Ce travail de thèse est principalement axé sur le développement d’une nouvelle méthode de manipulation de vortex d’Abrikosov individuels dans les supraconducteurs de type II. Cette méthode, rapide, efficace et précise, est basée sur l’optique en champ lointain et repose sur l’échauffement local du supraconducteur sous l’action d’un faisceau laser focalisé. Elle apporte une excellente alternative aux techniques existantes de manipulation de vortex, toutes basées sur l’utilisation de sondes locales, et donc intrinsèquement lentes et difficiles à mettre en oeuvre dans un environnement cryogénique. La combinaison de cette méthode à une technique d’imagerie magnéto-optique performante permet de déplacer des vortex individuels avec un taux de réussite de 100% et sur de grandes échelles limitées uniquement par le champ de l’objectif de microscope. Les vitesses de manipulation atteintes sont élevées, de l’ordre de 10 mm.s-1, mais encore limitées par l’instrumentation utilisée et loin des limites fondamentales offertes par cette méthode, estimées au km.s-1. La méthode de manipulation optique permet aussi de mesurer la distribution des forces de piégeage de chaque vortex d’un échantillon. En utilisant des puissances de chauffage laser permettant de dépasser localement la température critique, nous avons également pu étudier la pénétration des vortex à l’interface entre une zone normale et une zone supraconductrice.Durant ces travaux, nous avons aussi eu l’opportunité de mettre en évidence, par spectroscopie de molécules uniques, l’effet flexomagnétoélectrique dans un matériau multiferroïque, en employant un supraconducteur de type I comme générateur de champ magnétique inhomogène. Enfin, nous proposons à la fin de ce mémoire un concept de jonction Josephson créée tout optiquement, et dont les propriétés seraient contrôlables en temps réel par laser. / This thesis focuses on the development of a new manipulation technique to handle single Abrikosov vortices in type II superconductors. This fast, efficient and precise method is based on far field optics and rests on the local temperature elevation produced by a focused laser beam. It brings an excellent alternative to the existing techniques which are all based on local probes and thus heavy to implement in a cryogenic environment. The combination of this method with an efficient magneto-optical imaging system allows us to manipulate single vortices with a 100% rate of success on a large scale only limited by the field of view of the microscope objective. Manipulation speeds are high, of the order of 10 mm.s-1, but still limited by our setup and far from the fundamental limits offered by this technique, estimated to the km.s-1. This manipulation technique also allows to measure the pinning force of any single vortex in a superconducting sample. By using a high enough laser power which locally pushes the temperature above the critical temperature, we could also study the vortex penetration at the interface between normal and superconducting areas.In the course of this work, we also evidenced, with single molecule spectroscopy, the flexomagnetoelectric effect in a multiferoic material, by using a type I superconductor as a source of inhomogeneous magnetic field. Finally, we propose at the end of the manuscript the new concept of an optically created Josephson junctions, whose properties could be controlled in real time just with a laser beam.

La microscopie optique est un outil indispensable pour la recherche de la neurobiologie et médecine qui permet l’étude des cellules dans leur environnement natif. Les processus sous-cellulaires restent néanmoins cachés derrière les limites de la résolution optique, ce qui rend la résolution des structures plus petites que ~300nm impossible. Récemment, les techniques de la localisation des molécules individuelles (SML) ont permis le suivi des protéines de l’échelle nanométrique grâce à l’ajustement des molécules uniques à la réponse impulsionnelle du système optique. Ce processus dépend de la quantité de lumière recueilli et rend ces techniques très sensibles aux imperfections de la voie d’imagerie, nommé des aberrations, qui limitent l’application de SML aux cultures cellulaires sur les lamelles de verre. Un système commercial d’optiques adaptatives est implémenté pour compenser les aberrations du microscope, et un flux de travail est défini pour corriger les aberrations dépendant de la profondeur qui rend la 3D SML possible dans les milieux biologiques complexes. Une nouvelle méthode de SML est présentée qui utilise deux objectifs pour détecter le spectre d’émission des molécules individuelles pour des applications du suivi des particules uniques dans 5 dimensions (x,y,z,t,λ) sans compromis ni de la résolution spatiotemporelle ni du champ de vue. Pour faciliter les analyses de manière quantitative des Go de données générés, le développement des outils biochimiques, numériques et optiques est présenté. Ensemble, ces approches ont le but d’amener l’imagerie quantitative des molécules uniques dans les échantillons biologiques complexes / Optical microscopy is an indispensable tool for research in neurobiology and medicine, enabling studies of cells in their native environment. However, subcellular processes remain hidden behind the resolution limits of diffraction-limited optics which makes structures smaller than ~300nm impossible to resolve. Recently, single molecule localization (SML) and tracking has revolutionized the field, giving nanometer-scale insight into protein organization and dynamics by fitting individual fluorescent molecules to the known point spread function of the optical imaging system. This fitting process depends critically on the amount of collected light and renders SML techniques extremely sensitive to imperfections in the imaging path, called aberrations, that have limited SML to cell cultures on glass coverslips. A commercially available adaptive optics system is implemented to compensate for aberrations inherent to the microscope, and a workflow is defined for depth-dependent aberration correction that enables 3D SML in complex biological environments. A new SML technique is presented that employs a dual-objective approach to detect the emission spectrum of single molecules, enabling 5-dimensional single particle imaging and tracking (x,y,z,t,λ) without compromising spatiotemporal resolution or field of view. These acquisitions generate ~GBs of data, containing a wealth of information about the localization and environment of individual proteins. To facilitate quantitative acquisition and data analysis, the development of biochemical, software and hardware tools are presented. Together, these approaches aim to enable quantitative SML in complex biological samples.

Le domaine de la microscopie de fluorescence a connu une réelle révolution ces dernières années, permettant d'atteindre des résolutions nanométriques, bien en dessous de la limite de diffraction prédite par Abbe il y a plus d’un siècle. Les techniques basées sur la localisation de molécules individuelles telles que le PALM (Photo-Activation Light Microscopy) ou le (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) permettent la reconstruction d’images d’échantillons biologiques en 2 et 3 dimensions, avec des résolutions quasi-moléculaires. Néanmoins, même si ces techniques nécessitent une instrumentation relativement simple, elles requièrent des traitements informatiques conséquents, limitant leur utilisation en routine. En effet, plusieurs dizaines de milliers d’images brutes contenant plus d’un million de molécules doivent être acquises et analysées pour reconstruire une seule image. La plupart des outils disponibles nécessitent une analyse post-acquisition, alourdissant considérablement le processus d’acquisition. Par ailleurs la quantification de l’organisation, de la dynamique mais aussi de la stœchiométrie des complexes moléculaires à des échelles nanométriques peut constituer une clé déterminante pour élucider l’origine de certaines maladies. Ces nouvelles techniques offrent de telles capacités, mais les méthodes d’analyse pour y parvenir restent à développer. Afin d’accompagner cette nouvelle vague de microscopie de localisation et de la rendre utilisable en routine par des expérimentateurs non experts, il est primordial de développer des méthodes de localisation et d’analyse efficaces, simples d’emploi et quantitatives. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons développé dans un premier temps une nouvelle technique de localisation et reconstruction en temps réel basée sur la décomposition en ondelettes et l‘utilisation des cartes GPU pour la microscopie de super-résolution en 2 et 3 dimensions. Dans un second temps, nous avons mis au point une méthode quantitative basée sur la visualisation et la photophysique des fluorophores organiques pour la mesure de la stœchiométrie des récepteurs AMPA dans les synapses à l’échelle nanométrique. / The field of fluorescence microscopy has witnessed a real revolution these last few years, allowing nanometric spatial resolutions, well below the diffraction limit predicted by Abe more than a century ago. Single molecule-based super-resolution techniques such as PALM (Photo-Activation Light Microscopy) or (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) allow the image reconstruction of biological samples in 2 and 3 dimensions, with close to molecular resolution. However, while they require a quite straightforward instrumentation, they need heavy computation, limiting their use in routine. In practice, few tens of thousands of raw images with more than one million molecules must be acquired and analyzed to reconstruct a single super-resolution image. Most of the available tools require post-acquisition processing, making the acquisition protocol much heavier. In addition, the quantification of the organization, dynamics but also the stoichiometry of biomolecular complexes at nanometer scales can be a key determinant to elucidate the origin of certain diseases. Novel localization microscopy techniques offer such capabilities, but dedicated analysis methods still have to be developed. In order to democratize this new generation of localization microscopy techniques and make them usable in routine by non-experts, it is essential to develop simple and easy to use localization and quantitative analysis methods. During this PhD thesis, we first developed a new technique for real-time localization and reconstruction based on wavelet decomposition and the use of GPU cards for super-resolution microscopy in 2 and 3 dimensions. Second, we have proposed a quantitative method based on the visualization and the photophysics of organic fluorophores for measuring the stoichiometry of AMPA receptors in synapses at the molecular scale.

Parmi les méthodes de super-résolution, la microscopie par localisation de molécules uniques se distingue principalement par sa meilleure résolution réalisable en pratique mais aussi pour l’accès direct aux propriétés des molécules individuelles. Les données principales de la microscopie par localisation sont les coordonnées des fluorochromes, un type de données peu répandu en microscopie conventionnelle. Le développement de méthodes spéciales pour le traitement de ces données est donc nécessaire. J’ai développé les logiciels SharpViSu et ClusterViSu qui permettent d’effectuer les étapes de traitements les plus importantes, notamment une correction des dérives et des aberrations chromatiques, une sélection des événements de localisations, une reconstruction des données dans des images 2D ou dans des volumes 3D par le moyen de différentes techniques de visualisation, une estimation de la résolution à l’aide de la corrélation des anneaux de Fourier, et une segmentation à l’aide de fonctions K et L de Ripley. En plus, j’ai développé une méthode de segmentation de données de localisation en 2D et en 3D basée sur les diagrammes de Voronoï qui permet un clustering de manière automatique grâce à modélisation de bruit par les simulations Monte-Carlo. En utilisant les méthodes avancées de traitement de données, j’ai mis en évidence un clustering de la protéine CENP-A dans les régions centromériques des noyaux cellulaires et des transitions structurales de ces clusters au moment de la déposition de la CENP-A au début de la phase G1 du cycle cellulaire. / Among the super-resolution methods single-molecule localization microscopy (SMLM) is remarkable not only for best practically achievable resolution but also for the direct access to properties of individual molecules. The primary data of SMLM are the coordinates of individual fluorophores, which is a relatively rare data type in fluorescence microscopy. Therefore, specially adapted methods for processing of these data have to be developed. I developed the software SharpViSu and ClusterViSu that allow for most important data processing steps, namely for correction of drift and chromatic aberrations, selection of localization events, reconstruction of data in 2D images or 3D volumes using different visualization techniques, estimation of resolution with Fourier ring correlation, and segmentation using K- and L-Ripley functions. Additionally, I developed a method for segmentation of 2D and 3D localization data based on Voronoi diagrams, which allows for automatic and unambiguous cluster analysis thanks to noise modeling with Monte-Carlo simulations. Using advanced data processing methods, I demonstrated clustering of CENP-A in the centromeric regions of the cell nucleus and structural transitions of these clusters upon the CENP-A deposition in early G1 phase of the cell cycle.