Protein stability in solution is often a limiting factor in certain biochemical and structural biology studies. Proteins from the thermotolerant vertebrate Dipsosaurus dorsalis, the desert iguana, have been studied as a possible means to provide stable homologues of mammalian proteins of interest, notably the first nucleotide-binding domain (NBD1) of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cystic fibrosis (CF) is an often fatal human disease, which is caused by the malfunction of CFTR. The vast majority of CF patients have a common mutation: a deleted phenylalanine residue (F508) located in the NBD1 domain. The genes coding for the desert iguana NBD1 (iNBD1) and the C-terminal domain of poly-A binding protein (iPABC) were both cloned by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) of RNA purified from heart tissue. The human and iguana PABC amino acid sequence was found to be identical. Comparison of the iguana NBD1 amino acid sequence to human showed that four amino acid substitutions known to solubilize human NBD1 were naturally occurring in the desert iguana. These residues are localized on a solvent-exposed face of the domain. Sequence analysis of published genomes showed that these solubilizing residues are not unique to the desert iguana. The iNBD1 protein was purified as a GST fusion and an HSQC spectrum was recorded. This analysis offers preliminary data to drive and direct future structural biology studies using thermostable proteins from D. dorsalis. / La stabilité d'une protéine s'avère souvent le facteur limitant lors d'études structurales. Des protéines provenant du vertébré thermotolerant Dipsosaurus dorsalis, l'iguane du désert, ont été étudiés en tant qu'homologues plus stables de protéines d'origine mammifère, notamment le premier domaine de liaison aux nucléotides (NBD1) du canal transmembranaire CFTR. La fibrose kystique est une maladie souvent mortelle causée par le dysfonctionnement de la protéine CFTR. La majorité des patients atteint de la fibrose kystique ont une mutation commune dans leur gène CFTR: la suppression d'un acide aminé phenylalanine (F508) situé dans le domaine NBD1. deux gènes codants pour des protéines de l'iguane du désert correspondant aux domaines NBD1 (iNBD1) et PABC (terminal carboxylique de la protéine se liant aux poly-A) (iPABC) ont étés clonés par RT-PCR d'ARN purifié d'un échantillon de tissue cardiaque. La séquence d'acides aminés de PABC était identique entre l'humain et l'iguane. Celle de iNBD1 a été comparée a celle de mutants humain stables; quatre substitutions stabilisantes se retrouvaient naturellement dans iNBD1 et étaient localisées sur une face du domaine exposée au solvant. Un alignement multiple démontra que ces acides aminés ne sont pas uniques à D. dorsalis. La protéine iNBD1 fut purifiée en tant que fusion GST un spectre HSQC fut enregistré. Cette analyse offre des données préliminaires qui guideront de futures études structurales utilisant des protéines thermostables de D. dorsalis.

CD45, also known as Leukocyte-common antigen (LCA), is a type-1 receptor-like protein tyrosine phosphatase (PTPase), which contains two PTPase domains, the membrane proximal domain (DI) and the membrane distal domain (D2). It is uniquely expressed on the surface of all leukocytes and their hematopoietic precursors and plays an important role in immunoreceptor signaling. In this study, I identified a novel CD45-interacting protein, Fyb, through screening human leukocyte cDNA library with a modified yeast two-hybrid system. Fyb is an adaptor protein mainly involved in the regulation of T cell receptor-induced integrin clustering and adhesion. It contains several regions with potential to mediate protein-protein interactions and has been shown to bind to the Src family kinase Fyn, the adapter protein SLP-76, Ena/VASP proteins, the adapter protein SKAP55, and SKAP55-HOM in T cell receptor signaling. I also demonstrated that the interaction of Fyb with CD45 was through involves the C-terminal region of Fyb, where several tyrosine residues, such as Tyr 594 and Tyr624, are critical for its interaction with other proteins in signaling. The interaction of Fyb with CD45 is phosphotyrosine-dependent since Src kinase is required for the interaction. Mutation analysis revealed that the tyrosine residue 624 of Fyb is the pivotal tyrosine residue involved in its association with CD45, whereas tyrosin 594 was not found to be required for binding. By mutation of CD45, it was demonstrated that the phosphatase catalytic D1 domain of CD45 was involved in the interaction with Fyb. More significantly, I found that only the substrate-trapping mutant (Asp to Val), but not the wild type CD45 interacted with Fyb, suggesting that Fyb is a potential CD45 substrate. Furthermore, I demonstrated the association of the C-terminal fragment of Fyb with CD45 in mammalian cells. However, I was not able to determine the interaction of the wild type Fyb with CD45 in 293 cells.

The quaking gene encodes a family of alternatively spliced RNA binding protein isoforms that differ in their C-terminal regions. All of the QUAKING (QKI) proteins contain a single stranded RNA binding domain, KH domain, and are part of the larger STAR (Signal Transduction and Activator of RNA) family. These isoforms have expression patterns that differ spatially and temporally and coincide with development of both central and peripheral nervous systems. The QKI proteins have been implicated in several post-transcriptional mechanisms such as pre-mRNA splicing, mRNA export, mRNA stability and protein translation. Although the QKI protein is known to exist as homo- and heterodimeric forms, the size of its cellular complex and its components are largely uncharacterized. Herein, I have confirmed that QKI indeed forms a large protein complex and in addition defined the size of the complex and identified some of its components. Using a second approach, I also identified the microRNA-processing enzyme Argonaute 2 (Ago2) protein as one of QKI interacting proteins and biochemically validated and characterized its association with QKI in vivo. Furthermore, I generated a qkI-6 and qkI-7 conditional allele that will generate a new mouse model, in order to delineate the correlation between QKI and micro RNA processing.

The myocyte enhancer factor 2 (MEF2) family of transcription factors plays important roles during muscle differentiation as well as in different programs of non-muscle cells. Covalent modification has emerged as an important mechanism for regulating MEF2 function. The goal of my thesis project was to identify novel post-translational modifications that modulate MEF2 transcriptional activity and to determine whether histone deacetylases coordinate these modifications. I first demonstrated that MEF2D is modified by the ubiquitin-like protein SUMO. Sumoylation of MEF2D at a single residue, lysine 439, inhibits the myogenic activity of this transcription factor. Fascinatingly, histone deacetylase 4 (HDAC4) potentiates the sumoylation of MEF2D. In addition, HDAC4 stimulates this modification by promoting phosphorylation of serine 444 of MEF2D. In support of this, phosphorylation of serine 444 is required for sumoylation at lysine 439. Thus, I have identified a phospho-sumoylation switch that turns on and off MEF2-dependent transcription. Moreover, I found that MEF2D is subject to lysine acetylation catalyzed by the acetyltransferases PCAF and p300. Unexpectedly, HDAC3, but not HDAC4 and homologs, reverses this modification. Moreover, HDAC3 reverses autoacetylation of p300 and PCAF. Altogether, these results indicate that HDAC3 and HDAC4 are important regulators with distinct role in controlling MEF2 modifications, and further suggest that multiple HDACs cooperate to achieve efficient control of MEF2-dependent transcription and that disruption of MEF2-HDAC interaction may lead to pathological conditions like cardiac hypertrophy, coronary artery disease and lymphoblastic leukemia.

Proper chromosome segregation at meiosis I depends on the initial alignment of homologous chromosomes, the establishment of the synaptonemal complex (SC), and the formation of chiasma between homologs. Previous studies have demonstrated that HIM-3, a component of the meiotic chromosome axis, is required for these processes through the recruitment of the autosomal pairing center proteins (ZIMs) and of SC components like SYP-1. The him-3(vv6) mutation results in the substitution of a highly conserved residue in the HORMA domain, believed to mediate protein-protein interactions. him-3(vv6) mutant germlines display immature and discontinuous axes at early meiosis and the autosomal pairing center (PC) protein ZIM-3 fails to localize properly to the pairing centers, despite the fact that HIM-3vv6 is appropriately expressed and localized; mutants exhibit severe defects in homolog alignment, extensive nonhomologous synapsis and defects in chiasma formation, resulting in a high embryonic lethality (emb) and a high incidence of male (him) phenotype as consequences of chromosome missegregation. To identify proteins that interact with HIM-3 in early meiotic processes and other proteins that function in the HIM-3 pathway, an EMS-based suppressor screen was performed using the vv6 allele and a strong extragenic suppressor, vv39 was isolated. vv39 was identified as a novel allele of cct-4, which encodes the delta subunit of type II chaperonin complex. In wild-type germlines, CCT-4 is localized to the cytoplasm and to the nucleus, indicating that it has a nuclear role. In germlines depleted for cct-4 or other subunits of the CCT complex, axis assembly is delayed, ZIM-3 fails to be recruited to the PCs and SYP-1 fails to localize to the axes, suggesting that the CCT complex is required for morphogenesis of meiotic chromosome axes competent for meiotic processes. In him-3(vv6); cct-4(vv39) mutants, the timely morphogenesis of chromosome axes is appears to be restored and is accompanied by ZIM-3 recruitment to PCs, improved homologue alignment and reduced nonhomologous synapsis. These results collectively suggest that CCT-4 mediates timely axes morphogenesis through CCT-mediated folding of axis component HIM-3 or its interactors. This study is the first to provide insight on the function of molecular chaperonin in mediating meiotic processes and reveals an unprecedented nuclear function for the complex. It would be interesting in the future to further study the nuclear CCT chaperonin complex and its clients to learn more about their roles in meiotic processes. / La ségrégation des chromosomes lors de la méiose I dépend de l'alignement initial de chromosomes homologues, la mise en place du complexe synaptonémal (SC), et la formation de chiasmas entre les homologues. Des études antérieures ont démontré que HIM-3, une composante de l'axe du chromosome méiotique, est requis pour ces processus par le recrutement des protéines autosomique centre de liaison (ZIMS) et des composants SC comme SYP-1. Le him-3(vv6) mutation se traduit par la substitution d'un résidu hautement conservé dans le domaine HORMA, considérés comme des médiateurs des interactions protéine-protéine. him-3(vv6) germlines mutant affichage des axes immature et discontinue à la méiose précoce et le centre autosomique appariement (PC) protéine ZIM-3 ne parvient pas à localiser correctement vers les centres de liaison, malgré le fait que HIM-3vv6 est correctement exprimé et localisées; mutants présentent des défauts graves dans homologue alignement, non homologue vaste synapse et des défauts dans la formation des chiasmas, entraînant une mortalité élevée embryonnaires (emb) et une incidence élevée de sexe masculin (him) comme des conséquences de phénotype missegregation chromosome. Pour identifier les protéines qui interagissent avec HIM-3 au début du processus de la méiose et d'autres protéines qui fonctionnent dans la voie HIM-3, un crible EMS à base de suppresseur a été réalisée avec l'allèle vv6 et un suppresseur de forte extragénique, vv39 a été isolé. vv39 a été identifié comme un nouvel allèle de cct-4, qui code pour la sous-unité delta du complexe chaperonine type II. En germlines de type sauvage, cct-4 est localisée dans le cytoplasme et le noyau, ce qui indique qu'il a un rôle nucléaire. En germlines appauvri pour cct-4 ou d'autres sous-unités du complexe du CCT, le montage axe est retardée, ZIM-3 ne parvient pas à être recrutés pour les PC et SYP-1ne parvient pas à localiser les axes, ce qui suggère que le complexe CCT est nécessaire pour la morphogenèse des axes chromosome méiotique compétente pour les processus de la méiose. En him-3(vv6); cct-4 (vv39) mutants, la morphogenèse en temps opportun des axes chromosome est semble être restauré et il est accompagné par ZIM-3 de recrutement pour les PC, l'alignement homologue accrue et une réduction non homologue synapsis. Ces résultats suggèrent collectivement que CCT-4 est un médiateur de axes morphogenèse par pliage de l'axe composante HIM-3 ou des interacteurs du HIM-3. Cette étude est la première à donner un aperçu sur la fonction de chaperonine moléculaire dans la médiation des processus méiotique. Il serait intéressant à l'avenir d'approfondir l'étude du complexe nucléaire chaperonine CCT et de ses clients à en apprendre davantage sur leur rôle dans les processus de la méiose.

PKR has been shown to play an essential role against VSV infection by phosphorylating eIF2alpha leading to the inhibition of protein synthesis. Through this capacity PKR is thought to be a mediator of the anti-viral and anti-proliferative actions of IFNs. In addition to translational control, PKR has been shown to modulate the transcriptional activities of NF-kappaB, Stats and p53. However, experiments with two different PKR-/- mouse models have failed to verify many of the biological functions attributed to PKR. Here, we show that the two PKR-/- MEFs express different PKR truncated proteins suggesting that both PKR-/- models are incomplete knockouts. The expression of the PKR variants may account for the significant signaling differences between cells from the two PKR-/- mice. / We also demonstrate that another eIF2alpha kinase, PERK contributes to cellular resistance towards VSV infection. We demonstrate that PERK -/- MEFs are more susceptible to VSV-mediated apoptosis than PERK +/+ MEFs. The higher replication capacity of VSV in PERK-/- MEFs results from their inability to attenuate viral protein synthesis due to an impaired eIF2alpha phosphorylation. We also show that VSV-infected PERK-/- MEFs are unable to fully activate PKR suggesting a cross-talk between the two eIF2alpha kinases in virus infected cells. These findings further implicate PERK in virus infection, and provide evidence that the anti-viral and anti-apoptosic roles of PERK are mediated, at least in part, via the activation of PKR. / Despite the translational control function of eIF2alpha kinases, we demonstrate their implications in p53 inactivation. Specifically, we show that PERK activation is responsible for the proteasomal degradation of p53 in a manner that is independent of translational control. This role is not specific for PERK, since the PKR also promotes p53 degradation in response to dsRNA transfection. We established that activation of eIF2alpha kinases leads to the activation of GSK3beta thus promoting the Mdm2-dependent degradation of p53. That is, induction of eIF2alpha kinases leads to the nuclear localization of GSK3beta, and the nuclear export and proteasomal degradation of p53. Our findings establish a novel cross-talk between the eIF2alpha kinases and p53 with significant implications in stress responses that control cell proliferation and tumorigenesis.

Glioblastoma multiforme is the most lethal primary brain tumor with a mean patient survival of 12 - 15 months. Efforts to treat glioblastoma with chemotherapeutics or radiation therapy have been largely ineffective, which is why the current treatment paradigm is predominantly based on surgery. Herein, it has been shown that the extent of surgical resection is correlated with patient outcome, i.e. less residual cancer cells result in a prolonged time to recurrence. In glioblastoma patients, magnetic resonance imaging (MRI) is used in diagnosis, MRI-guided surgery, and monitoring of disease progression. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONPs) are currently receiving increased attention as MRI contrast agents for brain imaging. Their reported proton relaxation properties, biocompatibility, and retention times are superior to the commonly employed gadolinium-based contrast agents. In addition, their larger surface area allows for the conjugation of targeting moieties and/or labels used for multi-modal imaging (e.g. fluorophores, radioisotopes). One of the most frequent genetic alterations in primary glioblastoma involves the epidermal growth factor receptor (EGFR). EGFR over-expression due to gene amplification is observed in 50 - 71% of the patients and among these the simultaneous expression of EGFR mutants is frequently seen. The most common mutation is the deletion of exon 2 – 7 of the extracellular domain, which results in ligand-independent, constitutive activation of the intracellular kinase domain. This mutant is named EGFRvIII and has been intensely investigated as potential therapeutic target, since it is considered a tumor-specific antigen, The objective of this project is to develop EGFR-targeted IONPs to improve the delineation of tumor outlines through targeted delivery of this MRI contrast agent to tumor cells. In addition, dual-labeling of the nanoplatform with near infrared fluorescent probes is expected to permit intra-operative optical imaging of infiltrative tumor cells, thereby decreasing the number of residual cancer cells left after surgical resection. To date antibodies have been the most successful targeting ligands and several immunoconjugates are already approved for molecular imaging in humans. However, small overall size (<100 nm) of the nanoparticle is crucial for achieving extended blood circulation times and high tumor penetration. Therefore, the use of smaller antibody fragments instead of the entire immunoglobulin molecule is preferred. In this study, I characterized novel anti-EGFR single domain antibodies (sdAbs) for their application as targeting moieties for nanoparticulate contrast agents. I determined the specificity and binding kinetics of these sdAbs for their targets EGFR and EGFRvIII using surface plasmon resonance (SPR) biosensor analysis and cell-based assays. I then conjugated the sdAbs to the surface of commercial IONPs and, after thorough investigation of the physical properties, I tested the tumor-targeting ability of these immuno-IONPs in a glioblastoma xenograft model. My findings are in agreement with published observations on the in vivo distribution of targeted superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Modern SPR biosensors also allow the assessment of not only the binding affinity and kinetics, but also the thermodynamic parameters of protein-protein interactions. I therefore extended the use of this technology to study the interaction of a selected anti-EGFR sdAb with the extracellular domain of EGFR (EGFR-ECD), and compared this to binding of its natural ligand, the epidermal growth factor (EGF). I demonstrate that distinct thermodynamic driving forces govern sdAb and ligand binding to EGFR-ECD. My findings complement the available structural information and provide new insight into potential mechanisms of EGF-mediated receptor activation. / Le glioblastome multiforme est la tumeur primaire du cerveau la plus mortelle avec un taux de survie moyen des patients de 12 – 15 mois. Les efforts pour traiter le glioblastome avec de la radiothérapie ou des agents chimiothérapeutiques ont été largement inefficaces, ce qui explique pourquoi le paradigme de traitement actuel est avant tout basé sur la chirurgie. Ici, il a été démontré que l'étendue de la résection chirurgicale est corrélée avec le pronostic des patients. Chez les patients de glioblastome, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est utilisée dans le diagnostic, durant la chirurgie guidée par IRM, et pour le suivi de la progression de la maladie. Les nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (IONPs) reçoivent actuellement une attention accrue comme agents de contraste en IRM pour l'imagerie cérébrale. Leurs propriétés de relaxation des protons, leur biocompatibilité et leur temps de rétention sont supérieurs aux agents de contraste à base de gadolinium couramment employée. En outre, leur surface plus grande permet la conjugaison des agents de ciblage et/ou étiquettes utilisées pour l'imagerie multimodale. Une des altérations génétiques les plus fréquentes dans le glioblastome primaire implique le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), sa surexpression est observée dans 50 – 71% des patients et parmi ceux-ci l'expression simultanée de mutants EGFR est fréquemment observé. La mutation la plus fréquente est la délétion de l'exon 2 – 7 de domaine extracellulaire, ce qui rend le EGFR insensible au ligand, et mène à l'activation constitutive de la kinase intracellulaire. Ce mutant est connu sous le nom EGFRvIII. L'objectif de ce projet est de développer des IONPs spécifiques pour l'EGFR afin d'améliorer la délimitation des contours de la tumeur grâce à l'administration d'agents de contraste IRM ciblée vers les cellules tumorales. En outre, le double-étiquetage de cette nanoplateforme avec des sondes fluorescentes proche infrarouge permettra l'imagerie optique intraopératoire des cellules tumorales infiltrantes aidant à une résection chirurgicale plus précise et ainsi diminuant le nombre de cellules cancéreuses résiduelles après l'opération. La petite taille globale (<100 nm) de la nanoparticule permet d'atteindre une circulation sanguine prolongée et une pénétration tumorale élevée. Dans cette étude, j'ai caractérisé des fragments d'anticorps contre l'EGFR pour leur application comme unité de ciblage et pouvant potentiellement servir comme agents de contraste nanoparticulaire. J'ai déterminé par résonance plasmonique de surface (SPR) et dans des tests cellulaires la spécificité et la cinétique de liaison de ces anticorps à domaine unique pour leurs cibles EGFR ainsi que pour le mutant EGFRvIII. J'ai ensuite conjugué ces anticorps à domaine unique sur la surface de IONPs commerciales et, après analyse approfondie de leurs propriétés physiques, j'ai testé la capacité de ciblage tumoral de ces immuno-IONPs dans un modèle de xénogreffe de glioblastome. Mes conclusions sont en accord avec les observations publiées sur la distribution in vivo des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer ciblés. Les biocapteurs SPR modernes permettent également la détermination des paramètres thermodynamiques pour les interactions protéine-protéine. J'ai donc utilisé cette technologie pour étudier l'interaction d'un anticorps à domaine unique contre l'EGFR avec le domaine extracellulaire de l'EGFR (EGFR-ECD) en comparaison à la liaison avec son ligand naturel, le facteur de croissance épidermique (EGF). J'ai démontré que des forces motrices thermodynamiques distinctes conduisent l'interaction d'EGFR-ECD avec l'anticorps en comparaison d'avec le ligand. Mes conclusions sont en accord avec les informations structurelles disponibles et fournissent un nouvel éclairage sur les mécanismes potentiels de l'activation du récepteur par l'EGF.

Telomerase, the main mechanism for telomere maintenance, is active in 85% of cancer cells. Telomerase inhibition leads to telomere erosion, chromosome damage, and cell death, thereby validating the enzyme as a prime target in the search for anticancer therapies. hTERT genome analysis revealed the potential for complex splicing patterns that may reflect a specific aspect of telomerase regulation in proliferation, differentiation and apoptosis (Sykorova and Fajkus 2009).A number of alternatively-spliced TERT mRNAs in vertebrates and plants have been identified, yet their role in telomere maintenance and cell survival is poorly characterized. We have identified several novel mTERT variants and are pursuing characterization of two variants, one contains an in-frame insertion in the N-terminus (Ins-i1[1-102]), a region important for binding to the telomerase RNA and telomeric substrates, and the other a C-terminally located deletion (Del-e12[1-40] in the RT domain that generates a premature stop codon and encodes a protein lacking the C-terminus. In-vitro, the alternatively spliced mTERT variants display decreased telomerase activity, most likely due to their defect in template RNA and telomeric DNA binding affinities. For the deletion variant, this decrease in activity was consistent in telomerase positive cells, which, by middle passage, appeared to have a noticeable growth defect. By acquiring a detailed understanding of mouse TERT alternative splicing, we can advance our knowledge on telomerase regulation and new mechanisms for inhibiting telomerase in tumour cells. / La télomérase est le mécanisme principal de maintien des télomères et est actif dans 85% des cellules cancéreuses. L'inhibition de la télomérase entraîne l'érosion des télomères, des lésions chromosomiques et la mort cellulaire, ce qui démontre que cette enzyme pourrait être une cible importante dans la recherche de thérapies anticancéreuses. L'analyse du génome de la télomérase a révélé le potentiel des motifs d'épissage complexes qui peuvent démontrer un aspect spécifique de la régulation de l'enzyme dans la prolifération, la différenciation et l'apoptose (Sykorova and Fajkus 2009)Un certain nombre d'ARNm TERT alternativement-épissés ont été identifiées chez les vertébrés et les plantes, mais leurs rôles dans le maintien des télomères et la survie cellulaire sont mal caractérisés. Nous avons identifié plusieurs nouvelles variantes de TERT murine et, en parallèle, nous poursuivons la caractérisation de deux autres variantes. La première variante, Ins-i1[1-102], contient une insertion en cadre de lecture, dans le domaine N-terminal qui une région importante pour la l'attachement aux ARN de la télomérase et aux substrats d'ADN télomérique. La deuxième variante est une délétion localisée dans le domaine C-terminal. Celle-ci est plus spécifiquement située dans le domaine RT qui génère un codon stop prématuré et code pour une protéine manquant sa partie C-terminale, Del-e12 [1-40]. In-vitro, les activités télomériques des variantes mTERT sont diminuées, probablement dû à leur manque d'affinité pour l'ADN et l'ARN télomérique. Pour la variante Del-e12 [1-40], cette baisse d'activité a été confirmée dans des cellules télomérase-positives qui, après un certain nombre de passages, semblent développer des déficiences de croissance. La compréhension détaillée des mécanismes de l'épissage alternatif de la TERT murine pourrait contribuer à l'amélioration de nos connaissances sur les différentes méthodes de régulation de la télomérase. Ceci pourrait aussi aboutir à la découverte de nouveaux mécanismes d'inhibition de la télomérase dans les cellules tumorales.

Following the discovery that the anti-neoplastic agent, Rapamycin, exerts its biological activity by inhibiting mTORC1 signaling, significant scientific investments have been made in order to understand the biology of mTORC1, particularly its contributions to tumorigenesis. Herein, I use genetic approaches to address the role of mTORC1 in oncogenesis.The mTORC1 kinase is negatively regulated by the Tsc1/Tsc2 tumor suppressor protein complex. To better understand the consequence of activated mTORC1 signaling in cancer, we genetically inactivated a single Tsc2 allele in the context of a c-Myc driven mouse model of human burkitt's lymphomas. We demonstrated the resulting Tsc2+/-E-myc mice developed rapid and aggressive drug resistant lymphomas. We uncovered that mTORC1 activation blocks apoptosis through translational upregulation of Mcl-1, a pro-survival factor, which plays a critical role in B-cell survival and lymphomagenesis. Extending our initial observations, we characterized a proteasomal independent mode of Mcl-1 degradation that aids in elimination of Mcl-1 following DNA damage. We found that constitutive mTORC1 signalling interferes with this process. Lastly, Mcl-1 is a major resistance factor to a promising novel cancer therapeutic, ABT-737, a Bcl-2 antagonist currently in clinical trials. Inhibiting translation resensitizes cells to ABT-737 by inhibiting Mcl-1. We designed and implemented a protein synthesis focused shRNA-based screen to identify novel genes that may serve as potential drug targets capable of reversing ABT-737 resistance and inducing cancer cell apoptosis. Herein I described the identification and characterization of shRNAs targeting Dhx9 which potently re-activate the apoptotic program in the presence of ABT-737. / Suite à la découverte que l'agent antinéoplasique, Rapamycin, exerce son activité biologique en bloquant la voie de signalisation mTORC1, des investissements scientifiques majeurs ont été réalisés afin de comprendre la biologie de mTORC1, en particulier, ses contributions à la genèse des tumeurs. Mes recherches portent sur l'étude du rôle de mTORC1 dans l'oncogénèse par l'utilisation de manipulations génétiques.L'activité de la kinase mTORC1 est contrôlée dans la cellule par un complexe de protéines nommé Tsc1/Tsc2 qui inhibe la croissance de tumeurs . Pour mieux comprendre l'importance de la signalisation de la forme active de mTORC1 dans le cancer, nous avons modifié le code génétique de du modèle murin de la forme humaine du lymphome de Burkitt nommé Eu-myc en inactivant seulement une allèle du gène Tsc2. Nous avons ensuite démontré que les souris produites qui portent cette mutation identifiées comme Tsc2+/-E-myc ont développé des tumeurs très rapidement. De plus, les tumeurs qui en résultent sont résistantes aux traitements de chimiothérapie. Nous avons également découvert que l'activation de mTORC1 bloque la mort cellulaire programmé ou apoptose en activant la synthèse protéique ou traduction de Mcl-1, un facteur de survie, qui joue un rôle critique dans la survie des cellules B et la production de lymphomes.Pour approfondir nos connaissances, nous avons identifié un mécanisme de dégradation de Mcl-1 (autre que celui dépendant du protéasome) suite à un dommage causé à l'ADN. Nous savons désormais que ce mode de dégradation alternatif est inhibé par l'activité constante de mTORC1. Finalement, nous avons déterminé que Mcl-1 est impliqué directement dans la résistance des cellules tumorales au renommé médicament ABT-737 (un antagoniste a Bcl-2) qui est présentement en étude clinique. L'inhibition générale du phénomène de traduction empêche la production de Mcl-1 et par le fait même permet donc de régénérer la sensibilité des cellules au ABT-737. Nous avons conçu et mis en place un criblage de protéine basé sur la technique d'interférence à ARN exprimés à partir de constructions en tige-boucle (shRNA). Cette technologie nous a permis d'identifier de nouveaux gènes pouvant servir de cibles potentielles aux médicaments capables de renverser la résistance à ABT-737 et d'induire l'apoptose de cellules cancéreuses. Le document ci-joint décrit les méthodes utilisées pour identifier et caractériser des molécules shRNA qui ciblent le gène Dhx9, un gène qui pourrait être impliqué dans l'activation du processus d'apoptose en présence de ABT-737.

Prolactin (PRL) and its downstream pathway Jak2/Stat5a are required for mammary gland developement and as well as differentiation of mammary alveolar structures. However, its role in breast carcinoma is still not fully understood. Some recent data including the one generated from our laboratory indicates that PRL may have a suppressive effect on breast carcinogenesis. To further investigate this matter, we performed micro array analysis to examine the PRL target genes in the mouse mammary epithelial cell line (HC11). Based on microarray analysis, we identified the gene Anp32, a small nucleo/cytoplasmic acidic protein, as a downstream target gene involved in PRL signaling. We further confirmed these results using quantitative PCR and western blot analyses. In addition, I have examined the contribution of this protein in regulating PRL signaling leading to activation of the Jak2/Stat5a pathway. The results illustrated that upon PRL stimulation, Anp32a undergoes phosphorylation and translocates to the nucleus. Unexpectedly, I found that PRL stimulation led to Anp32/Stat5 complex formation in mammary epithelial cells. We further confirmed this interaction using co-localization immunofluorescence confocal microscopy studies. Furthermore, using GST fusion proteins of various domains of Anp32 in in vitro association studies we illustrated that Stat5a interaction with Anp32a requires domains which present within both the N and C terminus of Anp32a. In a parallel analysis, to begin to examine the role of Anp32a in breast cancer, we examined the level of Anp32a expression in breast cancer cell lines. Our preliminary results exhibit a reduced expression level of Anp32a in highly metastatic mouse breast cancer cell line 4T1compared to Hc11 mammary cells. / La prolactin(PRL) et sa voie de signalisation en aval Jak2/Stat5a sont requies à la croissance de la glande mammaire, ainsi qu'à la différentiation des épithéliales mammaires. Cependant, le rôle de la PRL dans le développement du cancer du sein n'est pas encore clair. Quelques preuves récentes, obtenues par notre laboratoire, montrent que la PRL pourrait supprimer certains aspects de la carcinogenèse du sein. Par consequent, nous avons effectué une analyse de puce à ADN pour examiner les genes cibles de la en utilisant les cellules épithéliales mammaires de souris HC11. Sur la base de l'analyse micro-array, nous avons identifié la protèin Anp32a, une petite nuclèo- protein cytoplasmique acid comme une gene cible impliqué en aval de la voie de signalization de la PRL. Nous avons davantage confirmé ces résultats en utilisant la Reaction de polymerization en chaine (PCR) et l'analyse d'immunobuvardage de type western. En plus, nous avons examiné la contribution de cette protéine dans la régulation de la voie de signalisation de la PRL conduisant à l'activation de la voie Jak2/Stat5a. Les résultats ont montré que Anp32a est transloquée au noyau et deviant phosphorylée par la stimulation de la PRL. En plus, la kinase JAK2 est nécessaire pour la phosphorylation sur les tyrosines de Anp32a.De façon inattendue, nous avons constaté que la stimulation de la PRL conduit à la formation d'un complexe entre les protéines Anp32a/Stat5 dans les cellules épithéliales mammaires. En plus, nous avons confirmé cette interaction en observant la co-localisation par des études d'immunofluorescence par microscopie confocale. En outre, à l'aide des protéines de fusion de GST représentant différentes domains de Anp32 en utilisant des études d'association in vitro, nous avons illustré le fait que Stat5a nécessite les domains qui sont pré sent en N et C terminal. En parallèle, nous avons examiné le niveau d'expression de Anp32a dans les plusieurs lignées cellulaire de cancer du sein. Nos resultats preliminaries, présente un niveau d'expression réduite de Anp32a en cellules cancéreuse mammaires 4T1(hautement métastatiques) par rapport à les cellules épithéliales mammaires HC11.