Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Una consecuencia común de las enfermedades cardiovasculares es la remodelación cardíaca, que se caracteriza por cambios en el tamaño, forma y función del corazón. El infarto agudo al miocardio es la causa más común que desencadena un proceso de remodelado. El daño causado por el proceso isquémico conduce a la activación de receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a daño (PRR), y de mediadores celulares y humorales de la respuesta inflamatoria en el tejido. En relación a esto, se ha reportado que el receptor tipo toll-4 (TLR-4), un tipo de PRR, tiene un papel clave en la función cardiaca luego de un infarto, mientras que el aumento en la expresión de las moléculas de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y vascular 1 (VCAM-1), en el tejido cardiaco se ha asociado a una mayor adhesión e infiltración leucocitaria y a un mal pronóstico de la función cardiaca. En fibroblastos cardiacos (FC) se ha demostrado que TLR-4 reconoce patrones moleculares asociados a daño y que su activación conduce a la secreción de citoquinas proinflamatorias, sin embargo los efectos sobre la expresión de moléculas de adhesión no han sido determinados. En esta memoria se estudió el rol del TLR-4 en la expresión ICAM-1 y VCAM-1 en FC de rata adulta e indagó las vías de señalización involucradas en dicha expresión. El tratamiento con lipopolisacárido (LPS) 1 μg/mL aumentó los niveles de ICAM-1 y VCAM-1 de manera tiempo dependiente, observándose en cada caso un aumento significativo a las 24 hrs. Por otra parte, LPS aumentó de forma temprana la fosforilación de NF-κB, ERK1/2, y JNK, mientras que p-38 y Akt sólo mostraron una tendencia a aumentar a partir de los 5 min. La utilización de los inhibidores TAK-242, PD98059 y SP600125, revirtieron el aumento en los niveles de ambas proteínas, mientras que los inhibidores BAY117085, LY294002 y SB202190 no lo los revirtieron. En resumen, nuestros resultados demostraron que la activación del TLR-4 en FC, gatilla un aumento en los niveles de ICAM-1 y VCAM-1 a través de las vías de señalización ERK1/2 y JNK / The cardiac remodeling is a common consequence of the ECV, and is characterized by changes in the size, shape and function. Moreover the acute myocardial infarction is the most common cause of remodeling. The damage caused by the ischemic process leading to activation of pattern recognition receptors (PRR), and humoral and cellular mediators of the inflammatory response in the tissue. In regards to this Toll like receptor-4 (TLR-4) has been described has a key mediator of cardiac function after myocardial infarction, while the increase in intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) in cardiac tissue has been linked to increased adhesion and leukocyte infiltration and poor prognosis of cardiac function. In cardiac fibroblast TLR4 is capable to recognize danger associated molecular patterns and release pro-inflammatory cytokines, however their role in ICAM-1/VCAM-1 expression remain unknown. In this study we have determined the ability of TLR-4 to increased ICAM-1/VCAM-1 protein level in adult rat cardiac fibroblast and investigated the potential mechanisms underlying this induction. Treatment with LPS 1 μg/ml resulted in a time-dependent increased of ICAM-1 / VCAM-1 protein level. Furthermore, NF-κB, ERK1/2 and JNK were rapidly phosphorylated by LPS, while p-38 and Akt showed a tendency to increase from 5 min. We also found that inhibition of ERK1/2 and JNK pathways prevented LPS–induced ICAM-1 and VCAM-1 protein level, whereas NF-κB, p-38 and Akt inhibition did not. In summary, these findings demonstrate that the increased ICAM-1/VCAM-1 protein level by TLR-4 activation is regulated via the ERK1/2 and JNK pathways, in cultured cardiac fibroblasts / Fondecyt FONDAP ACCDiS

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardíacos (FC) se encargan de mantener tanto la estructura como la mecánica y la señalización del corazón. A estas células se les conoce como células centinela, pues responden de manera variada y compleja a fin de mantener la homeostasis, jugando un rol clave dentro de este proceso. Dicha respuesta se lleva a cabo mediante una maquinaria conformada por una amplia red de receptores, entre ellos los receptores tipo-toll y, en particular, el TLR4 (del inglés toll like receptor 4). Este receptor presenta patrones de reconocimiento que le permite responder a diversos ligando, los que pueden ser exógenos como el lipopolisacárido bacteriano (LPS) o endógenos como el heparan sulfato (HS). Ambos estímulos han mostrado mediar respuestas inflamatorias y fibróticas tanto en FC, como en otros tejidos. Sin embargo, en esta memoria se abordará específicamente el rol de HS como estímulo desencadenante de estas respuestas. Como modelo experimental se usaron FC de ratas neonatas y adultas (FCN y FCA). Estudios previos demuestran que, en FC, LPS modifica los niveles proteicos de la citoquina pro inflamatoria IL-1β, así como de proteínas de adhesión celular y vascular (ICAM-1 y VCAM-1, respectivamente) y de la proteína alfa actina del músculo liso (α-SMA). Esta última proteína constituye un marcador de diferenciación de fenotipo FC-MFC (miofibroblasto cardíaco), que se expresa en estados patológicos, como ocurre luego de un infarto cardíaco. Para el caso de HS existe evidencia que indica que es un agonista del TLR4, pero no se han medido las variaciones de IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 ni de α-SMA a nivel cardíaco; siendo uno de los objetivos del presente trabajo demostrar si esto ocurre. Para despejar tal interrogante se medirán los niveles de las proteínas mencionadas. También se evaluarán las vías de señalización PI3K/Akt, Erk1/2 y NF-κB de TLR4, comparando efectos inducidos por LPS y HS, a fin de comprobar si el aumento de VCAM-1 y la disminución de α-SMA en FC, es mediada por alguna de estas vías de señalización que involucran al receptor. En conclusión, en FCN y FCA, tanto HS como LPS inducen cambios en los niveles proteicos de IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 y α-SMA, lo que resalta las propiedades proinflamatorias y antifibróticas de ambos estímulos tras la activación de TLR4 / Heart structure, mechanism and signaling is supported by cardiac fibroblast (CF). These cells are named sentinel cells, because they respond in complex and different manner to mantein homeostasis, playing a key role in this process. This action is due to a mechanism that involves a bread spectrum of receptors, including the toll like receptors especially TLR4 (toll like receptor 4). This receptor has recognition patterns, wich allow to answer to several stimulus, like bacterian lipopolysaccharide (LPS) and heparan sulphate (HS), exogenous and endogenous stimulus respectively. Both of them has shown to mediate fibrotics and inflamatories reponses, in CF and others tissues. However, in this study we will present the HS responses in adults and neonates animal fibroblasts (ACF and NCF). According to literature, in CF, LPS changes on IL-1β levels, a proinflamatory citoquine; ICAM-1 y VCAM-1 (intercellular and vascular adhesion molecule) and finally the α-SMA protein (α-smoth muscle actin), responsible for cardiac tissue integrity and main fibroblast-myofibroblast differentiation master, expressed in pathological stage, such as heart infarct. In relation with HS, there is evidence that it is a TLR4 agonist, but IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 and α-SMA variations has not been determinated. In this work we will perform these experiments. Besides the analysis of these proteins, we will study the PI3K/Akt, ERK1/2 and NF-κB signaling pathways implicated in the VCAM-1 increase and α-SMA decrease in ACF, via TLR4, as well as the receptor blockade in order to demostrate if these effects are mediated by this receptor, by comparing the effects of HS and LPS. In conclusion, as HS as LPS induced changes in IL-1β, ICAM-1, VCAM-1 and α-SMA protein levels, in NCF and ACF. Therefore the antifibrotics and proinflamatories properties of the two stimulus after the activation of TLR4 are demonstrated