em manifestações clínicas à pele humana como queimaduras, fotoenvelhecimento e câncer. A radiação UVA, preferencialmente, induz à formação de espécies reativas de oxigênio, enquanto que a radiação UVB é absorvida diretamente pelo DNA. Apesar de mecanismos endógenos auxiliarem na prevenção/reparação dos danos causados pela radiação UV, quando o dano excede a capacidade de reparação celular, diversos efeitos lesivos ocorrem na pele como alterações da matriz dérmica, resposta inflamatória e desidratação do estrato córneo. O uso de compostos fenólicos com atividade antioxidante pode auxiliar na prevenção das consequências patológicas da exposição à radiação UV. O presente trabalho teve como objetivo estudar em cultura de células da pele (HaCaT -queratinócito humano imortalizado e FHPD - fibroblasto humano primário dermal) exposta às radiações UVA e UVB a atividade fotoprotetora de 3 compostos fenólicos, ácido cafeico (AC), clorogênico (ACG) e rosmarínico (AR). Inicialmente, células HaCaT e FHPD cultivadas em monocamada foram expostas às doses crescentes de radiação UVA ou UVB e, após 24 horas, foram analisadas quanto a viabilidade, marcadores de morte celular, mediadores inflamatórios, presença de aquaporina e lesões de DNA. HaCaT quando exposta às radiações UVA e UVB são conduzidas à morte por apoptose, com aumento de Caspases 3 e 9, p53 e redução de PARP. Após a exposição à radiação UVA, HaCaT responde com aumento na liberação de IL-6, TNF-α e COX-2, internalização/redução de AQP3 da membrana, redução na liberação de MMP-2 e 9, aumento na liberação de MMP-1 e na produção de ERO. Quando expostos à radiação UVB, HaCaT aumenta a liberação de IL-6 e COX-2, promove internalização/redução de AQP3 na membrana e redução na liberação de MMP-2 e 9. FHPD são menos sensíveis à exposição a ambas as radiações, mostrando redução de viabilidade com parada de ciclo apenas frente à radiação UVA. Além disto, FHPD exposto a radiação UVA responde com aumento na liberação de IL-6 e danos no DNA do tipo 8-oxo-dG. Dentre os compostos, o ACG apresentou melhor atividade fotoquimioprotetora perante ambas as radiações UVA e UVB, pois foi capaz de reverter em HaCaT a morte celular induzida por ambas as radiações e de reverter a parada de ciclo em FHPD expostos à radiação UVA. HaCaT tratado com ACG e exposto à radiação UVA responde com aumento na expressão de AQP3 e PARP, aumento na expressão gênica de AQP3, redução na expressão gênica de CDKN1A e na liberação de MMP-1, 2 e 9. Após a radiação UVB, o tratamento com ACG aumenta a expressão gênica de AQP3, reduz a expressão gênica de CDKN1A, reduz a produção de COX-2 e aumenta a liberação de MMP-2 e 9. O tratamento com o AR apresentou atividade fotoquimioprotetora frente à radiação UVA, com HaCaT respondendo a radiação com aumento na população de células viáveis, aumento na expressão de AQP3 e PARP e na expressão gênica de AQP3, redução na liberação de MMP-1 e 9 e redução na produção de COX-2. FHPD tratados com AR apresentaram aumento na população em fase G1, na expressão de p21, e redução de danos de DNA tipo 8-oxo-dG. O tratamento de HaCaT com AC foi capaz de reverter a morte celular, aumentar a expressão de p53 e aumentar a liberação de MMP-2 e 9 frente à radiação UVB e de reduzir a produção de ERO, a expressão de p21 e a liberação de MMP-1, 2 e 9 frente à radiação UVA. Para FHPD, o tratamento com AC foi capaz apenas de reduzir a formação de danos de DNA tipo 8-oxo-dG. Os resultados indicam que o modelo proposto foi capaz de discriminar a atividade fotoprotetora dos compostos frente à radiação UVA e UVB. Além disto, foi possível demonstrar que os compostos antioxidantes se comportam de maneira distinta enquanto fotoprotetores no modelo empregado. / Excessive exposure to Ultraviolet radiation (UV) results in clinical manifestations in human skin such as burns, photo-aging and cancer. UVA radiation preferentially induces formation of reactive oxygen species, while UVB radiation is absorbed directly by the DNA. Although endogenous mechanisms are able to prevent/repair cellular damages caused by UV radiation, excess cellular damage retains cells repair capacity and also results on diverse harmful effects on skin, such as, changes in the dermal matrix, inflammatory response and dehydration of the stratum corneum. The use of phenolic compounds with antioxidant activity may help preventing pathological conditions caused by UV radiation. This work aimed to study the photoprotective activity of three phenolic compounds, caffeic (CA), chlorogenic (CGA) and rosmarinic acid (RA) in human skin cells (HaCaT - immortalized human keratinocytes and HDSF - human dermal skin fibroblast) exposed to UVA and UVB radiation. Initially, HDSF and HaCaT cells were exposed to increasing doses of UVA and UVB radiation. After 24 hours of exposure, we evaluated cell viability, cell death, inflammatory mediators, aquaporin and DNA damage. Exposure to UVA and UVB radiation in HaCaT cells results on apoptotic cell death, with an increase of caspases 3 and 9, p53 and reduction of PARP. HaCaT cells when exposed to UVA radiation resulted on increased levels of IL-6, TNF-α and COX-2, internalization of the membrane AQP3, reduction of MMP-2 and MMP-9 release, increase of MMP-1 and ROS production. After UVB radiation, HaCaT cells resulted on an increase of IL-6 and COX-2 production, it also promoted internalization of membrane AQP3 and reduced release of MMP-2 and 9. HDSF were less sensitive to both radiations. Moreover, HDSF resulted in cell viability decrease and cell cycle arrest only after UVA radiation. Furthermore, HDSF when exposed to UVA radiation resulted on an increase of IL-6 production and in DNA damage (8-oxo-dG). Among the studied compounds, CGA presented better photochemiprotective activity towards UVA and UVB radiation. Also, this compound was able to reverse cell death in HaCaT after exposure to both radiations and inhibited cell cycle arrest in HDSF after UVA radiation exposure. HaCaT cells treated with CGA and exposed to UVA radiation resulted on an increase in AQP3 and PARP expression, increased in AQP3 gene expression, reduction in CDKN1A gene expression and reduction in MMP-1, 2 and 9 release. After UVB radiation, GCA treatment increases AQP3 gene expression, reduces CDKN1A gene expression, reduces COX-2 production and increase MMP-2 and 9 releases. The AR treatment showed photochemiprotective activity towards the effects of UVA radiation, with HaCaT responding with an increase on cells viability, increased in PARP and AQP3 expression and in AQP3 gene expression, decreased MMP-1 and 9 releases and reduced COX-2c production. HDSF when treated with AR showed an increase in G1 phase population, in p21 expression and reduced DNA damage-type 8-oxo-dG. HaCaT cells treated with AC reversed cell death, increased p53 expression and increased MMP-2 and 9 releases after UVB radiation and reduced ROS production, p21 expression and MMP -1, 2, 9 release after UVA radiation. HDSF treated with AC was only able to reduce the formation of 8-oxodG DNA damage. These results indicated that the proposed model was able to discriminate the photochemiprotective activity of the studied compounds against the UVA and UVB radiation. In addition, it was demonstrated that the each studied antioxidant have different photoprotective mode of action.

A exposição excessiva à radiação Ultravioleta (UV) resulta em manifestações clínicas à pele humana como queimaduras, fotoenvelhecimento e câncer. A radiação UVA, preferencialmente, induz à formação de espécies reativas de oxigênio, enquanto que a radiação UVB é absorvida diretamente pelo DNA. Apesar de mecanismos endógenos auxiliarem na prevenção/reparação dos danos causados pela radiação UV, quando o dano excede a capacidade de reparação celular, diversos efeitos lesivos ocorrem na pele como alterações da matriz dérmica, resposta inflamatória e desidratação do estrato córneo. O uso de compostos fenólicos com atividade antioxidante pode auxiliar na prevenção das consequências patológicas da exposição à radiação UV. O presente trabalho teve como objetivo estudar em cultura de células da pele (HaCaT -queratinócito humano imortalizado e FHPD - fibroblasto humano primário dermal) exposta às radiações UVA e UVB a atividade fotoprotetora de 3 compostos fenólicos, ácido cafeico (AC), clorogênico (ACG) e rosmarínico (AR). Inicialmente, células HaCaT e FHPD cultivadas em monocamada foram expostas às doses crescentes de radiação UVA ou UVB e, após 24 horas, foram analisadas quanto a viabilidade, marcadores de morte celular, mediadores inflamatórios, presença de aquaporina e lesões de DNA. HaCaT quando exposta às radiações UVA e UVB são conduzidas à morte por apoptose, com aumento de Caspases 3 e 9, p53 e redução de PARP. Após a exposição à radiação UVA, HaCaT responde com aumento na liberação de IL-6, TNF-α e COX-2, internalização/redução de AQP3 da membrana, redução na liberação de MMP-2 e 9, aumento na liberação de MMP-1 e na produção de ERO. Quando expostos à radiação UVB, HaCaT aumenta a liberação de IL-6 e COX-2, promove internalização/redução de AQP3 na membrana e redução na liberação de MMP-2 e 9. FHPD são menos sensíveis à exposição a ambas as radiações, mostrando redução de viabilidade com parada de ciclo apenas frente à radiação UVA. Além disto, FHPD exposto a radiação UVA responde com aumento na liberação de IL-6 e danos no DNA do tipo 8-oxo-dG. Dentre os compostos, o ACG apresentou melhor atividade fotoquimioprotetora perante ambas as radiações UVA e UVB, pois foi capaz de reverter em HaCaT a morte celular induzida por ambas as radiações e de reverter a parada de ciclo em FHPD expostos à radiação UVA. HaCaT tratado com ACG e exposto à radiação UVA responde com aumento na expressão de AQP3 e PARP, aumento na expressão gênica de AQP3, redução na expressão gênica de CDKN1A e na liberação de MMP-1, 2 e 9. Após a radiação UVB, o tratamento com ACG aumenta a expressão gênica de AQP3, reduz a expressão gênica de CDKN1A, reduz a produção de COX-2 e aumenta a liberação de MMP-2 e 9. O tratamento com o AR apresentou atividade fotoquimioprotetora frente à radiação UVA, com HaCaT respondendo a radiação com aumento na população de células viáveis, aumento na expressão de AQP3 e PARP e na expressão gênica de AQP3, redução na liberação de MMP-1 e 9 e redução na produção de COX-2. FHPD tratados com AR apresentaram aumento na população em fase G1, na expressão de p21, e redução de danos de DNA tipo 8-oxo-dG. O tratamento de HaCaT com AC foi capaz de reverter a morte celular, aumentar a expressão de p53 e aumentar a liberação de MMP-2 e 9 frente à radiação UVB e de reduzir a produção de ERO, a expressão de p21 e a liberação de MMP-1, 2 e 9 frente à radiação UVA. Para FHPD, o tratamento com AC foi capaz apenas de reduzir a formação de danos de DNA tipo 8-oxo-dG. Os resultados indicam que o modelo proposto foi capaz de discriminar a atividade fotoprotetora dos compostos frente à radiação UVA e UVB. Além disto, foi possível demonstrar que os compostos antioxidantes se comportam de maneira distinta enquanto fotoprotetores no modelo empregado. / Excessive exposure to Ultraviolet radiation (UV) results in clinical manifestations in human skin such as burns, photo-aging and cancer. UVA radiation preferentially induces formation of reactive oxygen species, while UVB radiation is absorbed directly by the DNA. Although endogenous mechanisms are able to prevent/repair cellular damages caused by UV radiation, excess cellular damage retains cells repair capacity and also results on diverse harmful effects on skin, such as, changes in the dermal matrix, inflammatory response and dehydration of the stratum corneum. The use of phenolic compounds with antioxidant activity may help preventing pathological conditions caused by UV radiation. This work aimed to study the photoprotective activity of three phenolic compounds, caffeic (CA), chlorogenic (CGA) and rosmarinic acid (RA) in human skin cells (HaCaT - immortalized human keratinocytes and HDSF - human dermal skin fibroblast) exposed to UVA and UVB radiation. Initially, HDSF and HaCaT cells were exposed to increasing doses of UVA and UVB radiation. After 24 hours of exposure, we evaluated cell viability, cell death, inflammatory mediators, aquaporin and DNA damage. Exposure to UVA and UVB radiation in HaCaT cells results on apoptotic cell death, with an increase of caspases 3 and 9, p53 and reduction of PARP. HaCaT cells when exposed to UVA radiation resulted on increased levels of IL-6, TNF-α and COX-2, internalization of the membrane AQP3, reduction of MMP-2 and MMP-9 release, increase of MMP-1 and ROS production. After UVB radiation, HaCaT cells resulted on an increase of IL-6 and COX-2 production, it also promoted internalization of membrane AQP3 and reduced release of MMP-2 and 9. HDSF were less sensitive to both radiations. Moreover, HDSF resulted in cell viability decrease and cell cycle arrest only after UVA radiation. Furthermore, HDSF when exposed to UVA radiation resulted on an increase of IL-6 production and in DNA damage (8-oxo-dG). Among the studied compounds, CGA presented better photochemiprotective activity towards UVA and UVB radiation. Also, this compound was able to reverse cell death in HaCaT after exposure to both radiations and inhibited cell cycle arrest in HDSF after UVA radiation exposure. HaCaT cells treated with CGA and exposed to UVA radiation resulted on an increase in AQP3 and PARP expression, increased in AQP3 gene expression, reduction in CDKN1A gene expression and reduction in MMP-1, 2 and 9 release. After UVB radiation, GCA treatment increases AQP3 gene expression, reduces CDKN1A gene expression, reduces COX-2 production and increase MMP-2 and 9 releases. The AR treatment showed photochemiprotective activity towards the effects of UVA radiation, with HaCaT responding with an increase on cells viability, increased in PARP and AQP3 expression and in AQP3 gene expression, decreased MMP-1 and 9 releases and reduced COX-2c production. HDSF when treated with AR showed an increase in G1 phase population, in p21 expression and reduced DNA damage-type 8-oxo-dG. HaCaT cells treated with AC reversed cell death, increased p53 expression and increased MMP-2 and 9 releases after UVB radiation and reduced ROS production, p21 expression and MMP -1, 2, 9 release after UVA radiation. HDSF treated with AC was only able to reduce the formation of 8-oxodG DNA damage. These results indicated that the proposed model was able to discriminate the photochemiprotective activity of the studied compounds against the UVA and UVB radiation. In addition, it was demonstrated that the each studied antioxidant have different photoprotective mode of action.

Na etapa inicial do desenvolvimento de novos fármacos, a avaliação do metabolismo e da toxicidade é fundamental para definir seu potencial emprego como candidato a fármaco. Nestes estudos, diversos modelos in vitro são empregados, dentre eles linhagens de hepatoma humano. Entretanto, uma grande limitação ao uso deste modelo in vitro é a baixa expressão das enzimas do sistema citocromo P450. O carotenóide bixina, componente majoritário do anato (urucum), apresentou em estudos in vivo, a capacidade de induzir algumas isoformas do sistema citocromo P450, com a vantagem de apresentar baixa toxicidade. Neste trabalho, a fração lipossolúvel do anato (bixina) e hidrossolúvel (norbixina) foram avaliadas como indutores do sistema citocromo P450 em linhagens de hepatoma humano. Ensaios de MTT, empregando as linhagens HepG2, C3A e SK-HEP-1 indicaram que bixina e norbixina em concentrações abaixo de 0,22 mM são seguras quanto à citotoxicidade. A expressão dos genes CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 e 3A4 foi avaliada, através de ensaios de RT-PCR em tempo real, em linhagens de hepatoma humano submetidas a tratamento com os compostos bixina e norbixina. Os resultados mostraram que células HepG2 e C3A tratadas com bixina nas concentrações de 0,05 e 0,1 mM, por períodos de 24 e 48 horas, apresentaram aumento de expressão da CYP 1A1 e CYP 1A2. Porém, a exposição de células HepG2 e C3A ao composto norbixina não resultou em aumento de expressão das isoformas avaliadas neste estudo. Os resultados deste trabalho indicaram o potencial emprego de bixina como agente indutor das CYPs 1A1 e 1A2, em linhagens de hepatoma humano utilizadas como modelo in vitro, para estudo de compostos cuja metabolização envolva uma destas vias, entretanto, estudos adicionais são fundamentais, a fim de avaliar a ação deste composto sobre outras isoformas do sistema citocromo P-450, bem como outros sistemas enzimáticos. / In the early development stage of the new drugs, the pharmacological and toxicological properties are critical to define the potential use of the candidate drug. During this stage, several in vitro models systems are employed, including human hepatoma cell lines. However, the main limitation of the use of cell lines as in vitro model is the low expression level of cytochrome P450 enzymes. A carotenoid knowed as bixin, the main pigment in the annatto (urucum), it has been reported to induce some isoforms of cytochrome P450 in rats, with the advantage of its low toxicity. In this work, the oil-soluble (bixin) and aqueous soluble extracts (norbixin) were evaluated as inducers of the cytochrome P450 system in human hepatoma cell lines (HepG2, C3A, SK-HEP-1). The results of MTT assays showed that bixin concentrations below 0.22 mM were not cytotoxic in HepG2, C3A and SK-HEP-1 cell lines. Expression changes in CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 and 3A4 were evaluated, by real time RT-PCR and the results showed that the exposition to 0,05 mM and 0,1 mM bixin, for 24 and 48 hours of treatment, lead to an increase in CYP 1A1 and CYP 1A2 expression level. By contrast, the cytochrome P450 isoforms were not affected by the exposition to norbixin. In conclusion, this work indicated the potential use of bixin induced hepatoma cell lines as in vitro model for studies of biotransformation and toxicity of drugs involving CYP 1A, however, further studies are necessary to evaluate the effect of bixin on the other cytochrome P450 isoforms as well as other enzymatic systems.

Na etapa inicial do desenvolvimento de novos fármacos, a avaliação do metabolismo e da toxicidade é fundamental para definir seu potencial emprego como candidato a fármaco. Nestes estudos, diversos modelos in vitro são empregados, dentre eles linhagens de hepatoma humano. Entretanto, uma grande limitação ao uso deste modelo in vitro é a baixa expressão das enzimas do sistema citocromo P450. O carotenóide bixina, componente majoritário do anato (urucum), apresentou em estudos in vivo, a capacidade de induzir algumas isoformas do sistema citocromo P450, com a vantagem de apresentar baixa toxicidade. Neste trabalho, a fração lipossolúvel do anato (bixina) e hidrossolúvel (norbixina) foram avaliadas como indutores do sistema citocromo P450 em linhagens de hepatoma humano. Ensaios de MTT, empregando as linhagens HepG2, C3A e SK-HEP-1 indicaram que bixina e norbixina em concentrações abaixo de 0,22 mM são seguras quanto à citotoxicidade. A expressão dos genes CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 e 3A4 foi avaliada, através de ensaios de RT-PCR em tempo real, em linhagens de hepatoma humano submetidas a tratamento com os compostos bixina e norbixina. Os resultados mostraram que células HepG2 e C3A tratadas com bixina nas concentrações de 0,05 e 0,1 mM, por períodos de 24 e 48 horas, apresentaram aumento de expressão da CYP 1A1 e CYP 1A2. Porém, a exposição de células HepG2 e C3A ao composto norbixina não resultou em aumento de expressão das isoformas avaliadas neste estudo. Os resultados deste trabalho indicaram o potencial emprego de bixina como agente indutor das CYPs 1A1 e 1A2, em linhagens de hepatoma humano utilizadas como modelo in vitro, para estudo de compostos cuja metabolização envolva uma destas vias, entretanto, estudos adicionais são fundamentais, a fim de avaliar a ação deste composto sobre outras isoformas do sistema citocromo P-450, bem como outros sistemas enzimáticos. / In the early development stage of the new drugs, the pharmacological and toxicological properties are critical to define the potential use of the candidate drug. During this stage, several in vitro models systems are employed, including human hepatoma cell lines. However, the main limitation of the use of cell lines as in vitro model is the low expression level of cytochrome P450 enzymes. A carotenoid knowed as bixin, the main pigment in the annatto (urucum), it has been reported to induce some isoforms of cytochrome P450 in rats, with the advantage of its low toxicity. In this work, the oil-soluble (bixin) and aqueous soluble extracts (norbixin) were evaluated as inducers of the cytochrome P450 system in human hepatoma cell lines (HepG2, C3A, SK-HEP-1). The results of MTT assays showed that bixin concentrations below 0.22 mM were not cytotoxic in HepG2, C3A and SK-HEP-1 cell lines. Expression changes in CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 and 3A4 were evaluated, by real time RT-PCR and the results showed that the exposition to 0,05 mM and 0,1 mM bixin, for 24 and 48 hours of treatment, lead to an increase in CYP 1A1 and CYP 1A2 expression level. By contrast, the cytochrome P450 isoforms were not affected by the exposition to norbixin. In conclusion, this work indicated the potential use of bixin induced hepatoma cell lines as in vitro model for studies of biotransformation and toxicity of drugs involving CYP 1A, however, further studies are necessary to evaluate the effect of bixin on the other cytochrome P450 isoforms as well as other enzymatic systems.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T17:20:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_RafaellaFabianaCarneiro_M.pdf: 1664553 bytes, checksum: 346b9075da4d999b30fc615fe83733fd (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neisseria meningitdis, ou meningococo, é uma bactéria comensal da nasofaringe humana. Contudo, algumas linhagens meningocócicas ocasionalmente ultrapassam a mucosa respiratória e a barreira hematoencefálica e causam enfermidades como meningite e septicemia. Como a espécie humana é o único hospedeiro natural para esse patógeno, estudos in vitro com modelos celulares são uma ferramenta importante para a análise da interação entre o meningococo e seu hospedeiro. Este trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes linhagens de N. meningitidis na adesão celular, morfologia e expressão de quimiocinas inflamatórias em culturas in vitro de células humanas. Tais parâmetros também foram avaliados em um sistema in vitro de co-cultura celular entre células de origem nervosa e endotelial a fim de mimetizar a barrreira hematoencefálica humana. Os resultados obtidos indicam que a adesão de diferentes linhagens bacterianas em células humanas de sítios específicos do processo infeccioso do meningococo, como Hep-2 (laringe), NCIH460 (pulmão), Hec1b (endotelial) e NG97 (neuroglia) foi capaz de mimetizar o processo fisiopatológico deste microrganismo. Em condições in vitro, células de origem nervosa mostraram-se mais suscetíveis à infecção nos parâmetros avaliados como uma elevada expressão de TNF-?, quimiocina característica em infecções meningocócicas. A linhagem B4 destacou-se entre as linhagens meningocócicas estudadas, apresentando elevados percentuais de adesão em células humanas com valor máximo de adesão em NG97. Células HEp-2 apresentaram poucas alterações morfológicas significativas frente à infecção por N. meningitidis. Tais resultados podem estar associados ao fato do trato respiratório superior ser o habitat natural do meningococo, no qual a interação entre este patógeno e as células hospedeiras seja comensal e não-invasiva. O modelo mimético de barreira hematoencefálica, realizado em transwell, indicou comunicação entre as células que o compõem e uma maior expressão dos níveis de quimiocinas inflamatórias quando comparada à infecção desta bactéria por cada uma das células estudadas isoladamente. Tal modelo foi capaz de mimetizar a barreira hematoencefálica, fato o que torna possível sua aplicação em estudos da passagem de fármacos e outros patógenos por essa barreira. / Abstract: Neisseria meningitidis,or meningococci, is a commensal bacterium of the human nasopharynx. However, occasionally some meningococcal strains can cross the respiratory mucosa and the blood-brain barrier and cause life-threatening diseases such as meningitis and septicaemia. Since the human species is the only natural host for this pathogen, in vitro studies with cellular models are an important tool for the analysis of the meningococci and its host. The aim of this present work was to value the influence of several strains of N. meningitidis in cellular adhesion, morphology and inflammatory chemokines expression in human cells cultivated in vitro. These parameters were also evaluated in a co-cultivated cellular system with glial and endothelial cells aiming mimicking the human blood brain barrier. The results indicate that the adhesion of different bacterial strains from specific sites of infectious process of meningococci as Hep-2 (larynges), NCIH460 (lung), Hec1b (endothelial) and NG97 (glial cells) was capable of mimicking, partially, the pathophysiology of this microorganism. In in vitro conditions, cells from nervous origin showed more susceptibility to infection then others in this evaluated parameters such as a high TNF-? expression, a common chemokine in meningococcals diseases. The B4 strain distinguished from the others by presenting high rates of adhesion in human cells with maximum value on NG97. HEp-2 cells showed few expressives morphologic alterations after meningococcal infection. These results may be associated with the fact that the upper human respiratory tract is the meningoccci natural habitat, in which the interaction between this pathogen and host cells are commensal and not-invasive.The mimicking blood-brain barrier model, performed in transweel, has demonstrated some communication between the cells and greater expression of inflammatory chemokines when compared to the infection in isolated cells. This model was capable of mimicing the blood-brain barrier, which makes its application possible in studies of drugs and others pathogens who might crossover though this barrier. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

O Transtorno Depressivo Maior (TDM) é uma condição neuropsiquiátrica que resulta em um substancial sofrimento pessoal, incapacidade e custos sociais. Devido à inacessibilidade ao encéfalo humano por questões práticas, éticas e às limitações encontradas pelo uso de modelos animais, o desenvolvimento de modelos in vitro acurados torna-se fundamental para o estudo desta doença. Neste aspecto, o surgimento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) apresenta-se como uma importante ferramenta, uma vez que permite a recapitulação da diversidade genética dos pacientes e possibilita a produção de tipos celulares de interesse para o estudo da doença, como neurônios e glia. Entretanto, até o momento, não há registros da produção de modelos in vitro a partir de hiPSCs de pacientes com TDM. Visando preencher esta lacuna, o presente estudo teve por objetivo a produção e caracterização de dois tipos de modelos in vitro a partir de hiPSCs de pacientes com TDM: neurônios serotoninérgicos, uma cultura celular em monocamada, e organóides cerebrais, uma cultura celular em suspensão. 5 linhagens de hiPSCs de pacientes foram diferenciadas em neurônios com sucesso e no ensaio de imunocitoquímica, expressaram os marcadores 5-HT (serotonina), T5-HT (transportador de serotonina), nestina (presente em diferentes tipos de células neuronais) e Tuj1 (proteína do citoesqueleto, neurônio-específica), confirmando o fenótipo de neurônios serotoninérgicos. As céluas diferenciadas obtiveram também resultados positivos nos testes de imageamento de cálcio e de medidas da alteração no potencial de membrana, indicando que os neurônios diferenciados eram fisiologicamente funcionais. De 5 linhagens de hiPSCs (sendo uma controle e as outras 4 de pacientes com TDM), somente 1 linhagem sobreviveu ao processo de diferenciação, originando organóides cerebrais e apresentou expressão dos marcadores Sox2 (progenitoras neurais) e Tuj1 (neurônios maduros), indicando ainda uma estruturação correta da citoarquitetura, com as progenitoras localizadas mais internamente, na zona ventricular, ao redor dos lúmens preenchidos com líquido e com os neurônios maduros localizados na placa cortical, região mais externa dos agregados celulares. Apesar de o processo de produção dos organóides cerebrais necessitar de aperfeiçoamento e melhor padronização, a produção destes dois tipos de modelos in vitro, feitos a partir de hiPSCs de pacientes com TDM configura-se como um importante passo para a futura redução do uso de modelos animais em pesquisa, elucidação de mecanismos subjacentes à doença, identificação de biomarcadores diagnósticos e triagem de fármacos de maneira personalizada, visando permitir tratamentos mais baratos, adequados e eficientes para o TDM / Major Depressive Disorder (MDD) is a neuropsychiatric condition that results in substantial personal distress, disability, and social costs. The inaccessibility to the human brain due to practical and ethical issues and the limitations encountered by the use of animal models turn the development of accurate in vitro models into an essential factor to study this disease. In this regard, the emergence of human induced pluripotent stem cell technology (hiPSCs) is an important tool, since it allows the recapitulation of patient\'s genetic diversity and allows the production of cell types of interest for studying the disease, such as neurons and glia. However, to date, there are no records of the production of in vitro models from hiPSCs of patients with MDD. In order to fill this gap, the present study aimed at the production and characterization of two types of in vitro models from hiPSCs of patients with MDD: serotonergic neurons, a monolayer cell culture, and cerebral organoids, a suspension cell culture. 5 patients\' hiPSCs lines were successfully differentiated into neurons and, in the immunocytochemistry assay, they expressed the 5-HT (serotonin), T5-HT (serotonin transporter), nestin (present in several neuronal cell types) and Tuj1 (cytoskeleton protein, neuron-specific), confirming the phenotype of serotonergic neurons. Differentiated cells also obtained positive results in calcium imaging tests and measurements of membrane potential changes, indicating that differentiated neurons were physiologically functional. Of 5 hiPSCs lines (one control and the other 4 of patients with MDD), only 1 survived to the differentiation process, originating cerebral organoids which presented expression of Sox2 (neural progenitor) and Tuj1 (mature neurons) markers and a correct structuring of the cytoarchitecture, with the progenitors located more internally in the ventricular zone, around the lumens filled with liquid and with the mature neurons located in the cortical plate, the outermost region of the cellular aggregates. Although the cerebral organoids production process needs improvement and better standardization, the production of these two types of in vitro models, made from hiPSCs of patients with MDD, is an important step for the future reduction of animal models use, elucidation of disease underlying mechanisms, identification of diagnostic biomarkers and drug screening in a personalized manner, in order to allow cheaper, more adequate and more efficient treatments for MDD