Les sarcoglycanopathies sont des dystrophies musculaires récessives (LGMD2D, E, C, F) causées par des mutations dans les gènes codant les sarcoglycanes (SG) alpha,béta, gamma et delta. Ces protéines transmembranaires font parties d’un complexe interagissant avec la dystrophine, pour protéger les fibres musculaires contre le stress mécanique du à la contraction. La perte de l’expression membranaire d’une des SG peut entrainer l’absence du complexe entier à la membrane. Les mutations trouvées chez des patients sont à 66% des mutations faux-sens ; certaines d’entre-elles peuvent avoir une prévalence importante, comme R77C, la mutation la plus fréquente dans l’alpha-sarcoglycanopathie. Nous avons précédemment démontré que les SGs mutées sont retenues dans le réticulum endoplasmique par le contrôle qualité (ERQC), et qu’il est possible de sauver cette protéine mutée en inhibant l’activité d’une enzyme clé de l’ERQC, l’alpha-mannosidase, par traitement pharmacologique à la Kifunensine. Ce traitement s’est cependant avéré toxique.Ce projet de thèse vise donc à identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour les sarcoglycanopathies. Dans cette optique, nous avons tout d’abord cherché un modèle in vitro nous permettant d’étudier différents mutants d’alpha-SG. Nous avons choisi de générer une lignée cellulaire stable en transduisant les trois SG béta, gamma et delta dans des cellules immortalisées. Cette lignée a ensuite été transfectée avec des mutants d’alpha-SG pour étudier différentes molécules thérapeutiques identifiées dans la littérature. Nos travaux ont permis de démontrer la capacité de 7 molécules à restaurer l’expression membranaire de mutants alpha-SG. Afin de pouvoir valider l’efficacité de ces molécules in vivo, nous avons généré un modèle murin exprimant la mutation béta-T153R. Nos résultats constituent une preuve de principe de l’efficacité de molécules pharmacologiques pour le traitement de patients atteints de sarcoglycanopathies. / Sarcoglycanopathies are recessive muscular dystrophies (LGMD2D, E, C, F) caused by mutations in genes coding for alpha, beta, gamma and delta-sarcoglycans (SG). These transmembrane proteins are part of a complex interacting with dystrophin to protect muscle fibers against mechanical stress due to contraction. Loss of membrane expression of one SG can cause the absence of the entire complex at the membrane. Mutations found in patients are at 66% missense mutations; some of them being highly prevalent like R77C, the most frequent mutation in alpha-sarcoglycanopathy. Interestingly, we previously demonstrated that mutated SGs are retained in the endoplasmic reticulum by the quality control (ERQC), and that it is possible to rescue the mutated protein by inhibiting the activity of a key ERCQ enzyme: alpha-mannosidase I, using Kifunensine as a treatment.The aim of this PhD project is to identify new therapeutic molecules for sarcoglycanopathies. To do so, we first searched an in vitro model to study several alpha-SG mutants. We chose to generate a stable cell line, by transduction of immortalized cells with beta, gamma and delta-SG. This cell line was then transfected with alpha-SG mutants to study different therapeutic molecules identified in literature. Our work demonstrated the ability of 7 molecules to restore the membrane expression of several alpha-SG mutants. To validate the efficacy of those molecules in vivo, we generated a mouse model expressing the beta-T153R mutation. Our results are a proof of principle of the efficacy of pharmacological molecules to treat sarcoglycanopathies.

L’application de nanotubes de carbone (CNTs) dans le domaine biomédical a été largement explorée grâce à leur propriétés physico-chimiques et à leur biocompatibilité. Par la fonctionnalisation extérieur et/ou intérieur des CNTs c’est possible de préparer des nouveaux conjugués avec différentes propriétés et applications. On a exploré la modification des nanotubes par voie covalente pour leur utilisation comme vecteurs de biomolécules pour achever la thérapie anticancéreuse. Pendant ma thèse, j’ai travaillé sur trois projets: l’application de différentes approches pour la conversion des groupes acides carboxyliques de MWCNTs oxydés en amines, dans le but de préparer des conjugués capables de complexer du siRNA (petits ARN interférents). Dans un second projet, j’ai développé des conjugués à base de nanotubes de carbone couplés avec un fragment d’anticorps thérapeutique via une liaison clivable afin d’en étudier le potentiel antitumoral. Dans le dernier projet, on a achevé la fonctionnalisation de CNTs remplis avec des molécules radioactivables par cycloaddition de nitrene et ensuite conjugué un anticorps de ciblage tumoral. Le but été d’utiliser les nanotubes comme vecteurs pour la délivrance de radioactivité à l'intérieur des cellules tumorales ciblées par l’anticorps. On a aussi conduit des investigations biologique, afin d’évaluer la toxicité et l’efficace de ce conjugué. / The application of carbon nanotubes (CNTs) in the biomedical field has been widely explored thanks to their physico-chemical properties and their biocompatibility. By the external and/or internal functionalization of CNTs it is possible to prepare novel conjugates tailoring different properties and applications. We have investigated the covalent derivatization of CNTs by different chemical strategies to achieve suitable carriers for anticancer therapy. In one project, we have explored the conversion of the carboxylic groups of oxidized CNTs into amino groups, and the ability of these conjugates to complex genetic material, for gene delivery. In another project, CNTs have been functionalized with linkers bearing a cleavable disulfide bond, and further conjugated to a therapeutic nanobody for controlled intracellular drug release. Finally, we have investigated the reactivity of close-ended CNTs filled with radioactivable material toward Bingel and nitrene cycloadditions and the conjugation of a targeting antibody, for the target delivery of radioactivity. By several characterization techniques we have proved that the antibody is covalently grafted to the CNT-carrier and it still possesses its targeting ability. Investigations on the biological profile of these conjugates (cytotoxicity, targeting, uptake, biodistribution) have been also carried out.

Le nicotinamide est une vitamine fournie par l'alimentation et utilisée en thérapie dans le traitement de certaines pathologies humaines. Chez Leishmania, un protozoaire parasite responsable des leishmanioses, cette vitamine présente une action toxique contre le parasite et une action synergique avec l'antimoine, la principale molécule utilisée dans le traitement des leishmanioses. En recherchant le mode d'action de cette vitamine, nous avons observé qu'elle était en réalité un précurseur essentiel à la synthèse du NAD+ chez le parasite, un cofacteur responsable de la plupart des réactions d'oxydoréduction chez tous les êtres vivants. Leishmania étant en effet dépourvu des voies de synthèse de novo du NAD+, il doit le générer à partir de précurseurs qu'il importe depuis son environnement (nicotinamide, nicotinamide riboside, acide nicotinique). Cette auxotrophie du parasite pour le NAD+ révèle donc un rôle ambivalent du nicotinamide, à la fois toxique à fortes concentrations et pourtant essentiel à sa survie en tant que précurseur majeur du NAD+. À partir des bases de données, nous avons reconstitué l'ensemble de la voie de synthèse du NAD+ chez Leishmania. Parmi les enzymes impliquées, nous avons identifié une nicotinamidase qui n'a pas d'homologue chez les mammifères, et qui assure la conversion du nicotinamide en acide nicotinique, première étape à la synthèse du NAD+. Cette enzyme étant un candidat intéressant pour le développement de molécules ciblant spécifiquement le parasite, nous avons réalisé la caractérisation fonctionnelle de ce gène. Son inactivation induit une diminution importante de la concentration en NAD+ chez le parasite et provoque un arrêt de la prolifération en culture, ainsi qu'une incapacité des mutants à établir une infection durable chez la souris. L'obtention de la structure de la nicotinamidase de L. infantum nous offre désormais la possibilité de développer des inhibiteurs spécifiques contre cette nouvelle cible thérapeutique. / Nicotinamide is a vitamin provided by food that is already used in human therapy. In Leishmania protozoan parasites, this molecule shows toxic activity against parasites and has synergistic activity with antimonials, the main drugs used to treat leishmaniasis. By investigating the mode of action of this cheap vitamin, we discovered that nicotinamide is in fact the main precursor of NAD+ synthesis in Leishmania, a redox cofactor essential for all living cells. Leishmania are indeed devoid of a de novo NAD+ pathway and must synthesize it by scavenging precursors from their environment (nicotinamide, nicotinic acid and nicotinamide riboside). This NAD+ auxotrophy reveals a mixed pattern of activity of nicotinamide in Leishmania, i.e. toxic at high concentrations but also essential for parasite survival through its role in NAD+ synthesis. All enzymes of the Leishmania NAD+ salvage pathway were then identified from genome databases. We focused on a putative nicotinamidase, which has no homolog in mammals and governs the conversion of nicotinamide to nicotinic acid, the first step in the NAD+ salvage pathway. Since this enzyme could be considered as an attractive therapeutic target to develop specific parasite inhibitors, we performed a functional analysis of the corresponding gene. Targeted deletion of the nicotinamidase encoding gene induced a marked drop in parasite NAD+ content and a phenotype with strongly delayed growth. Additionally, these mutants are unable to establish durable infections in mice. The crystal structure of the nicotinamidase from L. infantum will allow us to develop specific inhibitors against this new therapeutic target.