La modification posttranscriptionnelle des acides ribonucléiques (ARNs) est une étape de maturation conservée dans tous les domaines du vivant. Mes travaux de thèse ont porté sur la caractérisation fonctionnelle et structurale de flavoenzymes impliquées dans la modification des ARN de transfert (ARNt) : les dihydrouridines synthases (Dus) dictant la formation de dihydrouridine via la flavine mononucléotide (FMN) et TrmFO responsable de la méthylation en C5 de l'uridine 54 via la flavine adénosine dinucléotide (FAD) ainsi que le methylènetétrahydrofolate. Afin d'élucider le mécanisme de TrmFO, nous avons élaboré une apoenzyme grâce à une simple mutation qui est efficacement reconstituée in vitro. Nous avons chimiquement synthétisé l'intermédiaire catalytique qui consiste en un FAD-iminium comportant un methylène sur le N5 de l'isoalloxazine. Cette espèce synthétique a été caractérisée par spectrométrie de masse et absorption UV-visible. La reconstitution de TrmFO avec cette molécule restore l'activité in vitro sur un ARNt transcrit prouvant le rôle du FAD comme agent méthylant via une méthylation réductrice. Dus2 réduit spécifiquement U20 et est constituée d'un Dus domaine néanmoins, chez les mammifères un double-stranded RNA-binding domaine (dsRBD) est présent. Afin de comprendre la fonction de cette organisation modulaire, nous avons montré que seule l'enzyme sauvage est active contrairement aux domaines isolés. Nous avons résolu les structures cristallographiques des deux domaines suggérant une redistribution des charges positives en surface. Ce dsRBD dicte la reconnaissance de l'ARNt en se fixant à la tige acceptrice/Tpsi. Ceci est régulé par une extension N-terminal, mis en évidence par des mutations, des titrations RMN ainsi qu’une structure cristallographique en complexe avec un ARN de 22 nucléotides. Ce travail illustre l’acquisition d’un dsRBD au cours de l’évolution dont la fonction est étendu à la reconnaissance des ARNts. / Posttranscriptional modification of ribonucleic acids (RNAs) is a crucial maturation step conserved in all domains of life. During my thesis, I have brought structural and functional insights on flavoenzymes involved in transfer RNA (tRNA) modifications: dihydrouridine synthase (Dus) responsible for dihydrouridine formation using flavin mononucleotide (FMN) and TrmFO responsible for C5 methylation of uridine position 54 relying on flavin adenosine dinucleotide (FAD) and methylenetetrahydrofolate. To elucidate the chemical mechanism of TrmFO we designed an apoprotein via a single mutation that could be reconstituted in vitro with FAD. Furthermore, we chemically synthesized the postulated intermediate active species consisting of a flavin iminium harboring a methylene moiety on the isoalloxazine N5 that was further characterized by mass spectrometry and UV-visible spectroscopy. Reconstitution of TrmFO with this molecule restored in vitro activity on a tRNA transcript proving that TrmFO uses FAD as a methylating agent via a reductive methylation.Dus2 reduces U20 and is comprised of a canonical Dus domain however, mammals have an additional double-stranded RNA-binding domain (dsRBD). To bring functional insight for this modular organization, we showed that only full length human Dus2 was active while its isolated domains were not. tRNA recognition is driven by the dsRBD via binding the acceptor and TΨ stem of tRNA with higher affinity then dsRNA as evidenced by NMR. We further solved the X-ray structures for both domains showing redistribution of surface positive charges justifying the involvement of this dsRBD for tRNA recognition in mammalian Dus2. This was attributed to a peculiar N-terminal extension proven by mutational analysis and an X-ray structure of dsRBD in complex with 22-nucleotide dsRNA. Altogether our work illustrates how during evolution, Dus2 enzymes acquired an engineered dsRBD for efficient tRNA binding via a ruler mechanism.