Post-translational modifications on histones play a major role in remodelling dynamic chromatin structures, in response to various cellular needs for gene activation or repression. Acetylation carried out by histone acetyltransferases (HATs) is one of the most extensively-studied histone modifications. The ATAC (Ada-Two-A Containing) complex is a multiprotein HAT complex. The complex is unique because it contains two acetyltransferases known as GCN5 and ATAC2, along with greater than 10 additional subunits. GCN5 is a mammalian orthologue of PCAF, and they are mutually exclusive in the human ATAC complex. Recent studies of this complex revealed intricate association among its components. It has been shown that different ATAC complexes contain different components and exhibit different substrate specificities. However, the regulatory mechanisms controlling ATAC activity and assembly are poorly understood. To gain insight into this and its functional consequences, I sought to study the activity of ATAC2, and to elucidate the contributions of each of the HAT enzymes in assembling the ATAC complex. From this work, each HAT domain of the acetyltransferases was shown to be responsible for the association with different subsets of ATAC components. And ATAC2 was discovered to bridge GCN5 and PCAF with other ATAC components. Therefore, acetyltransferase domains are not only important for acetyltransferase activity but also for complex assembly. Moreover, the HAT domain and the PHD domain of ATAC2 are both required for enzymatic activity. Additional preliminary data suggest that ATAC2 may affect the anchorage-independent proliferation of transformed cells. These findings not only reveal the essential roles of the HAT domains in the activity and assembly of the ATAC complex, but also open the possibility for ATAC complex regulation. / Le remodelage de la chromatine induit par l'ensemble de modifications post-traductionnelles d'histones joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique. De ce fait, plusieurs études scientifiques ont examinées le mécanisme d'acétylation d'histones par les enzymes histone acetyltransferase (HAT). Le complexe multiprotéique ATAC (Ada-Two-A Containing) comprend deux enzymes HAT. D'après plusieurs études récentes, l'association des composantes de ce complexe est très élaborée. Différentes conformations de ce complexe contiennent une variété de combinaisons de sous-unités éprouvant des affinités enzymatiques distinctes envers certains substrats spécifiques. Ceci dit, l'ensemble des processus cellulaire qui gère la combinaison des sous-unités et l'activité enzymatique du complexe ATAC sont peu connus. De ce fait, afin d'élucider le rôle biologique des enzymes HAT par rapport à l'assemblage des composantes de ce complexe, j'ai étudié l'activité enzymatique de la sous-unité ATAC2. D'après mes résultats, l'acétylation des substrats d'ATAC2 dépend du domaine HAT de cet enzyme. Ainsi, les domaines HAT et PHD sont tous les deux indispensables à son activité enzymatique. De plus, ATAC2, GCN5 et PCAF s'associent avec divers sous-ensembles hétérogènes du complexe ATAC. Subséquemment, ATAC2 participe activement à l'événement de liaison entre GCN5, PCAF et les autres composantes du complexe. Les données supplémentaires préliminaires suggèrent qu'ATAC2 peut affecter l'anchorage-indépendant prolifération des cellules transformées. Les résultats de mon étude démontrent le rôle d'ATAC2 en ce qui concerne l'activité enzymatique et la formation du complexe ATAC, et ouvrent également la possibilité pour le règlement du complexe ATAC.

In most mammalian species, all oogonia cease mitotic proliferation and enter meiosis in fetal ovaries. Furthermore, more than half of the maximum number of germ cells is eliminated from ovaries by neonatal life, thus limiting the oocyte reserve for reproduction. The cause or mechanism of this female germ cell loss remains largely unknown. A major loss occurs in the oocytes which reach the pachytene stage of meiotic prophase, suggesting that oocytes with meiotic or recombination errors may be eliminated by a checkpoint mechanism. It remains to be determined whether oocytes are eliminated by apoptosis and if so in which pathway. The purpose of my study is to investigate a mechanism of oocyte loss in the mouse ovary during meiotic prophase. We used an Msh5 null mutant mouse strain, in which all oocytes are eliminated by neonatal life. Msh5 encodes a protein required for meiotic chromosome synapsis. / Msh5 heterozygous mutant mice were crossed and ovaries were isolated from female progeny at 14.5 – 22.5 days postcoitum (dpc). We studied the loss of germ cells in Msh5 -/- (MT) females comparing to the Msh5 +/+ (WT) and Msh5 (+/-) (HT) females by immunolabeling of ovarian sections for GCNA1 or MVH (both germ cell markers) or by counting GCNA1 positive germ cells in cell suspension preparations. Our results showed a continuous loss of GCNA1 positive cells in both MT and WT although the loss in MT was constantly larger than in the WT. A significant difference between WT and MT was found at 19.5 dpc. / Meiotic progression was studied by GCNA1 and SC (synaptonemal complex) or SC and ɣH2AX double immunolabeling of chromosome spread preparations. We found that meiosis in MT was blocked at zygotene-pachytene transition. No normal pachytene was observed in MT. / The role of apoptosis in elimination of oocytes during meiotic prophase was investigated by analyzing the cleavage of various caspases (caspase 2, 3, 6, 7, 9) as well as PARP1 by western blot using the lysate of whole ovaries. The activation of initiator caspase 9 increased from 17.5 to 18.5 dpc and decreased by 19.5 dpc. Caspase 2L activation also increased in a similar pattern but at much lower levels. The activation of effector caspase 3 or 6 remained at low levels. The activation of caspase 7 also was low but increased slightly at 19.5 dpc. The cleavage of PARP1 was high at all investigated stages. There were not major differences in the average level of activation between WT and MT. By immunolabeling of ovarian sections we observed that cleaved caspases and PARP1 were localized in oocytes but also in cells negative for GCNA1. / These results suggest that a mitochondrial pathway of apoptosis may play a role in the elimination of oocytes during meiotic prophase, involving activation of caspase 9 and cleavage of PARP1. However further studies are necessary for identification of an effector caspase. / Dans la plupart des espèces de mammifères, tous les oocytes cessent la prolifération mitotique et initialisent la méiose dans les ovaires fœtales. En outre, plus de la moitié du nombre maximal de cellules germinales est éliminée dans les ovaires pendant la vie néonatale, limitant ainsi la réserve d'oocytes pour la reproduction. La cause ou le mécanisme de cette perte de cellules germinales femelles reste largement inconnu. Une perte majeure se produit dans les oocytes qui atteignent le stade pachytène de la prophase méiotique, suggérant que les oocytes avec des erreurs dans la méiose ou des erreurs de recombinaison peuvent être éliminés par un mécanisme de contrôle. Il reste à déterminer si les oocytes sont éliminés par apoptose, et si oui, par quel méchanisme. Le but de mon projet est d'étudier un mécanisme de perte d'oocytes dans les ovaires de souris durant la prophase méiotique. Nous avons utilisé une souche de souris mutantes pour la gene Msh5, dans lequelles tous les oocytes sont éliminés durant la vie néonatale. Msh5 code pour une protéine nécessaire à la synapse de chromosomes méiotiques. / Des souris hétérozygote Msh5 ont été croisées et les ovaires ont été isolées de la progéniture féminine de 14,5 à 22,5 dpc. Nous avons étudié la perte de cellules germinales dans les ovaires des femelles Msh5 -/- (MT) en les comparant à ceux des femelles Msh5 +/+ (WT) et Msh5 +/- (HT) par immunodétection en utilisant des anticorps anti-GCNA1 et anti-MVH (marqueurs des cellules germinales) ou par le comptage des cellules positives au GCNA1 dans des suspensions cellulaires. Nos résultats montrent une perte continue de cellules positives au GCNA1 chez les souris MT et WT, bien que la perte chez les MT a été constamment supérieure à celle des WT (différence significative à 19.5 dpc). / La progression de la méiose a été étudiée par immunodétection double pour GCNA1 et SC (complexe synaptonémal) ou pour SC et γH2AX sur des préparations de chromosomes. Nous avons constaté que la méiose chez les souris MT est bloquée dans le stage de transition zygotène-pachytène. Nous n'avons pas observé de pachytène normal chez les souris MT. / Le rôle de l'apoptose dans l'élimination d'oocytes au cours de la prophase méiotique a été étudié par analyse du clivage de diverses caspases (caspases 2, 3, 6, 7, 9) ainsi que celui de la PARP1 par immunobuvardage des protéines d'ovaires entières lysées. L'activation de la caspase 9 initiatrice a augmenté entre 17.5dpc et 18.5 dpc et a ensuite baissé à 19.5 dpc. Celle de la caspase 2L a augmenté d'une manière semblable, mais à des niveaux beaucoup plus bas. L'activation des caspases effectrice 3 et 6 est demeurée à des niveaux faibles mais celle de la caspase 7 bien que faible a augmenté légèrement à 19.5 dpc. Le clivage de PARP1 était élevé dans tous les stages. Dans tous ces cas, il n'y a pas eu de grandes différences dans le niveau moyen d'activation entre WT et MT. Par immunodétection de sections d'ovaires, nous avons observé que les caspases et PARP1 clivées étaient localisées dans des oocytes, mais aussi dans les cellules sans marquage pour GCNA1. / Ces résultats indiquent que la voie mitochondriale de l'apoptose peut jouer un rôle dans l'élimination d'oocytes au cours de la prophase méiotique, puisque les clivages de la caspase 9 et de PARP1 y sont associés. Cependant des études supplémentaires sont nécessaires pour l'identification de caspases effectrices.

Telomerase synthesizes telomeric sequences and is minimally composed of a reverse transcriptase (RT) (TERT) and RNA (TR). We reconstituted heterologous mouse and human TERT-TR and chimeric mTERT-hTERT-hTR complexes in vitro and in immortalized human alternative lengthening of telomere (ALT) cells. Our data suggest that species-specific determinants of activity, processivity, and telomere function map not only to TR, but also to the TERT component. hTERT-hTR, but not heterologous TERT-TR complexes, nor chimeric mTERT-hTERT-hTR complexes, significantly reduced the percentage of chromosomes without telomeric signals in ALT cells. Moreover, heterologous and chimeric complexes were defective in recruitment to telomeres. Our results suggest a requirement for several hTERT domains and interaction with multiple proteins for proper recruitment of telomerase to the shortest telomeres in human ALT cells. The ability of hTERT to elongate short mouse telomeres, and the inability of mTERT to elongate short human telomeres suggest that mechanisms regulating recruitment and activity of hTERT at short telomeres may be less stringently regulated than mechanisms regulating mTERT recruitment and activity at short telomeres. Results such as these may lead to the design of better strategies for inhibiting telomerase and validation using rodent models. For example, TERT domains that confer similar functions in human and mouse cells may be better targets than domains with species-restricted functions. We also tested the specificity of a novel class of platinum(II) G-quadruplex stabilizers at inhibiting telomerase activity. We showed that these ligands efficiently stabilize telomeres and inhibit telomerase activity with comparable potency to telomestatin (a potent telomerase inhibitor). Additionally, these ligands may present a potent dual action strategy to not only inhibit telomerase function, but also disrupt telomere function and assembly. Accordingly, targeting telomere function / La télomérase synthétise les séquences télomériques et se compose minimalement d'une sous-unité transcriptase inverse (TERT) et d'un fragment d'ARN (TR). Nous avons reconstitué des complexes hétérologues TERT-TR humains et murins ainsi que des complexes chimériques mTERT-hTERT-hTR in vitro et dans des cellules immortalisées utilisant un mécanisme alternatif d'élongation des télomères (cellules ALT). Nos résultats suggèrent que les déterminants espèce-spécifiques de l'activité, la processivité et la fonction télomérique sont attribués non seulement au composant TR mais aussi au composant TERT de la télomérase. Les complexes hTERT-hTR, mais non les complexes hétérologues TERT-TR ou mTERT-hTERT-hTR ont diminué le pourcentage de chromosomes sans signal télomérique de façon significative lorsqu'exprimés dans des cellules ALT. De plus, il a été démontré que les complexes hétérologues et chimériques sont déficients quant à leur recrutement aux télomères. Nos résultats suggèrent que plusieurs domaines de TERT et la présence d'interactions entre plusieurs protéines sont requis pour le recrutement de la télomérase aux télomères les plus courts dans les cellules ALT. La capacité de hTERT à allonger les télomères murins les plus courts, et l'incapacité de mTERT à allonger les télomères humains les plus courts suggèrent que les mécanismes régulant le recrutement et l'activité de hTERT aux télomères les plus courts seraient régulés de façon moins rigoureuse que les mécanismes régulant ceux de mTERT. De tels résultats pourraient mener à la création de meilleures stratégies visant à inhiber la télomérase et la validation de celles-ci dans des modèles murins. Par exemple, les domaines de TERT qui confèrent des fonctions similaires dans les cellules humaines et murines risquent de représenter de meilleurs cibles thérapeutiques que les domaines de TERT possédant des fonctions espèce-spécifiques.$

In cancer progression, the development of metastases is characteristic of late stage disease and makes treatment and cure more difficult. In order for metastasis to occur, cancer cells must gain motile and invasive phenotypes. As one of the keystone proteins involved in cell motility and invasion, Focal Adhesion Kinase (FAK) has emerged as a good therapeutic target for the inhibition of metastases via targeted drug design and small molecule inhibitors. Accordingly, a small molecule inhibitor has recently been developed against FAK activation and signaling. However, drug resistance is common among targeted therapies. Development and classification of drug resistant cells elucidated the possible mechanism behind FAK inhibitor resistance such that second-line therapy drugs can be designed to overcome or avoid resistance. The overall data presented herein support the role of FAK as an important drug target in cancer metastasis as well as provide insight and direction for future FAK inhibitor design. / Dans la progression du cancer, le développement de métastases est caractéristique de la phase terminale et rend le traitement difficile. Afin que des métastases se dévelopment, les cellules cancéreuses doivent acquérir de la motilité ainsi qu'un phénotype invasif. Considéré come l'une des plus importantes protéines participant dans la motilité cellulaire, la prot éine Focal Adhesion Kinase (FAK) a émergé comme une bonne cible thérapeutique pour l'inhibition de métastases par la création de drogues ciblées et de petites molécules inhibitrices. Par conséquent, une molécule inhibitrice de l'activation de FAK et sa signalisation a été récemment développée. Cependant, J'ai demontré que la résistance est commune parmis ces drogues. Le dévelopement et la classification des clones de cellules résistantes ont permi d'élucider un mécanisme impiquant en partie une amplification de l'activité FAK; ce mécanisme permetter a de découvrir des analogues de deuxième génération pour surmonter ou éviter la résistance. L'ensemble de données présentées ci-dessous supportet le rôle de FAK comme une cible importante dans la prévention de métastases et exposent les futur directions pour contourner la résistance aux inhibiteurs de FAK.

Group II introns are a family of introns found in bacterial and organellar, but not in nuclear genomes. Many group II introns encode proteins termed maturases which are required for their splicing and retrotransposition. Recently four maturase-like proteins were identified in the Arabidopsis thaliana nuclear genome. The proteins encoded by these genes are termed nuclear maturases (NMATs). The four NMAT proteins are classified as NMAT1A, NMAT1B, NMAT2A, and NMAT2B. Nuclear maturases are predicted to have mitochondrial localization signals and a conserved X domain suggesting that these putative maturases are transported to organelles and may function in splicing of group II introns. My results indicate that NMAT1A, NMAT2A, and NMAT2B are all required for embryo viability. Analysis of mitochondrial transcripts from the mutant plants indicate that NMAT2A is necessary for efficient splicing of intron 1 of the nad2 gene, and that NMAT2A is necessary for efficient splicing of intron 1 of the nad5 gene. The results thus confirm the hypothesis that NMATs are required for the specific efficient splicing of mitochondrial transcripts. / Les introns du groupe II sont une famille d'introns trouvé dans les bactéries et organelles, mais non dans les génomes nucléaire. Beaucoup de ceux-ci codent pour des protéines appelées maturases qui sont requises pour l'épiçage et la retrotransposition. Récemment, quatre protéines maturase-like ont été trouvées dans le génome nucléaire d'Arabidopsis thaliana. Les protéines correspondantes à ces gènes ont été nommées maturases nucléaire (NMATs). Elles ont été classifiées NMAT1A, NMAT1B, NMAT2A, et NMAT2B. La prédiction d'un signal de localisation mitochondrial et d'un domaine X conservé suggèrent que ces protéines pourrais fonctionner dans l'épissage d'introns du group II. Mes résultats indiquent que NMAT1A, NMAT2A, et NMAT2B sont tous requis pour la viabilité embryonnique. L'analyse des transcrits mitochondriaux de ces plantes indiquent que NMAT2A est nécessaire pour un épissage efficace de l'intron 1 du gène nad2 et que NMAT2B est necessaire pour l'épissage de l'intron 1 du gène nad5. Les résultats confirment ainsi l'hypothèse que les NMATs sont requises pour un épissage efficace de transcrits mitochondriaux spécifiques.

The conjugation of ubiquitin to proteins is catalyzed sequentially by a cascade of members of three classes of enzymes – ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin conjugating enzyme (E2), and ubiquitin protein ligase (E3). Polyubiquitinated protein substrates are selectively targeted for degradation by the proteasome. Removal of ubiquitin from ubiquitinated substrates is catalyzed by deubiquitinating enzymes (DUB). In this thesis, I have explored functions of three specific enzymes of the ubiquitin system, the E2 UBC4-testis, the HECT E3 EDD/Rat100 and the deubiquitinating enzyme USP19, in mammalian spermatogenesis or muscle wasting. UBC4-testis is a rodent testis specific E2 enzyme that is induced in round spermtids. Mice lacking the UBC4-testis gene had a delay in postnatal development during the first wave of spermatogenesis but ultimately had in adulthood normal fertility and testis weights, spermatid number, protein content, rate of ubiquitination and quantity and quality of sperm. When subjected to the heat stress of experimental cryptorchidism, the profile of germ cell degeneration was not significantly different from that of wild type mice. Our data suggest that UBC4-testis has a specific function in promoting the evolution of the first wave of spermatogenesis; however, some coexisting isoforms of UBC4 may serve redundant complementary functions in later stages of spermatogensis. EDD/Rat100 is a UBC4 dependent E3 that is highly expressed in rat testis. The poly(A)-binding protein (PABP) is a translation initiation factor that is negative regulated by the PABP-interacting protein 2 (Paip2). Both PABP and EDD/Rat100 share a PABC domain, through which they can interact with Paip2. EDD/Rat100 can ubiquitinate Paip2 in vitro. Under normal in vivo conditions, the abundant PABP may sequester Paip2 from ubiquitination by EDD/Rat100. In PABP-depleted cells, Paip2 is free to interact with EDD/Rat100, which leads to Paip2 ubiquitination and degradation by the proteasome. Degradation of Paip2 may then restore the activity of PABP and therefore maintain its homeostasis. Thus, the turnover of Paip2 in the cell is mediated by EDD/Rat100 but is regulated by PABP. In addition, six proteins that were copurified from immunoprecipitation of EDD/Rat100 in rat testis have been elaborately studied, but none of them was identified as a bona fide substrate of EDD/Rat100. Finally, I studied USP19, a 150 kDa DUB that is induced in atrophying skeletal muscle. A modest increase of expression of USP19 was observed in early differentiation of L6 cells. TNF-α can increase expression of USP19 in L6 myotubes. SiRNA mediated silencing of USP19 expression can increase expression of MHC in L6 myotubes in a myogenin dependent manner. And silencing of USP19 can partially reverse the TNF-α or DEX stimulated catabolism of MHC. Thus, USP19 can regulate synthesis of myofibrillar proteins through modulating transcriptional factor in myotubes. These data demonstrate that the ubiquitin system not only mediates the increased protein breakdown but is also involved in the decreased protein synthesis in atrophying skeletal muscle. / L'attachement de l'ubiquitine à un substrat protéique est catalysé par une série de réactions en chaîne impliquant trois classes d'enzymes- l'enzyme d'activation de l'ubiquitine (E1), l'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine (E2) et l'enzyme de ligation de l'ubiquitine (E3). Les substrats protéiques polyubiquitinés sont spécifiquement reconnus par le protéasome pour être dégradés. L'enlèvement de l'ubiquitine présent sur les substrats ubiquitinés est catalysé par les enzymes de déubiquitination (DUB). Dans cette thèse, j'ai étudié les fonctions de trois enzymes du système ubiquitine : l'enzyme E2 UBC4-testis, l'enzyme E3 EDD/Rat100 et l'enzyme de déubiquitination USP19. Leurs rôles dans la spermatogénèse et l'atrophie musculaire ont été étudiés chez les mammifères.UBC4-testis est une enzyme spécifiquement exprimée dans les testicules de rongeurs et est induite dans les spermatides ronds. Des souris ayant le gène UBC4-testis inactivé démontrent un délai dans le développement postnatal durant la première vague de spermatogénèse. Par contre, arrivées à l'âge adulte, ces mêmes souris démontrent une fertilité et un poids testiculaire normal. Aussi, nous avons observé des données normales pour le nombre de spermatides, le contenu protéique, le taux d'ubiquitination ainsi que pour la quantité et la qualité des spermatozoïdes. Lorsque les testicules de ces souris sont soumis à un stress de température en effectuant une cryptorchidie expérimentale, le profil de dégénérescence des cellules germinales n'était pas significativement différent de celui de souris normales ayant subit le même traitement. Nos résultats suggèrent donc que UBC4-testis exerce un rôle dans l'évolution de la première vague de la spermatogénèse mais il est possible que d'autres isoformes UBC4 puissent exercer des fonctions redondantes dans les étapes tardives de la spermatogénèse.EDD/Rat100 est une enzyme E3 qui est dépendante de l'enzyme E2 UBC4 et qui est fortement exprimée dans les testicules de rat. La protéine de liaison au Poly(A) (PABP) est un facteur d'initiation à la traduction qui est négativement régulé par une protéine interagissant avec PABP appelée Paip2. PABP et EDD/Rat100 ont en commun un domaine appelé PABC qui peut interagir avec Paip2. EDD/Rat100 est capable d'ubiquitiner Paip2 in vitro. Dans des conditions normales in vivo, PABP, qui est en abondance, pourrait séquestrer Paip2 pour être ubiquitiné par EDD/Rat100. Dans des cellules qui ont des niveaux de PABP réduits, Paip2 est libre d'interagir avec EDD/Rat100 et est donc ubiquitiné et dégradé par le protéasome. La dégradation de Paip2 peut finalement rétablir l'activité de PABP et par conséquent maintenir son homéostasie. Ainsi, le taux de renouvellement de Paip2 dans la cellule est géré par EDD/Rat100 mais est régulé par PABP. De plus, six protéines copurifiées par immunoprécipitation avec EDD/Rat100 dans des extraits de testicules de rat ont été minutieusement étudiées mais aucune d'entre elle n'a été identifiée comme étant un substrat bona fide de EDD/Rat100.Finalement, j'ai analysé USP19, une enzyme de déubiquitination qui est induite dans les muscles squelettiques dans des conditions d'atrophie musculaire. Une modeste augmentation de l'expression de USP19 a été observée dans des cellules L6 en début de différentiation. TNF- peut augmenter l'expression de USP19 dans les cellules L6. Lorsque les niveaux d'USP19 sont réduits par ARN interférent dans les myotubes L6, l'expression de MHC est augmentée de façon dépendante de la myogénine. Aussi, en diminuant les niveaux d'USP19, la dégradation de MHC stimulée par TNF- ou par DEX peut partiellement être renversée. Donc, USP19 peut réguler la synthèse de protéines myofibrillaires en modulant la transcription dans des cellules musculaires L6. Ces résultats démontrent que le système ubiquitine n'agit non seulement sur la dégradation protéique dans les muscles squelettiques atrophiés mais aussi en diminuant la synthèse protéique.

Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer and the second leading cause of cancer related deaths among Canadian women. Development of distant metastases is the leading cause of morbidity and mortality from this disease. Breast cancer is a highly heterogeneous disease that is amenable to intervention with targeted therapeutics; however, therapies that are currently available have limited efficacy in the metastatic setting. To identify novel molecular mediators of breast cancer bone metastasis that might also serve as therapeutic targets, we subjected 4T1 mammary carcinoma cells to in vivo selection in Balb/c mice and isolated sub-populations with an aggressively bone-metastatic phenotype. Gene expression profiling of these cells revealed Glycoprotein NMB (GPNMB), also known as Osteoactivin, as a gene that was highly expressed in bone metastatic breast cancer cells. GPNMB is a type I transmembrane, cell surface expressed protein with an extracellular RGD and PKD domains and a cytoplasmic hemITAM signaling motif that had not previously been implicated in breast cancer. We demonstrate that ectopic GPNMB expression was sufficient to promote migration and invasion of breast cancer cells in vitro and the formation of bone metastases in vivo.Subsequently, we analyzed GPNMB mRNA and protein expression levels in hundreds of breast tumors and found that GPNMB expression positively correlates with increased risk of metastasis and shorter overall survival times. We have also demonstrated that GPNMB is most commonly expressed in breast tumors belonging to the triple negative subtype, for which there are no targeted therapies currently available. We showed for the first time that CDX-011, a GPNMB-targeted monoclonal antibody-drug conjugate, was capable of killing GPNMB-expressing breast cancer cells in vitro and inducing tumor regression in vivo. Finally, we investigated the effects of GPNMB on primary tumor progression and found that it inhibits tumor cell apoptosis while enhancing angiogenesis and tumor growth in vivo. We demonstrate that the extracellular domain (ECD) of GPNMB can be proteolytically cleaved and shed from the surface of breast cancer cells, which is mediated by ADAM10. We postulated that the shed extracellular domain (ECD) of GPNMB might be responsible for some of its pro-angiogenic effects and showed that this ECD was indeed capable of inducing endothelial cell migration in vitro.The body of work described in this thesis is the first to identify GPNMB as a functional mediator of breast cancer growth and metastasis and to validate it as an important clinical target in human breast cancer. / Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et la seconde cause de mortalité associée au cancer chez les femmes canadiennes. Le développement de métastases est la cause majeure de la morbidité et de la mortalité dûes à cette maladie. Le cancer du sein est une maladie très hétérogène qui peut toutefois être traité par l'utilisation de thérapie ciblée ; toutefois, les thérapies actuellement disponibles ont un effet limité sur la formation des métastases. Dans le but d'identifier de nouveaux médiateurs moléculaires associés à la formation de métastases osseuses dérivées du cancer du sein et qui pourraient être utilisés comme cibles thérapeutiques, nous avons soumis les cellules de carcinome mammaire 4T1 à un processus de sélection in vivo dans des souris Balb/c. Nous avons ainsi isolé des sous-populations de cellules caractérisées par leur agressivité à former des métastases osseuses. L'étude de l'expression génique de ces cellules a mis en évidence que le gène codant pour la Glycoprotéine NMB (GPNMB), aussi connu sous le nom de Ostéoactivine, est très fortement exprimé dans les lignées de cancer du sein métastatiques pour l'os.GPNMB est une protéine de surface transmembranaire de type I qui possède des domaines RGD et PKD extracellulaires ainsi qu'un motif hemITAM de signalisation cytoplasmique et n'avait encore jamais été rapportée comme impliquée dans le cancer du sein.Nous avons démontré que l'expression ectopique de GPNMB était suffisante pour promouvoir la migration et l'invasion de cellules de cancer du sein in vitro ainsi que la formation de métastases in vivo.Par la suite, nous avons analysé les niveaux d'expression des ARNm et de la protéine GPNMB dans des centaines de tumeur du sein humain et avons observé que l'expression de GPNMB corrèle positivement avec un risque accru de présence de métastases ainsi qu'une réduction du temps moyen de survie. Nous avons également démontré que GPNMB est le plus fréquemment exprimé dans des tumeurs mammaires appartenant au sous-type triple négatif pour lequel il n'y a actuellement aucune thérapie ciblée disponible.Par ailleurs, nous montrons pour la première fois que CDX-011, une drogue conjuguée à un anticorps monoclonal reconnaissant GPNMB, était capable, in vitro, d'éradiquer spécifiquement les cellules de cancer du sein exprimant GPNMB ainsi que d'induire une régression tumorale in vivo.Finalement, nous avons déterminé les effets de GPNMB sur la progression des tumeurs primaires et avons observé que GPNMB inhibait l'apoptose des cellules tumorales tout en augmentant l'angiogenèse et la croissance tumorale in vivo. Nous avons démontré que le domaine extracellulaire de GPNMB (ECD) pouvait être clivé de façon protéolytique par ADAM10 et ainsi être libéré de la surface cellulaire des cellules de cancer du sein. Nous avons postulé que la forme extracellulaire clivée (ECD) de GPNMB pourrait être impliquée dans certains des effets pro-angiogénique et avons montré que cet ECD était capable d'induire la migration de cellules endothéliales in vitro.L'ensemble des travaux décrits dans cette thèse implique pour la premier fois est le premier à identifier GPNMB comme médiateur fonctionnel de la croissance du cancer du sein et de ses métastases. Ce travail identifie GPNMB comme une importante cible thérapeutique pour le traitement des patients atteints du cancer du sein.

As a cause of malignancy-induced hypercalcemia, PTHrP (parathyroid hormone-related protein) plays an important role in cell growth and differentiation. This peptide is unique in that it not only acts through membrane receptors but also translocates directly to the nucleus. Studies have shown that the repression of target gene expression is achieved through chromatin modifications induced by the PcG complex. As a core protein of the PcG complex, Bmi1 functions as a transcriptional repressor for various genes involved in development and cell proliferation. Recent studies have indicated that the skeletal phenotypes of PTHrP(1-84) knock-in mice are consistent with ones observed in Bmi1-/- mice in vivo. In addition, the down-regulation of Bmi1 expression was detected in PTHrP(1-84) knock-in mice. Both phenotypes indicate that there is correlation between Bmi1 and PTHrP. However, the molecular mechanism involved in correlation of PTHrP and Bmi1 regulation is poorly understood. The aim of this study was to gain insight into the underlying molecular mechanism of the way of PTHrP regulating Bmi1. We focused on the interaction between PTHrP and Bmi1 in vitro and in vivo system and the consequences exerted by this interaction. At first, co-localization of PTHrP and Bmi1 was demonstrated and the N-terminus of PTHrP was found to be responsible for the interaction both in vivo and in vitro. Second, we set up the repression assays in vivo to identify the promoters' activities and cell survival influenced by this direct interaction. As a result, overexpression of PTHrP and Bmi1 in HEK293 cells was shown to have an effect on p19Arf and Gal4 promoter activities in vivo. Thirdly, increased cell proliferation was detected in HEK293 cells and NIH 3T3 cells with overexpressed PTHrP and Bmi1 together. At the same time, I also discovered the elevation of cell survival rate in HEK293 and NIH 3T3 cells when PTHrP and Mel18 were expressed together. This study provides evidence that the hormone PTHrP physically and functionally interacts with Bmi1 and Mel18 to affect the activities of promoters in the nucleus and regulate cell proliferation. / La protéine Parathyroid hormone related-protein (PTHrP) joue un rôle très important dans la croissance et la différentiation cellulaire en plus d'être responsable de l'hypercalcémie induite par la malignité. Ce peptide est unique non seulement parce qu'il agit par l'intermediate de récepteurs transmembranaires, mais aussi parce qu'il est transloqué directement au noyau. Bmi-1, un peptide essentiel du PcG complexe, fonctionne comme un répresseur de transcription pour plusieurs gènes importants dans le développement et de l'organisme de la prolifération cellulaire. Cette fonction répressive régule l'expression des gènes cibles en induisant des modifications sur la chromatine (73). Des études publiées récemment démontrent que PTHrP influence l'expression moléculaire de Bmi-1 (95). Cependant, le mécanisme par lequel Bmi-1 contrôle PTHrP n'est pas encore bien documenté. Mon but premier est d'élucider les mécanismes moléculaires de cette interaction ensuite de trouver quelles conséquences fonctionnelles peuvent résulter de cette interaction. Au départ, la colocalisation de PTHrP et Bmi-1 a été démontrée dans le noyau de cellules HEK293. Ensuite, l'interaction entre Bmi-1 et PTHrP a été illustrée in vivo et in vitro. On a trouvé que c'est le N-Terminal qui est responsable des interactions in vivo et in vitro. De plus, la surexpression de PTHrP et Bmi-1 dans les cellules HEK293 provoque des effets minimes sur l'activité transcriptionelle des gènes et de l'expression du gène P19arf. En outre, la surexpression de PTHrP et Bmi-1 cause une augmentation du niveau de prolifération cellulaire dans les cellules HEK293 et NIH 3T3. En parallèle, j'ai découvert une augmentation du taux de survie des cellules HEK 293 et NIH 3T3 suite à surexpression des peptides PTHrP et Mel18. A été noteé ces études démontrent que l'hormone PTHrP interagit physiquement et est attaché fonctionnellement avec Bmi-1.

Rheumatoid arthritis (RA) is characterized by chronic inflammation, synovial hyperplasia and joint destruction. The pathogenic mechanisms responsible for RA remain poorly understood both systemically and in the microenvironment of diarthrodial joint. Here we hypothesized, based on previous observations, that there is a positive interaction between resident mast cells and synovial fibroblasts (SF) within the rheumatoid synovial compartment. Our principal objectives were to define the cellular and molecular interactions between infiltrating mast cells and resident human synovial fibroblasts (HSF), and we focused our efforts on two genes, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LO), both implicated in the inflammatory response associated with RA. Furthermore, our research led to the discovery of novel epigenetic mechanisms governing the regulation of 5-LO gene expression in RA-affected SF. Epigenetics refers to heritable changes in gene expression regulated by DNA methylation, histone modifications and RNA interference. Epigenetic regulation is critical for normal development and differentiation. But environmental factors can trigger epigenetic dysregulation, leading to the development of many diseases, including cancer and autoimmune diseases. Using Western and Northern blot analyses in addition to reporter assays, we demonstrated that mast cell-derived leukotriene B4 (LTB4) contributes to the modulation of inflammatory response in part through stabilization of COX-2 mRNA and protein expression in SF, the key enzyme in prostaglandin biosynthesis and the target of all non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Further transient and stable transfection experiments verified that LTB4 exerted this COX-2 stabilization effect at the post-transcriptional level through Ras/c-Raf/MEK1/2/ERK1/2/p42 AUF1 signaling pathway. Genomic bisulfite sequencing was used to detect DNA methylation profiles of 5-LO gene (rate limiting in LTB4 synthesis) in HSF, mast cells and other cell types. The 5-LO gene promoter (DNA CpG islands) was heavily methylated in U937 cells (5-LO negative), but unmethylated in HL-60 cells (5-LO positive). Compared to the 5-LO-positive HMC-1 cells, the 5-LO-negative HMC-1 cells had much higher methylation levels of CpG islands in the promoter region. We found a strong correlation between 5-LO gene expression and DNA methylation in HMC-1 cells. Dexamethasone (DEX) treatment of HMC-1 cells increased the expression of 5-LO, a process associated with reduced methylation of histone H3 on lysines 9 and 27. Interestingly, osteoarthritic (OA)/RA HSF are 5-LO negative; though the promoter region is CpG hypomethylated, histone H3 is hypermethylated at Lys-9 and -27 residues.The research in this thesis provided innovative insights into the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in inflammatory diseases like RA. The elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved in these studies may help to establish new therapeutical targets in the treatment of RA patients. Moreover, the bisulfite sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) techniques used in this thesis provide reliable procedures for DNA methylation and histone modification studies in various inflammatory diseases and cancers. / L'arthrite rhumatoïde est caractérisée par une inflammation chronique, une hyperplasie de la membrane synoviale et la destruction des jointures. Notre hypothèse, basé sur des observations précédentes, qu'il y avait une interaction positive entre les cellules mastocytes résidentielles et les fibroblastes synoviaux dans le compartiment de la synovial rhumatoïde. Nos objectifs principaux étaient de définir les interactions cellulaires et moléculaires entre les cellules mastocytes infiltrantes et les fibroblastes synoviaux résidentielles, en particulier deux gènes, la cyclooxygénase-2 et la 5-lipoxygénase (5-LO), tous deux impliquées dans la réponse inflammatoire associée à l'arthrite rhumatoïde. De plus, notre recherche a abouti à la découverte de mécanismes épigénétiques gouvernant la régulation de l'expression du gène de la 5-LO chez les fibroblastes synoviales atteint d'arthrite rhumatoïde. L'épigénétique est l'ensemble des modifications de l'expression des gènes contrôlés par la méthylation de l'ADN, les modifications aux histones liées à l'ADN et par interférence ARN transmissibles d'une génération de cellule à l'autre. La régulation épigénétique est indispensable pour la différentiation et le développement normal. Cependant, des facteurs environnementaux peuvent entamer un désordre épigénétique causant ainsi plusieurs maladies, tels que le cancer et des maladies auto-immunes.Avec les méthodes d'analyse par buvardage Western et Northern, en plus des essais rapporteurs, nous avons démontré que le leukotriène B4 (LTB4) produit par les cellules mastocytes contribues à la modulation de la réponse inflammatoire en parti par la stabilisation de l'ARN messager de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et de l'expression de la protéine chez les fibroblastes synoviaux, l'enzyme clé de la biosynthèse des prostaglandines et la cible de tous les drogues anti-inflammatoires non stéroïdiens. De plus, les expériences de transfections transitoires et stables ont démontré que le LTB4 a exercé cet effet de stabilisation de la COX-2 au niveau post-transcriptionnelle par l'intermédiaire de la voie de signalisation de Ras/c-Raf/MEK1/2/ERK1/2/p42 AUF1. Le séquençage génomique avec traitement au bisulfite a été utilisé pour déterminer le profile de méthylation de l'ADN du gène de la 5-LO (enzyme clé dans la synthèse du LTB4) chez les fibroblastes synoviaux humains, les cellules mastocytes et d'autres types cellulaires. Le promoteur du gène 5-LO (îlots d'ADN CpG) était fortement méthylé chez les cellules U937 (5-LO négatif), cependant chez les cellules HL-60 le promoteur n'était pas méthylé (5-LO positif). En comparant les cellules HMC-1 qui expriment la 5-LO aux cellules HMC-1 qui n'expriment pas la 5-LO, ces derniers avaient de fort niveaux de méthylation des îlots CpG dans la région du promoteur. Nous avons trouvé une forte corrélation entre l'expression du gène 5-LO et la méthylation de l'ADN chez les cellules HMC-1. Le traitement des cellules HMC-1 avec la dexamethasone (DEX) augmente l'expression de la 5-LO, un processus associé à la réduction de la méthylation de l'histone H3 sur les lysines 9 et 27. Il est intéressant de voir que les fibroblastes synoviaux humains ostéoarthritique (OA)/RA sont 5-LO négatif; quoique la région du promoteur CpG est hypométhylé alors que l'histone H3 est hyperméthylé aux lysines 9 et 27.La recherche de cette thèse propose un cheminement innovateur à la compréhension des mécanismes physiopathologique impliqué dans les maladies inflammatoires telle que l'arthrite rhumatoïde. L'élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ses études peuvent aider à l'établissement de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde. De plus, la technique de séquençage de l'ADN avec le traitement au bisulfite utilisé dans cette thèse est fiable pour des études de méthylation de l'ADN et la modification des histones chez plusieurs maladies inflammatoires ainsi que les cancers.

Genotype, phenotype, and environment interact in complex non-linear ways during development and evolution. Wing polyphenism, which is the ability of a single genome to produce winged and wingless castes depending on environmental cues, is a good model for understanding these complex interactions. Although wing polyphenism evolved just once and is a homologous trait across all ant species, the gene network underlying wing polyphenism has evolved, i.e., the gene network is conserved in the winged castes of ants, but is interrupted at different points of this network in the wingless castes of different species. This represents an example of developmental system drift (DSD) in that a homologous trait is encoded by non-homologous genes or gene expression patterns. My PhD research is therefore focused on understanding DSD of the gene network underlying wing polyphenism in ants. In CHAPTER 2, I tested whether the gene brinker (brk) is a key node in the network underlying wing polyphenism, and predicted that when up-regulated, brk would reduce growth and induce apoptosis in the vestigial wing discs of wingless castes. I therefore examined the expression of brk and its upstream genes engrailed (en) and decapentaplegic (dpp) and its downstream gene spalt (sal) in the winged castes and wingless soldiers of the ant Pheidole morrisi during last larval and prepupal development. I found that the expression of these genes is conserved in the wing discs of winged castes relative to their expression in Drosophila wing disc. However, the expression of the above genes is interrupted in the vestigial forewing discs of soldiers relative to that in the wing discs of winged castes. Surprisingly, I discovered that brk expression is absent throughout vestigial wing disc development, and this absence is correlated with abnormal growth of the soldier forewing disc as revealed by En expression and morphometric analyses. Furthermore, the expression of dpp and sal changes dynamically during the transition from last larval to prepupal development, and is spatially and temporally correlated with the induction of apoptosis at the beginning of prepupal development. In CHAPTER 3, I tested whether brk expression has evolved across different ant species and whether or not it is correlated to the expression of its upstream gene regulators in the network. I therefore examined the expression of brk and its upstream gene en in the winged and wingless caste of three ant species: Tetramorium caespitum, Crematogaster lineolata, and Lasius niger. I found that the expression of both brk and En is conserved in the wing discs of winged castes. However, in the wingless workers, the expression of En is absent in the vestigial wing discs of T. caespitum and C. lineolata, but is present in L. niger. brk expression is absent in the vestigial wing discs of the three ant species regardless of the presence or absence of En expression. Taken together, these results suggest that the absence of brk expression may be a common interruption point in the wingless castes of derived ant species. / Le génotype, le phénotype et l'environnement interagissent de façon complexe et non-linéaire durant le développement et l'évolution. Le polyphénisme des ailes, qui est la capacité pour un simple génome de produire des castes avec ou sans ailes, selon les stimuli environnementaux, est un bon exemple pour faciliter la compréhension de ces types d'interactions complexes. Malgré que le polyphénisme des ailes ait évolué qu'une fois et qu'il soit également une caractéristique homologue pour toutes les espèces de fourmis, le réseau de gènes sous-jacent du polyphénisme des ailes a évolué. Par exemple, le réseau de gènes est maintenu dans la caste ailée des fourmis mais est interrompu à différents endroits dans ce réseau, dans la caste non ailée de différentes espèces. Ceci représente un exemple de la déviation du système de développement (DSD), en ce, qu'une caractéristique homologue soit encodée par des gènes ou des patrons d'expression non-homologues. Ma recherche doctorale est concentrée sur la compréhension DSD du réseau des gènes sous-jacent au polyphénisme des ailes chez les fourmis. Dans le CHAPITRE 2, j'ai effectué des tests sur le gène brinker (brk) afin de déterminer si celui-ci est un noeud clé dans le réseau sous-jacent du polyphénisme des ailes et en suis venue à la conclusion que, lorsque ce gène brk est sur-régulé, il ya diminution de la croissance et induction de l'apoptose des disques vestigiaux de l'aile chez les castes non ailées. Donc, j'ai examiné l'expression du brk et ses gènes en amont, engrailed (en) et decapentaplegic (dpp), ainsi que ses gènes en aval, appelés spalt (sal), chez les castes ailées et soldats non ailés de l'espèce Pheidole morrisi de la fourmi pendant le dernier stade du développement larvaire et le développement prépupal. J'ai trouvé que l'expression de ces gènes est conservée dans les disques de l'aile chez les castes ailées relativement à leur expression dans le disque de l'aile Drosophile. Par contre, l'expression des gènes ci-dessus est interrompue au niveau des disques antérieurs vestigiaux chez les soldats relativement à ceux des disques de l'aile chez les castes ailées. Étonnamment, j'ai trouvé que l'expression brk est inexistante pendant tout le développement du disque vestigial de l'aile et cette absence est en corrélation avec la croissance anormale du disque antérieur de l'aile du soldat, tel que révélé par les analyses morpho métriques et les expressions du gène en. De plus, les expressions dpp et sal sont modifiées dynamiquement pendant la dernière transition du stade larvaire au développement prépupal, et est spatialement et temporellement en corrélation avec l'induction de l'apoptose au début du développement prépupal. Dans le CHAPITRE 3, j'ai testé si l'expression du brk avait évolué chez différentes espèces de fourmis et s'il était en corrélation ou non avec l'expression du régulateur du gène en est situé en amont du réseau. J'ai donc examiné l'expression du brk ainsi que son gène en en amont, au niveau des castes ailées et non ailées chez trois espèces de fourmis: Tetramorium caespitum, Crematogaster lineolata, et Lasius niger. J'en ai conclu que l'expression des brk et en est conservée dans les disques des ailes chez les castes ailées. Par contre, chez les travailleurs non ailés, l'expression du en est inexistant dans les disques vestigiaux de l'aile chez le T.caespitum et le C. lineolata, mais est présent chez L. niger. L'expression brk est inexistante dans les disques vestigiaux de l'aile chez trois espèces de fourmis, sans tenir compte de l'absence ou la présence de l'expression en. Tous ces résultats confondus suggèrent que l'absence de l'expression brk pourrait être le point commun d'interruption chez les castes non ailées des espèces dérivées de fourmis.