Telomerase is a ribonucleoprotein (RNP) enzyme responsible for the replenishment of repetitive DNA sequences present at the ends of most eukaryotic chromosomes. Telomerase is minimally composed of a protein catalytic subunit, the telomerase reverse transcriptase (TERT), and an RNA subunit. Using a small single-stranded segment (7--11 nucleotides) of the telomerase RNA as a template, the active site of the TERT catalytic subunit adds complementary nucleotides onto telomeric DNA. The primary goal of the work presented in this thesis was to biochemically and functionally characterize the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) and the human telomerase RNA (hTR), as well as to identify novel telomerase-associated proteins. First, we demonstrated that the budding yeast Saccharomyces cerevisiae possesses the cellular machinery to fully assemble a catalytically active human telomerase RNP in vivo. We also analyzed telomerase activity and binding of hTR to hTERT in rabbit reticulocyte lysates by expressing different hTERT and hTR variants. Our results identified two distinct regions of hTR that can independently bind hTERT in vitro. Furthermore, sequences or structures that include the conserved CR4--CR5 domain of hTR were found to be important for hTERT-hTR interactions and telomerase activity reconstitution. Human TERT carboxy- and amino-terminal amino acid deletions indicated that the polymerase and RNA binding functions of hTERT are separable. We also found that the product of the survival of motor neuron ( SMN) gene, a protein involved in the biogenesis of certain RNPs, is a telomerase-associated protein. Our results demonstrate that the human TR and the human TERT are not associated with Sm proteins, in contrast to Saccharomyces cerevisiae telomerase. Taken together, the work presented in this thesis indicate that the reconstitution of human telomerase activity in vitro requires regions of hTERT that (i) are distinct from the conserved reverse transcriptase

We have shown that nine cDNA clones, which were derived from an oligo (dT) primed cDNA library of human embryonic lung fibroblast (IMR90), are capable of supporting autonomous replication of bacterial plasmid in mammalian (HeLa) cells. Two of these cDNA clones contain a region homologous to "O"-family middle repetitive sequences; the other seven clone hybridize with neither "O"-family nor Alu family sequences and are called NOA clones. Oligo (dT) primed cDNA of IMR90 has been demonstrated to be an enriched source for autonomously replicating sequences. Two out of three "O"-family homologous cDNA clones and seven out of ten NOA clones were capable of autonomous replication. In contrast, none of the five clones, which contained Alu repetitive sequences, demonstrated replicative potential. The two autonomously replicating, "O"-family homologous cDNA, 343 and 363, were characterized in the greatest detail. In particular, sequence and structural features of a 448 bp fragment of cDNA 343, which was capable of supporting autonomous replication activity, were: extensive asymmetrical A/T-rich regions; 10/11 match to yeast ARS consensus; scaffold attachment region consensus of Drosophila; bent DNA; a DNA unwinding element and an in vitro matrix binding activity. We have used a PCR-based mapping strategy to identify an in vivo initiation zone located in a region of approximately 1.6 kb which is inclusive of cDNA 343. The 343 sequence has been localized to the long arm (6q22-6qter) of human chromosome 6 by both Southern analysis of hamster-human cell hybrids and in situ hybridization. Transcripts homologous to 343 have been detected in both poly(A$ sp+$) and non-poly(A$ sp+$) RNA fractions to be 1.3 kb and 5 kb, respectively; the 1.3 kb transcript is greatly enriched in poly(A$ sp+$) RNA fraction, and the 5 kb transcript is present predominantly in non-poly(A$ sp+$) RNA fraction. The detailed characterization of 343 genomic locus demonstrated that the 343 sequence is conserv

Chromogranin A (CgA) is the major member of a family of acidic secretory glycoproteins (collectively known as granins) that are expressed in all endocrine and neuroendocrine cells. Granins have been proposed to play multiple roles, both intracellular and extracellular, in the secretory process. The regulation of synthesis and secretion of CgA in primary cultures of bovine parathyroid cells was studied and compared to that of parathyroid hormone (PTH). The effects of both extracellular calcium and the active metabolite of vitamin D$ sb3$, 1,25-dihydroxyvitamin D$ sb3$ (1,25(OH)$ rm sb2D sb3$) were shown to modulate CgA synthesis and secretion in the parathyroid. Whereas a reduced medium calcium level stimulated both CgA and PTH secretion, it had no effect on CgA mRNA levels. In contrast, 1,25(OH)$ rm sb2D sb3$ stimulated CgA mRNA levels by increasing the CgA gene transcription rate. Thus, 1,25(OH)$ rm sb2D sb3$ had opposite actions on the CgA and PTH genes in the parathyroid cell. The relationship between 1,25(OH)$ rm sb2D sb3$-stimulated CgA mRNA levels and total CgA protein levels (intracellular and extracellular) was not simple. Although 1,25(OH)$ rm sb2D sb3$ increased CgA mRNA levels several-fold, there was only a modest increase in CgA protein. This was the result of a specific effect of 1,25(OH)$ rm sb2D sb3$ on decreasing the translational efficiency of CgA mRNA as demonstrated by an increased ribosome transit time for CgA mRNA. To better understand the functional domains of CgA, and its evolution, and to study the basis of its neuroendocrine cell-specific gene expression, the human CgA gene was cloned and characterized. It spans 15 kb and contains eight exons. There is high conservation between the human, mouse, and bovine CgA genes with respect to exon number and placement of exon/intron borders. Transient transfection studies with constructs containing portions of the 5$ sp prime$ gene flanking region upstream of a chloramphenicol acetyl transferase rep

Human mitochondrial NAD-dependent methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase was expressed in a soluble and active form in Escherichia coli, purified to homogeneity for the first time and characterized. Phosphate is absolutely required for the dehydrogenase activity. NADP can be utilized by the dehydrogenase with a low turnover rate. The properties of the enzyme suggest that it has evolved from NADP to NAD specificity by the unique mechanism of substituting inorganic phosphate for the 2$ sp prime$-phosphate of NADP. The role of Mg$ sp{++}$ in this process is not understood, but it is required for activity with both dinucleotides. This enzyme is proposed to be a mammalian homolog of the product of the yeast MIS1 gene, functioning in providing formyltetrahydrofolate for the synthesis of formylmethionyl tRNA required for the initiation of protein synthesis in mitochondria. The two activities of this bifunctional enzyme are resolved significantly by diethylpyrocarbonate modification of at least two histidines. Most striking is the ability to activate the cyclohydrolase up to 50% independently of the dehydrogenase by modification with diethylpyrocarbonate in the presence of ligands: Mg$ sp{++}/$phosphate/NAD/folate.

Our search for protein tyrosine phosphatases (PTPases) that are involved in murine development led to the isolation of a novel PTPase called MPTP-PEST. To elucidate the function of MPTP-PEST, several biological aspects of the protein were investigated. It was determined that the MPTP-PEST enzyme is a stable cytosolic protein tyrosine phosphatase of 112 kDa that is ubiquitously expressed both in the adult and in the embryo. MPTP-PEST is composed of a single amino-terminus catalytic domain which is active against phosphorylated substrates in vitro. The gene structure and chromosomal localization of MPTP-PEST were determined using a series of $ lambda$ phage clones isolated from a mouse genomic library. Analysis of the MPTP-PEST locus indicated that the gene spans over 90 kb of the mouse genome and is composed of 18 exons, 10 of which constitute the catalytic phosphatase domain. Fluorescence in situ hybridization with MPTP-PEST genomic DNA defines the map position of MPTP-PEST to mouse chromosome 5 region A3-B. To gain mechanistic insights into the function of MPTP-PEST, the association of proteins with MPTP-PEST was investigated using several different in vitro and in vivo binding assays. It was shown that the proto-oncoprotein SHC and the adaptor protein Grb2 associate with MPTP-PEST through specific carboxy-terminus sequences. In addition, the SHC/MPTP-PEST association was shown to be mediated by a novel type of protein-protein interaction. Both SHC and Grb2 function downstream of receptor type and cyloplasmic protein tyrosine kinases and have been shown to mediate several signal transduction events. The association of MPTP-PEST with these signaling proteins may therefore represent a function for MPTP-PEST in signaling events.

Translation is regulated on multiple levels in the cell. The complexity of translation in eukaryotes has led to the evolution of numerous factors with major or minor effects on the final level of mRNA expression. These regulatory factors can be in cis or trans to the mRNA with mRNA-specific or non-specific effect. As the 3' tail of the eukaryotic mRNA, poly(A) is one of the cis regulatory factors of mRNA, significantly affecting its expression level. Poly(A) has been shown to have synergistic effect with another cis element of the eukaryotic mRNA, 5' cap structure. Among the protein factors that affect mRNA translation, PABP has the most fundamental roles. As the binding partner of poly(A), PABP is involved in the formation of the pre-initiation complexes. The two binding partners of PABP, Paip1 and 2 regulate the rate of translation. Here, using structural biology techniques, such as X-ray crystallography, I have studied the structure of the poly(A) RNA and the assembly of PABP complexes. I further quantified these interactions using thermodynamic analyses and dissected the mechanisms of the complex formation. I could show the self assembly of poly(A) and cooperative assembly of a ternary complex of poly(A)/PABP/eIF4G. The latter is regulated by the interdomain allostery of PABP, which is further controlled by its interactions with Paip1 and 2. These studies suggest the importance of inter- and intra-molecular interactions in regulating cellular processes. / La traduction est régulée à de multiples niveaux dans les cellules. La complexité de la traduction chez les eucaryotes a conduit à l'évolution de nombreux facteurs qui contrôlent l'expression des ARNs messagers (ARNm). Ces facteurs de régulation peuvent fonctionner en cis ou en trans avec des effets spécifiques ou non-spécifiques pour les ARNm. À l'extrémité 3' de l'ARNm eucaryote, la queue poly(A) est l'un des facteurs de régulation cis de l'ARNm qui affecte de manière significative son niveau d'expression. La queue poly(A) a un effet synergique avec un autre élément de l'ARNm eucaryote: le complexe de pré-initiation situé à l'extremité 5'.Parmi les facteurs protéiques qui affectent la traduction des ARNm, la PABP joue les rôles les plus fondamentaux. Comme partenaire de liaison avec le poly(A), la PABP est impliquée dans la formation des complexes de pré-initiation. Les protéines Paip1 et Paip2 se lient à la PABP pour contrôler le niveau de traduction. Ici, par des techniques de biologie structurale, comme la cristallographie par rayons X, j'ai étudié la structure de l'ARN poly(A) et l'assemblage des complexes de la PABP. J'ai également quantifié ces interactions au moyen d'analyses thermodynamiques ce qui a permis de dévoiler les mécanismes de la formation du complexe. J'ai pu démontrer l'auto-assemblage du poly(A) et l'assemblage coopératif d'un complexe ternaire de poly(A)/PABP/eIF4G. Ce dernier est assujetti à l'allostérie inter- domaines de PABP, qui est en outre contrôlée par ses interactions avec Paip1 et Paip2. Ces études suggèrent l'importance des interactions inter- et intra-moléculaires dans la régulation des processus cellulaires.

The short isoforms of the CUX1 transcription factor have been implicated in various cancer-related processes in tissues culture experiments and were found to contribute to tumorigenicity in transgenic mice. In addition, CUX1 is over-expressed in many human cancers. The functions attributed so far to CUX1 stem from its activity as a transcription factor. However, it is possible that CUX1 plays a non-transcriptional role in the cell. Tandem affinity purification, followed by mass spectrometry, identified numerous binding partners of CUX1. The aim of my studies was to validate and further characterize the interactions of CUX1 with some of these proteins: REV1, PARP1 and Ku70/Ku80. REV1 is an error-prone DNA polymerase involved in translesion synthesis and is responsible for most point mutations in yeast and mammalian cells. We showed that the REV1-CUX1 interaction required the REV1 BRCT domain and was increased following irradiation. I have shown that CUX1 was phosphorylated following DNA damage. My results indicated that ATM phosphorylated CUX1 and that phosphorylation of CUX1 at serines 861, 868 and 1100 promoted its interaction with REV1. ChIP-on-chip experiments showed that REV1 preferentially localized to transcribed regions, that the recruitment increased after gamma-irradiation and that 12.9% of REV1 binding sites overlapped CUX1 binding sites. I have optimized and characterized two reporter assays for point mutations (GFPstop and ouabain resistance) and showed that point mutation frequency correlated, at least in part, with the ability of a promoter to recruit REV1. Reduction in REV1 expression led to a decrease in expression of numerous genes. We propose that the physiological purpose for REV1 recruitment to transcribed regions is to enable efficient transcription of actively transcribed genes, by preventing stalled replication forks from blocking the passage of the transcription machinery. Ku and PARP1 are sensors of DNA damage and promote DNA damage repair. I have validated the interaction of CUX1 with Ku and PARP1 and showed that expression of CUX1 fragments led to their displacement from known promoter targets. Using various experimental approaches, my results indicated that in addition to its transcriptional role, CUX1 might play a non-transcriptional role in the repair of strand breaks. / Le facteur de transcription CUX1, et plus particulièrement ses isoformes courtes, sont impliquées dans différents processus associés au développement cancéreux dans des expériences de culture de tissus et dans des modèles de souris transgéniques. De plus, CUX1 est sur-exprimé dans de nombreux cancers humains. Les fonctions attribuées jusqu'à présent à CUX1 sont associées à son activité transcriptionelle. Cependant, il est possible que CUX1 joue un rôle non-transcriptionel dans la cellule. La purification par affinité en tandem, couplée à la spectrométrie de masse, a permis d'identifier plusieurs partenaires d'interaction de CUX1. Le but de mes études a été de valider et caractériser les interactions de CUX1 avec certaines de ces protéines, plus précisément REV1, PARP1 et Ku70/Ku80. REV1 est une ADN polymérase de faible fidélité lors de la synthèse d'ADN impliqué dans le processus de synthèse à travers les lésions (translesion synthesis) et responsable de la plupart des mutations ponctuelles chez la levure, ainsi que chez les mammifères. Nous avons montré que l'interaction entre REV1 et CUX1 nécessitait le domaine BRCT de REV1 et que leur affinité respective augmentait suite à l'irradiation. J'ai montré que CUX1 était phosphorylé suite aux dommages à l'ADN. Mes résultats ont indiqué que ATM phosphorylait CUX1 et que les phosphorylations de CUX1 sur les serines 861, 868 et 1100 favorisaient son interaction avec REV1. Des expériences de localisation génomique par puce ont montré que REV1 était localisé de manière préférentielle dans des régions transcrites, que cette localisation augmentait suite à l'irradiation aux rayons gamma et que 12.9% des sites de localisation de REV1 se superposaient aux sites de localisation de CUX1.J'ai optimisé et j'ai caractérisé deux essais rapporteurs pour l'analyse des mutations ponctuelles (GFPstop et résistance à l'ouabain) et j'ai montré que la fréquence des mutations ponctuelles corrélait, en partie, avec la capacité des promoteurs à recruter REV1. Une réduction de l'expression de REV1 a induit la réduction de l'expression des nombreux gènes. Nous suggérons que le rôle physiologique du recrutement de REV1 au sein de régions génomiques transcrites est de permettre la transcription efficace des gènes transcrits activement, en prévenant le blocage du passage du complexe transcriptionel normalement induit par les fourches de réplication arrêtées à cause du dommage à l'ADN. Ku et PARP1 sont des détecteurs du dommage à l'ADN et stimulent la réparation de l'ADN. J'ai validé l'interaction de CUX1 avec Ku et PARP1 et j'ai montré que, suite à l'expression des fragments de CUX1, Ku et PARP1 ne se localisaient plus sur certaines de leurs cibles génomiques. En utilisant différentes approches expérimentales, mes résultats ont indiqué que, en plus de son rôle transcriptionel, CUX1 pourrait jouer un rôle non-transcriptionel dans la réparation des cassures de l'ADN.

CUX1 is a transcription factor implicated in the control of cell proliferation. Over-expression of CUX1 is observed in many human tumors and cancer cell lines. Cells constitutively over-expressing the p110 isoform of CUX1 proliferate faster and spend less time in G1 following quiescence. We studied three aspects of CUX1 function and regulation during the cell cycle. In the first part of this study we investigated how over-expression of p110 CUX1 results in a shortened G1. Using quantitative PCR we showed that over-expression of p110 CUX1 caused an increase in the transcription of DDK genes (cdc7 and Dbf4) upon exit from quiescence. Western blot analysis revealed that p110 CUX1 cells display elevated phosphorylation of MCM2 serine 5 (pS5-MCM2) during quiescence, indicating an increased activity of DDK. This was associated with a faster loading of MCM2 onto the chromatin after re-entry into the cell cycle and a shortening of G1 as shown by FACS. In a set of experiments, we investigated how the phosphorylation of CUX1 by cyclinD1-CDK4 contributes to cell cycle regulation. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) analysis revealed that phosphorylation of a recombinant CUX1 protein (1125-1505) by cyclinD1-CDK4 inhibited its DNA binding while PKA activated it. Another recombinant CUX1 protein (1125-1308), missing the C-terminal repression domains, is activated by cyclinD1-CDK4 and inhibited by PKA. Autoradiography and western blot analysis revealed that cyclinD1-CDK4 phosphorylates CUX1 on S1216 while PKA phosphorylates S1215 and S1216. FACS analyses showed that cells expressing mutant p110 CUX1S1215/1216A decrease in size with extended passages in culture and eventually die by apoptosis, indicating the importance of cyclinD1-CDK4 regulation in maintaining cell size. Thirdly, during mitosis CUX1 appears ~15kDa larger when observed by SDS-PAGE. We wanted to search for any large post translational modifications such as ubiquitin. No such modifications were identified, however, using mass spectrometry we demonstrated that during mitosis CUX1 is phosphorylated on at least twelve residues compared to six during G2. / CUX1 est un facteur de transcription impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire. La surexpression de CUX1 est observée dans de nombreuses tumeurs humaines et lignées de cellules cancéreuses. Les cellules qui surexpriment constitutivement l'isoforme p110 de CUX1 prolifèrent plus rapidement et passent moins de temps en G1 après quiescence. Nous avons étudié trois aspects de la régulation de CUX1 au cours du cycle cellulaire. Dans la première partie de cette étude, nous avons analysé le mécanisme par lequel la surexpression de p110 CUX1 conduit à une réduction dans la durée de la phase G1. En utilisant la méthode de PCR quantitative, nous avons montré que la surexpression de p110 CUX1 a augmenté la transcription de gènes DDK (Cdc7 et Dbf4) à la sortie de quiescence. L'analyse par immuno-buvardagea révélé que les cellules p110 CUX1 montrent une phosphorylation élevée de pS5-MCM2 pendant la quiescence, ce qui indique une augmentation de l'activité de DDK. Cette phosphorylation élevée est associée à un chargement plus rapide de MCM2 sur la chromatine après entrée dans le cycle cellulaire et un raccourcissement de la phase G1 tel que mesuré par FACS. Dans un deuxième projet, nous avons étudié l'effet de la phosphorylation de CUX1 par le complexe cyclin D1/CDK4 sur la régulation du cycle cellulaire. Des test de liaison à l'AND ont révélé que la phosphorylation d'une protéine recombinante CUX1 (1125-1505) par cyclinD1-CDK4 inhibeé sa liaison à l'ADN tandis que la PKA l'active. À l'inverse, une autre protéine recombinante CUX1 (1125-1308), qui ne contient pas les domaines répression en C-terminaux, est activée par cyclinD1-CDK4 et inhibée par la PKA. L'autoradiographie et l'analyse par immuno-buvardage ont révélé que cyclinD1-CDK4 phosphoryle la sérine 1216, alors que PKA phosphoryle sur les sérines 1215 et 1216. Les analyses par FACS ont montré que les cellules exprimant un mutant p110 CUX1S1215/1216A passent moins de temps en G1, deviennent progressivement plus petites et finissent par mourir par apoptose. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de CUX1 par le complexe cyclinD1-CDK4 sert à contrôler la taille des cellules. Finalement, au cours de la mitose, CUX1 semble ~ 15 kDa plus grands quand on l'observe par SDS-PAGE. Nous avons vérifié si cette différence de poids moléculaire résultait de modifications post-traductionnelles telles que l'ajout d'un peptide de la famille des ubiquitines. Aucune de ces modifications n'a été identifiée, mais en utilisant la spectrométrie de masse, nous avons démontré que, durant la mitose, CUX1 est phosphorylé sur au moins douze résidus par rapport à six au cours de G2.

The Hedgehog (Hh) signaling pathway is an essential and highly conserved pathway required for embryonic development and adult tissues homeostasis in both invertebrates and vertebrates. In humans, abnormal Hh signaling leads to numerous congenital diseases and deregulation of Hh signaling is associated with certain aspects of tumorigenesis. Therefore, a complete characterization of this pathway may help us to better understand the role of Hh signaling under physiological and pathological conditions. A key transducer of Hh signaling is Smoothened (Smo), a seven-pass transmembrane protein and distant member of the G-protein-coupled receptor (GPCR) family. In the absence of the secreted Hh protein, Smo is inhibited by another membrane protein, the Hh-receptor Patched (Ptc). Hh binding to Ptc releases this inhibition and triggers accumulation of Smo at the cell surface. Phosphorylation of Smo by Protein kinase A (PKA) and additional kinases allows Smo to adopt an active conformation, which turns the Hh signaling pathway on and ultimately allows the expression of Hh target genes. G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) are known to phosphorylate active GPCRs and promote homologous desensitization of GPCR signaling. Smo is a functional GPCR in Drosophila and several recent studies suggest that GRKs participate in Hh signaling in both invertebrates and vertebrates. To address the role of GRKs in Drosophila Hh signaling, we analyzed flies mutant for gprk2, one of two GRKs in flies. Interestingly, gprk2 mutant flies display defects typical of impaired Hh signaling, suggesting that Gprk2 is required for transducing the Hh signal. Further studies, however, showed that Gprk2 also plays a negative role in Hh signaling by promoting Smo desensitization, which is consistent with typical GRK biology. To explain the dual and contradictory role of Gprk2 in Hh signaling, we hypothesized that heterotrimeric G-protein-dependent signaling may be affected in gprk2 mutants through misregulation of Smo and other GPCRs. Consistent with this idea we find that basal cAMP levels are abnormally low in gprk2 mutants. Cellular cAMP concentrations control the activity of PKA, the key activator of Smo. With genetic experiments, we confirmed that cAMP levels and PKA activity are limiting for Hh target gene expression in gprk2 mutants. In conclusion, our results suggest that Gprk2 regulates Hh signaling in two ways. On one hand, it limits Hh signaling by promoting homologous desensitization of Smo. On the other hand, it is also required to keep cellular cAMP concentrations in a physiological range that is required for normal Hh signaling. We speculate that the abnormally low cAMP levels in gprk2 mutants are not only caused by misregulation of Smo, but also by a more global misregulation of GPCR signaling, suggesting that Hh signalling is affected by signalling cross-talk. / La voie de signalisation Hedgehog (Hh) est une cascade de signalisation essentielle et hautement conservée, requise lors du développement embryonnaire et le maintien de l'homéostasie dans les tissus adultes, tant chez les invertébrés que chez les vertébrés. Chez l'homme, une signalisation anormale de cette voie de signalisation entraîne de nombreux défauts congénitaux, et est associée à certains aspects de la tumorigénèse. Ainsi, une caractérisation complète de cette cascade signalitique nous aiderait à mieux comprendre le rôle de Hh dans des conditions physiologiques et pathologiques. La protéine Smoothened (Smo) est une composante importante de la signalisation par Hh. Smo est composée de sept domaines transmembranaires et fait partie de la famille de "G-protein-coupled receptor" (GPCR). En absence de Hh, Smo est inhibée par la protéine membranaire "Hh-receptor Patched" (Ptc). La liaison de Hh à Ptc relâche l'inhibition qu'exerce cette dernière sur Smo, qui s'accumule alors à la surface de la cellule. La phosphorylation de Smo par la Protéine kinase A (PKA) ou d'autres kinases permet à Smo d'adopter sa conformation dite active, qui enclenche alors la cascade signalitique qui induit l'expression des gènes cibles de Hh.Il a été démontré que les protéines "G-protein-coupled receptor kinases" (GRKs) phosphorylent les GPCRs actives et promouvoient ainsi la désensibilisation à leur signalisation. De récentes études suggèrent que les GRKs participent à la signalisation par Hh chez les invertébrés et chez les vertébrés. Afin de mieux comprendre le role des GRKs dans la signalisation de Hh chez la drosophile, nous avons analysé des mouches mutantes pour gprk2, l'une des deux GRKs présentes dans ce modèle. Surprenament, les mouches mutantes pour gprk2 présentent des défauts qui sont typiques à la voie de signalisation Hh. Ceci suggère que Gprk2 est requise pour transmettre les signaux de signalisation en aval de Hh. Toutefois, de plus amples études ont révélées que Gprk2 régule aussi de façon negative cette voie de signalisation en induisant la désensibilisation à Smo. Afin d'expliquer les rôles contradictoires de Gprk2 dans la voie de signalisation Hh, nous avons émis l'hypothèse que les défauts de signalisation par les GPCRs observés chez les mouches mutantes pour gprk2 sont dûs à une mauvaise regulation de Smo et d'autres GPCRs. Ainsi, nous avons découvert que les niveaux basals d'AMPc sont anormalement bas chez les mutants de gprk2. Les concentrations intracellulaires d'AMPc régulent l'activité de la PKA, qui elle-même régule Smo. À l'aide d'expériences génétiques, nous avons confirmé que les bas niveaux d'AMPc et de l'activité de la PKA limitent l'expresssion des gènes cibles de Hh chez les mutants de gprk2. En conclusion, nous résultats suggèrent que Gprk2 régule la signalisaiton de Hh de deux façons distinctes. D'une part, elle régule la signalisation en amont de Hh en induisant la désensibilisation à Smo. D'autre part, Gprk2 est requise afin de maintenir les niveaux d'AMPc à des niveaux physiologiques, ce qui est nécessaire pour une signalisation normale de Hh. Nos résultats suggèrent que les niveaux anormalement faible d'AMPc chez les mutants de gprk2 ne sont pas dûs uniquement à une mauvaise regulation de Smo, mais à une mauvaise regulation plus globale de GPCRs en general. Ainsi, la signalisation par Hh semble être régulée par différentes boucles de rétroactivation.

Angiogenesis and inflammation are hallmarks of several pathologies including breast cancer. The angiopoietins and Tie receptors have emerge as alternative targets for therapeutical intervention due to their function as essential regulators of angiogenesis, vascular homeostasis and inflammation. Angiopoietin-1 (Ang-1), the main agonist of Tie-2 receptors, promotes vessel growth, inhibits inflammation and maintains vessel stability. Although important advances have been made in understanding the functions of Ang-1 in the vasculature the intracellular signaling pathways activated by Ang-1, as well as its role in breast cancer and inflammation, remain largely unexplored. Using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), we identified dual-specificity phosphatases (DUSPs) that negatively regulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways activated by Ang-1. Specifically we found that Ang-1 increased the expression (mRNA and Protein), as well as the activity of DUSP1, DUSP4 and DUSP5. Knocking down these phosphatases using siRNA revealed that DUSP1 mainly inactivates p38, DUSP4 dephosphorylates ERK1/2, p38 and SAPK/JNK, and DUSP5 is ERK-specific. Furthermore DUSP1, DUSP4 and DUSP5 had distinct functions in Ang-1-dependent survival and migration of endothelial cells (ECs).Because of the importance of angiogenesis in tumor progression, we then investigated the influence of estradiol (E2) on the expression of angiopoietins in breast cancer cell lines. We found Ang-1 mRNA and protein expressions to be lower in estrogen receptor (ERα) positive cells than in ERα negative cells. Additionally, we observed that both tumor size and Ang-1 production were reduced in ERα+ cell-derived xenografts in mouse mammary pads when compared to those derived from ERα- cells; and this effect was inhibited when the mice were ovariectomized. Since a large portion of the genome is under the regulation of microRNAs (miRNAs), we hypothesized that Ang-1 induces the expression of miRNAs to protect the endothelium against E. Coli lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation. We found that treating HUVECs for 24h with Ang-1 reduced LPS-induced phosphorylation of p38 and SAPK/JNK, and the activation of nuclear factor kappa b (NF-B). Ang-1 also decreased the expression of pro-inflammatory cytokines, adhesion molecules and leukocyte adhesion in vitro. Our findings suggest that miR-146b-5p is induced by Ang-1 as a mechanism to control Toll-like receptor (TLR) 4 signaling and the expression of pro-inflammatory mediators by targeting the signaling proteins interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK1) and TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6). We conclude that Ang-1 induces the expression of DUSP1, DUSP4 and DUSP5 to coordinate its anti-apoptotic and migratory response. Ang-1 is also an important modulator of growth and progression of ERα- breast cancers. Finally, Ang-1 treatment antagonizes pro-inflammatory pathways activated by LPS through the induction of miR-146b-5p which targets the TLR signaling proteins IRAK1 and TRAF6. / L'angiogenèse et l'inflammation sont caractéristiques de plusieurs pathologies, dont le cancer du sein. Les angiopoiétines et les récepteurs Tie ont émergé comme cibles d'intervention thérapeutique alternatives en raison de leur fonction de régulateurs essentiels de l'angiogenèse, de l'homéostasie vasculaire et de l'inflammation. L'angiopoiétine-1 (Ang-1), l'agoniste principal du récepteur Tie-2, favorise la croissance des vaisseaux, inhibe l'inflammation et maintient la stabilité vasculaire. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des fonctions d'Ang-1 dans le système vasculaire, les voies de signalisation intracellulaires activées par Ang-1 ainsi que son rôle dans le cancer du sein et l'inflammation sont largement inexplorées.Utilisant des cellules endothéliales de veine ombilicale (CEVOH), nous avons identifié des phosphatases à double spécificité (DSPs) qui régulent négativement les voies de signalisation des protéines kinase activée par mitogènes (MAPKs) activées par Ang-1. Plus précisément nous avons trouvé que l'Ang-1 a induit l'ARNm, l'expression des protéines et l'activité de DSP1, DSP4 et DSP5. Réduire l'expression de ces phosphatases à l'aide de ARNi a révélé que DSP1 inactive principalement p38, DSP4 déphosphoryle ERK1/2, p38 et SAPK/JNK et DSP5 est spécifique pour ERK. En outre DSP1, DSP4 et DSP5 possèdent des fonctions distinctes pour la régulation de la migration, la survie, la formation de tube capillaire et la perméabilité vasculaire dépendante d'Ang-1.En raison de l'importance de l'angiogenèse dans la progression tumorale, nous avons ensuite étudié l'influence de l'estradiol (E2) sur l'expression des angiopoiétines dans des lignées cellulaires du cancer du sein. Nous avons trouvé que le niveau de transcrits d'ARNm ainsi que l'expression protéique d'Ang-1 étaient réduits dans cellules positives pour les récepteurs des œstrogènes (ER) par comparison aux cellules négatives pour ER. En outre, nous avons observé que la taille de la tumeur et la production d'Ang-1 étaient réduits dans de xénogreffes de tissu mammaire chez la souris dérivés de cellules ER+, par rapport à ceux issus de cellules ER. De plus cet effet est inhibé lorsque les souris sont ovariectomisées.Comme une grande partie du génome est sous le contrôle des microARNs (miARN), nous avons émis l'hypothèse que l'Ang-1 induit l'expression des miARNs pour protéger l'endothélium contre l'inflammation induite par le lipopolysaccharide (LPS) d'E. Coli. Nous avons constaté que le traitement de CEVOH pendant 24 heures avec Ang-1 réduit la phosphorylation de p38 et SAPK/JNK, ainsi que l'activation du facteur nucléaire kappa B (NF-B) induite par le LPS. Ang-1 a également diminué l'expression de cytokines pro-inflammatoires, des molécules d'adhésion et l'adhérence des leucocytes in vitro. Nos résultats suggèrent que miR-146b-5p est induit par l'Ang-1 comme un mécanisme pour le contrôle de la signalisation des récepteurs de type toll (TLR) et l'expression de médiateurs pro-inflammatoires, en ciblant les protéines de signalisation IRAK1 et TRAF6.Nous concluons que l'Ang-1 induit l'expression de DSP1, DSP4 et DSP5 à fin de coordonner son action anti-apoptotique et sa réponse migratoire et angiogénique. Ang-1 est également un modulateur important de la croissance et de la progression des cancers du sein ER-. Enfin, le traitement avec Ang-1 antagonise les voies de signalisation pro-inflammatoires par l'induction de l'expression de miR-146-5p, qui cible des protéines de la voie de signalisation TLR: IRAK1 et TRAF6.