The polycomb group protein Bmi1 is an epigenetic regulator essential for the proliferation of many types of cancers. By impeding the expression of the tumor suppressor p53, Bmi1 is able to prevent apoptosis and senescence. c-Myc, a prominent oncogene, cooperates with Bmi1 to stimulate cellular transformation and tumorigenesis. Further investigation of the basic biological interplay between Bmi1 and c-Myc is crucial for our understanding of their tumorigenic ability. In my project I demonstrated that c-Myc and Bmi1 directly interact with each other and form nuclear foci. Overexpression of Max, a known partner of Myc, disrupts the Bmi1 and c-Myc interaction and prevents the formation of nuclear foci. Similar results were obtained with another member of the Myc family, L-Myc. Additionally, I found that HDAC3 interacts and co-localizes with Myc. HDAC3 also forms nuclear foci with Bmi1 and the addition of Max abrogates this interaction. In addition to the well-established role of Bmi1 as an epigenetic regulator, it has been recently shown that Bmi1 is part of an E3 ubiquitin-ligase complex, known as the Bmi1/RING1A or B complex. This complex controls the stability of many proteins. I showed that Bmi1 induces an L-Myc ubiquitination, which in turn causes the degradation of L-Myc. This data proposes a novel regulatory mechanism for the stability of the Myc oncogenes. The results of this thesis provide new insight into the basic biochemical interplay ofBmi1 with Myc and Max. / La protéine de groupe polycomb Bmi1 est essentielle pour la prolifération de nombreux types de cancers. En freinant l'expression du suppresseur de tumeur p53, Bmi1 est capable de prévenir l'apoptose et la sénescence. c-Myc, une autre oncogène, s'associe à Bmi1 pour stimuler la transformation et la tumorigenèse. Une enquête plus approfondie de l'interaction biologique fondamentale entre Bmi1 et c-Myc est crucial pour notre compréhension de leur capacité à promouvoir la tumorigène. Dans mon projet, j'ai démontré que c-Myc et Bmi1 interagissent directement et forment des foyers nucléaires. La surexpression de Max, un partenaire connu de Myc, perturbe l'interaction entre Bmi1 et c-Myc et empêche la formation de foyers nucléaires. Des résultats similaires ont été obtenus avec un autre membre de la famille Myc, L-Myc. En outre, j'ai constaté que HDAC3 interagi et se co-localise avec Myc. HDAC3 forme aussi des foyers nucléaires avec Bmi1 et l'ajout de Max abroge cette interaction. En plus du rôle bien établi de Bmi1 comme un régulateur épigénétique, il a été démontré récemment que Bmi1 fait partie d'une ubiquitine-ligase E3 complexe, connu sous le nom complexe Bmi1/RING1A ou B. Ce complexe contrôle la stabilité de nombreuses protéines. J'ai démontré que Bmi1 induit l'ubiquitination de L-Myc qui à son tour provoque la dégradation de celle-ci. Ces données proposent un nouveau mécanisme de règlementation pour la stabilité des oncogènes Myc. Les résultats de cette thèse fournissent un nouvel éclairage sur l'interaction biochimique de Bmi1 avec Myc et Max.

The Adenovirus type 5 E4orf4 protein (E4orf4) is a multifunctional protein that regulates viral transcription and splicing. Much of the activity of E4orf4 is thought to be mediated through binding of the Protein Phosphatase 2A (PP2A). E4orf4 recruits target phosphoproteins into complexes with PP2A resulting in dephosphorylation of host factors, such as SR splicing factors and the AP-1 transcription factor. However, the full complement of cellular factors that interact with E4orf4, and the molecular mechanisms that E4orf4 utilizes during replication to regulate gene expression remain poorly understood. In the following study, we utilized immunoprecipitation followed by mass spectrometry to identify novel interacting proteins with E4orf4. Interestingly, we identified a nucleoporin, Nup 205, a component of the nuclear pore complex as an interacting partner. We show that the Arginine Rich Motif (ARM) of E4orf4 is required for interaction with Nup 205 and for nuclear localization of E4orf4. ARMs are commonly found on many viral nuclear proteins. Interestingly, we observed that Nup 205 interacts with three different viral nuclear proteins containing ARMs. In each case, viral ARM proteins also bound to the same region on Nup 205. Point mutations of the ARM sequence on each of the three viral proteins resulted in loss of interaction with Nup 205 and loss of nuclear localization of the viral protein. Nup 205 may therefore represent a common cellular target for viruses encoding ARM containing proteins. We have further tested the role of E4orf4 and Nup 205 in adenovirus replication and gene expression. Previous studies have shown that compared to wild type adenovirus, E4orf4 deficient adenovirus (Orf4-) have elevated E1A and E4orf6 expressions and reduced late protein production. Such effects are phenotypically copied by the loss of Nup 205, where wild type adenovirus infecting H1299 cells with reduced level of Nup 205 also results in elevated E1A and E4orf6 and reduced late protein production. Furthermore, knockdown of Nup 205 resulted in reduced cytopathic effect and a more than four-fold reduction in the replication of wild type adenovirus. Taken together, these data suggest Nup 205 is required by adenovirus for proper regulation of gene expressions and viral replication, and that interaction with E4orf4 may mediate these effects. Since E4orf4 is known to deregulate phosphorylation of its target proteins, our future studies will focus on identifying phosphorylation sites on Nup 205 and determining the effect of E4orf4 on such sites and nucleopore structure and function. / La protéine multifonctionnelle E4orf4 de l'adénovirus de type 5 régule la transcription et l'épissage viral. L'activité de E4orf4 est assurée par son interaction avec la protéine phosphatase 2A (PP2A). Le complexe E4orf4/PP2A déphosphoryle certaines phosphoprotéines, comme le facteur d'épissage SR (riche en arginines et en sérines) et le facteur de transcription AP1. Cependant, les mécanismes de régulation d'expression génique pendant la réplication virale qui sont contrôlés par E4orf4 et ses partenaires restent inconnus. Au cours de cette étude, l'utilisation de la technique d'immunoprécipitation et de spectrométrie de masse nous a permis d'identifier des nouvelles protéines qui interagissent avec E4orf4, en particulier le composé du pore nucléaire Nup 205. Nous avons démontré que le motif riche en arginine (ARM – arginine rich motif), présent dans la protéine E4orf4 et autres protéines nucléaire virales, est nécessaire pour son interaction avec Nup 205 et la translocation nucléaire d' E4orf4. De plus, nous avons constaté qu'il y a trois autres protéines nucléaires virales qui interagissent avec la même région de Nup 205 via leur motif ARM. Des mutations ponctuelles du motif ARM sur ces trois protéines virales abolissent leur interaction avec Nup 205 et leur translocation nucléaire. Ceci suggère que Nup 205 est une cible commune pour les virus comportant des protéines ayant un motif ARM. Nous avons étudié ensuite le rôle de E4orf4 et Nup 205 dans l'expression génique et la réplication adénovirale. Précédemment, des travaux avaient démontré que, comparés aux adénovirus de type sauvage, les adénovirus privés de la protéine E4orf4 (Orf4-) expriment à des niveaux élevés les protéines virales E1A et E4orf6, mais présentent une faible production des protéines virales tardives. Nous avons observé que la suppression de Nup 205 donne le même effet que celui observé par la perte de E4orf4. Ainsi, l'infection des cellules H1299, présentant une faible expression de Nup 205, par des adénovirus de type sauvages, nous permet d'observer une augmentation du niveau d'expression de E1A et de E4orf6 et une diminution de la production des protéines virales tardives. De plus, la diminution de l'expression de Nup 205 réduit l'effet cytopathique et diminue de plus de quatre fois la réplication de l'adénovirus de type sauvage.En conclusion, nos résultats démontrent que l'interaction entre Nup 205 et E4orf4 favorise la réplication de l'adénovirus et l'expression des gènes viraux. Comme E4orf4 dérégule la phosphorylation de protéines cibles grâce à son interaction avec PP2A, nos prochaines études porteront sur l'identification des sites de phosphorylation potentiels sur Nup 205, ainsi que sur l'analyse de l'effet de E4orf4 sur chaque site. Nous sommes aussi intéressés par la fonction et la structure du pore nucléaire lorsqu'en complexe avec E4orf4.

Cancer cells have aberrant DNA methylation patterns which are characterized by hypomethylation of a large set of promoters and hypermethylation of tumor suppressor genes. The dynamic nature of the epigenome makes it a valuable target for therapeutic interventions. This thesis focuses on understanding the use of various inhibitors towards DNA methylation-related proteins and their respective anti-cancer activities at both global and gene-specific levels. The widely used demethylating agent 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine (5-azaCdR) are FDA-approved drugs for the treatment of myelodysplastic syndrome. However, these nucleoside analogs which trap the DNA methyltransferases (DNMTs) are non-specific. Studies have shown that 5-azaCdR induced pro-metastatic genes and caused long distance metastasis. This raises serious safety concerns for their clinical use. On the contrary, targeting the DNMTs individually or in combination did not result in dramatic induction of pro-metastatic genes as with 5-azaCdR treatment. In particular, single DNMT1-specific inhibition resulted in maximum growth suppression when compared to inhibition of all three major DNMTs, while not increasing cell invasiveness. DNMT1 has been shown to be important for cancer growth. Our study supports the idea that DNMT1 has a major role in cancer over the other DNMTs and that DNMT1 inhibitors could be effective anti-cancer drugs. 5-azaCdR has nevertheless been proven to be a potent suppressor of cancer growth. We tested the idea of a combinatorial treatment that may minimize its side-effects on cell invasion while maintaining its growth suppressor effects. The methyl-CpG binding protein 2 (MBD2) protein has been shown to demethylate pro-metastatic genes. Its inhibition in concurrent with 5-azaCdR treatment synergistically suppressed cancer growth, while reversed the 5-azaCdR-induced invasion. In order to have a deeper understanding of the impact of the treatments, microarrays studies on the methylome and transcriptome of the treated cells were carried out. Bioinformatics analysis indicated that the combined treatment suppressed gene networks that were involved in cell mobility, while synergistically enhanced gene networks that were involved in cell death. This data indicate that combining 5-azaCdR treatment with MBD2 inhibition results in more potent anti-cancer effects than either treatment alone. In order to explore the currently available drugs that inhibit MBD2, we tested the combination of S-adenosylmethionine (SAM) with 5-azaCdR on the same cancer cell lines. SAM remethylated gene promoters of pro-metastatic genes and repressed 5-azaCdR-induced invasion similarly to MBD2 inhibition. We then investigated the relationship between SAM and MBD2 downregulation and observed hypermethylation on both CpG and non-CpG sites in the MBD2 promoter upon SAM treatment. Interestingly, inhibition of MBD2 using short interference RNA also resulted in hypermethylation of its own promoter. This observation suggested that SAM treatment could directly downregulate MBD2 expression, which is further downregulated through a feedback loop. These results also suggested that SAM treatment could have a direct effect on MBD2 promoter, which in turn affects multiple MBD2 targets that are involved in invasion. Together, the data from this thesis support the idea that targeting the epigenome could be a highly efficacious anti-cancer therapy and that combining drugs that target DNA methylation could increase the potency over individual treatments. / Les cellules cancéreuses présentent un profil de méthylation caractérisé par l'hypométhylation d'un grand nombre de promoteurs et l'hyperméthylation de gènes suppresseurs de tumeur. La nature dynamique de l'épigénome en fait une cible de choix pour les interventions thérapeutiques. Cette thèse vise à comprendre l'utilisation de divers inhibiteurs visant des protéines liées à la méthylation de l'ADN et leurs activités anticancéreuses à une échelle génomique globale et au niveau de gènes particuliers. Les agents déméthylants 5-azacytidine et 5-aza-2'-deoxycytidine (5-azaCdR) sont des médicaments pour le traitement du syndrome myélodysplasiqueapprouvés par la FDA. Cependant, ces analogues de nucléosides qui piègent les DNA méthyltransférases (DNMTs) ne sont pas spécifiques. Des études ont montrées que la 5-azaCdR induisait l'expression de gènes pro-métastatiques et l'apparition de métastases. Ceci soulève de sérieuses interrogations quant à leur utilisation en clinique. À l'inverse, le ciblage spécifique des DNMTs ne conduit pas à une induction dramatique des gènes pro-métastatiques. Plus particulièrement, l'inhibition spécifique de DNMT1 résulte en une suppression de la croissance maximale des tumeurs, sans effet sur l'invasion cellulaire, lorsque l'on compare à l'inhibition des trois principales DNMTs. Notre étude supporte l'idée que DNMT1 à un rôle majeur dans le cancer et que le développement d'inhibiteurs de DNMT1 pourraient conduire à des médicaments anti-cancéreux efficaces.Il a néanmoins été montré que la 5-azaCdR était un suppresseur potentiel de la croissance cancéreuse. Nous avons testé l'hypothèse qu'un traitement combiné permettrait de minimiser ses effets secondaires sur l'invasion cellulaire tout en maintenant ses effets suppresseurs de croissance. Il a été montré que la protéine methyl-CpG binding protein 2 (MBD2) participait à la déméthylationde gènes pro-métastatiques. Son inhibition simultanée à un traitement 5-azaCdR abolit de façon synergétique la croissance cancéreuse, tout en inhibant l'invasion induite par la 5-azaCdR. Des analyses du méthylome et du transcriptome ont été réalisées par micropuces à partir de cellules traitées avec un siRNA dirigé contre l'ARNm de MBD2 et la 5-azaCdR afin d'avoir une meilleure compréhension de l'impact de la combinaison des traitements. Les analyses bioinformatiques ont indiqué que le traitement combiné réprimait des réseaux de gènes impliqués dans la mobilité cellulaire tandis que les réseaux de gènes activés étaient impliqués dans la mort cellulaire. Ces données indiquent que le traitement à la 5-azaCdR combiné avec l'inhibition de MBD2 résulte en de plus puissants effets anti-cancéreux que l'un ou l'autre des traitements individuels.Nous avons également testé la combinaison de la S-adenosylmethionine (SAM), un médicament actuellement disponible sur le marché et inhibant l'activité de MBD2, avec la 5-azaCdR sur les lignées cellulaires utilisées précédemment. La SAM, de façon similaire à l'inhibition de MBD2 par un siRNA, permet la méthylation des promoteurs de gènes pro-métastatiques et réprime l'invasion induite par la 5-azaCdR. Nous avons ensuite examiné la relation entre la SAM, la diminution de l'expression de MBD2 et l'hyperméthylation observée à la fois aux sites CpG et non-CpG au niveau du promoteur de MBD2 après traitement avec la SAM. De façon intéressante, l'inhibition de MBD2 par des petits ARN interférant résulte également en une hyperméthylation de son propre promoteur. Cette observation suggère que le traitement avec SAM pourrait directement réduire l'expression de MBD2, qui serait réduite encore plus via une boucle de rétrocontrôle. L'ensemble des données de cette thèse supporte l'idée que le ciblage de l'épigénome pourrait être une thérapie anti-cancéreuse hautement efficace et que la combinaison de médicaments qui ciblent la méthylation de l'ADN pourrait augmenter l'efficacité des traitements individuels.

The Rab5 and Rab7 GTPases are key regulators of endosome to lysosome trafficking, whose activities are positively regulated by Rab Guanine nucleotide Exchange Factors and negatively regulated by GTPase Activating Proteins (GAP). In this thesis, the nematode Caenorhabditis elegans was used as a model system to study regulation of Rab GTPase-mediated endosomal trafficking, for simple genetics and easy visualization of organelles under Differential Interference Contrast (DIC) and confocal optics. It was previously demonstrated that TBC-2 functions as a RAB-5 GAP. Loss of tbc-2 activity results in the formation of enlarged late endosomes in the intestine that require the activities of RAB-5, RAB-7 and components of the homotypic fusion and vacuole protein sorting (HOPS) complex. TBC-2 colocalizes with RAB-7 on late endosomes, and requires RAB-7 for membrane localization. My hypothesis is that RAB-7 recruits TBC-2 to late endosomes to inactivate RAB-5 and possibly RAB-7 itself, to facilitate early to late endosome maturation. The vh8 mutant was previously identified in the lab as a suppressor of the tbc-2(-) phenotype and displaces GFP::RAB-7 from vesicular membranes. It is possible that vh8 encodes for a potential RAB-7 GEF. To investigate the molecular identity of vh8, I tested candidate genes by RNAi. While none of the candidates appear to be vh8, I did find that the HOPS core complex is required for the tbc-2(-) phenotype. ARL-8, and its human homolog arl8b, have recently been shown to be important for late endosome to lysosome trafficking. To investigate whether ARL-8 is required for TBC-2 mediated early to late endosome trafficking, I performed RNAi experiments. The results of which suggest that ARL-8 functions downstream of TBC-2. ARL-8 is required for the tbc-2(-) large late endosome phenotype, but is not required for membrane localization of either TBC-2 or RAB-7.In mammalian cells, the Rac1 GTPase is able to bind Armus, a human homolog of TBC-2. That raises the possibility that RAB-7 recruits CED-10/Rac1 via TBC-2. However, I observe that in tbc-2(tm2241) mutant animals, CED-10 is still localized to vesicles. It suggests that CED-10 might be recruited to membrane via other mechanism. Active CED-10 is also crucial for phagocytosis and clearance of apoptotic cell corpses. CED-10 can be activated by the CED-5/CED-12 complex, which is proposed to be recruited and activated by PI(3,5)P2. Work from this thesis suggests that the active state might not be a requirement for CED-10 localization, as ced-5 RNAi does not change the localization of CED-10. / Les GTPases Rab5 et Rab7 participent à la régulation du traffic des endosomes. L'activité de ces protéines est régulée positivement par les "Rab Guanine nucleotide Exchange Factors" (GEF) et régulée négativement par les "GTPase Activating Proteins" (GAP). Dans ce projet, le nematode Caenorhabditis elegans a été utilisé comme modèle pour étudier la régulation du traffic endosomal médié par les Rab GTPase car celui-ci est un bon modèle génétique et permet une visualisation des organites à l'aide de microscopie à constraste d'interférence différentielle et de microscopie confocale. Il a été démontré dans la passé que TBC-2 fonctionne en tant que GAP pour RAB-5. La perte de l'activité de tbc-2 résulte en la formation d'endosomes tardifs élargis dans les intestins des nématodes, qui requièrent normalement l'activité de RAB-5, RAB-7 et des constituants du complexe "homotypic fusion and vacuole protein sorting" (HOPS). TBC-2 se retrouve avec RAB-7 sur les endosomes tardifs et nécessite RAB-7 pour sa localisation sur la membrane. Notre hypothèse était que RAB-7 recrute TBC-2 aux endosomes tardifs pour inactiver RAB-5 et possiblement RAB-7, ce qui facilite la maturation des endosomes en endosomes tardifs. 


Le mutant vh8 a préalablement été identifié dans le laboratoire en tant que suppresseur du phénotype tbc2(-) et cause le déplacement de GFP::RAB-7 des membranes vésiculaires. Il est possible que vh8 exprime un potentiel GEF de RAB-7. Pour trouver l'identité moléculaire de vh8, nous avons testé les gènes candidats à l'aide d'ARN d'interférence (ARNi). Malgré qu'aucun des candidats ne semblaient être vh8, nous avons découvert que le complexe central de HOPS est nécessaire au phénotype tbc-2(-). ARL-8 et son homolog humain arl8b ont récessement été démontrés comme étant importants dans le traffic des endosomess tardifis aux lysosomes. Pour vérifier si ARL-8 est requis dans le traffic des endosomes médiés par TBC-2. Nos travaux à l'aide d'ARNi suggèrent qu'ARL-8 fonctionne en aval de TBC-2. ARL-8 est nécessaire à l'apparition du phénotype tbc-2(-), mais n'est pas requis pour la localisation de TBC-2 et RAB-7 à la membrane. 


Dans les cellules de mammifères, la GTPase Rac1 peut se lier à Armus, un homologue humain de TBC-2. Ceci suggère que RAB-7 pourrait recruter CED-10/RAC1 par l'entremise de TBC-2. Par contre, nous observons que chez les nématodes tbc-2(tm2241), CED-10 est toujours localisé sur les vésicules. Ceci suggère que CED-10 pourrait être recruté à la membrane par d'autres mécanismes. Un CED-10 activé est aussi nécessaire à la phagocytose et à la dégradation des corps cellulaires apoptotiques. CED-10 peut être activé par le complexe CED-5/CED-12, qui est possiblement recruté et activé par PI(3,5)P2. Nos travaux suggèrent par contre que l'activation de CED-10 n'est pas obligatoire à sa localisation, car l'ARNi de ced-5 ne change pas la localisation de CED-10.

The packaging of eukaryotic genomes into chromatin poses a barrier to mRNA transcription by RNA polymerase II (RNAPII). Covalent modifications of histones, the major protein components of chromatin, are key mechanisms by which all eukaryotic organisms modulate chromatin structure to allow gene expression to occur. Enzymes which catalyze some of these modifications are currently under investigation as drug targets in a variety of human cancers. Thus, a fundamental understanding of how histone modifications are targeted to chromatin and how they impact transcription is of significant importance to the treatment of cancer. Mono-ubiquitination of histone H2B (H2Bub1) is universally associated with the elongation phase of RNAPII. Elongation control is critical for the proper regulation of mammalian genes. Accordingly, depletion of the H2B ubiquitination enzyme RNF20 in cell lines causes aberrant cell migration and a defective apoptotic response to DNA damage. Establishment of H2Bub1 on chromatin requires two highly conserved transcription elongation factors: the Polymerase Associated Factor (PAF) complex and Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb). PAF is a five-subunit complex that interacts directly with RNAPII, and P-TEFb consists of the kinase Cdk9 in complex with cyclin T. While it is currently known that both P-TEFb activity and the PAF complex are needed to form H2Bub1 on chromatin, the precise mechanisms through which these factors regulate H2Bub1 and RNAPII elongation are not understood.Here I have characterized the P-TEFb-PAF-H2Bub1 regulatory axis in the model eukaryote Schizosaccharomyces pombe. Analyses of PAF mutant strains suggested multiple functional modules within the PAF complex, consisting of the Paf1 and Leo1 subunits, the Tpr1 (Ctr9 in humans) and Cdc73 subunits, and the Rtf1 subunit. Tandem affinity purification of PAF revealed that Rtf1 does not stably associate with the rest of the complex, confirming its functional independence. Although they are recruited as separate units, ChIP indicated that both Rtf1 and the remaining PAF subunits require Cdk9 activity for their association with chromatin. We further examined the role of Cdk9 activity in recruitment of Rtf1, a key regulator of transcription-associated histone modifications. Importantly, a phosphomimetic substitution to the Cdk9 phosphorylation site within the Spt5 CTD resulted in Cdk9-independent Rtf1 association, arguing that Spt5 phosphorylation may be sufficient for Rtf1 recruitment.In conclusion, my analyses uncovered a complex regulatory divide in both the function and recruitment of the PAF proteins, and suggest that P-TEFb-directed activity of PAF involves multiple P-TEFb targets dedicated to different aspects of PAF complex function in S. pombe. / Chez les eucaryotes, l'assemblage du génome en chromatine influence la transcription de l'ARN messager effectuée par l'ARN polymerase II (ARNpolII). Les modifications covalentes des histones, composantes protéiques principales de la chromatine, sont des mécanismes clés qui permettent à chaque organisme eucaryote de modifier la structure de la chromatine afin de permettre l'expression génétique. Les enzymes qui permettent certaines de ces modifications sont présentement évaluées pour être utilisées comme cibles dans une grande variété de cancers humains. Il est donc très important de comprendre ces modifications de la chromatine et leurs impacts sur la transcription pour ainsi traiter les cancers efficacement. L'ubiquitination de l'histone H2B (H2Bub1) est connue pour être associée à la phase d'élongation de l'ARNpolII dont le contrôle est critique pour la régulation génétique chez les mammifères. L'absence de l'enzyme RNF20 responsable de l'ubiquitination de H2B dans les cellules entraîne une migration cellulaire aberrante et une réponse apoptotique déficiente suite à un bris dans la structure de l'ADN. Deux facteurs de transcription hautement conservés sont requis lors de l'ubiquitination de H2B sur la chromatine soit le complexe du facteur associé à la polymérase (PAF) et le facteur d'élongation transcriptionnel positif b (P-TEFb). PAF est un complexe de cinq sous-unités qui interagit directement avec ARNpolII et P-TEFb est la kinase Cdk9 qui est liée à la cycline T. Actuellement, il est connu que le complexe PAF et l'activité de P-TEFb sont requis pour permettre la formation de H2Bub1 sur la chromatine par contre les mécanismes précis par lequels ces facteurs affectent la régulation H2Bub1 et l'élongation de l'ARNpolII demeurent méconnus.La présente étude a permis de caractériser la régulation P-TEFb-PAF-H2Bub1 dans le modèle eucaryotique Schizosaccharomyces pombe. L'analyse de différentes souches possédant des mutations du complexe PAF suggèrent la présence de fonctions spécifiques reliées aux différentes sous-unités soit Paf1 et Leo1, Tpr1 (Ctr9 chez l'être humain) et Cdc73, et finalement Rtf1. Nous avons démontré par la méthode de purification d'affinité en tandem (TAP) de PAF que Rtf1 ne s'associe pas de manière stable avec les autres sous-unités du complexe supportant ainsi l'idée de son indépendance fonctionnelle. Malgré le fait que les sous-unités sont recrutées de manière indépendante, l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) démontre que Rtf1 et les autres sous-unités nécessitent l'activité de Cdk9 pour permettre leur association à la chromatine. Nos recherches nous ont menées à étudier le rôle de l'activité de Cdk9 lié au recrutement de Rtf1 qui est un régulateur clé dans les modifications d'histones associées à la transcription. Une mutation phosphomimétique du site de phosphorylation de Cdk9 dans le domaine C-terminal (CTD) de Spt5 démontre que l'association de Rtf1 est indépendante de Cdk9, ce qui supporte l'hypothèse que la phosphorylation de Spt5 est suffisante pour recruter Rtf1.En conclusion, mes analyses ont permis de découvrir que la régulation du complexe est divisée selon la fonction et le recrutement des protéines PAF, et suggèrent que l'activité de P-TEFb implique diverses cibles qui affectent différents aspects de la fonction du complexe PAF chez S. pombe.

Extreme deviations from what is considered normal body weight, from anorexia to obesity, have been linked to reduced reproductive function in females. Discovered in 1994, leptin is a signaling hormone released from adipose tissue to mediate satiety effects in the hypothalamus. Leptin secretion is directly proportional to amount of body fat and evidence has accumulated that leptin and its receptor (Lepr) are found in a variety of tissues including granulosa cells (GCs) of the ovary. Thus, leptin through its receptor may play a role in reproductive function in females. Many studies have examined the effects of Lepr in GCs and the ovary, however the results are contradictory and all have been in vitro. Here we present the first in vivo study to examine the role of Lepr in GCs during follicular development and ovulation. Immature superovulated mice were used in all studies and GCs collected by follicle puncture. We first determined the expression profiles of Lepr isoforms (LeprA, LeprB) during follicular and luteal development along with leptin-related signaling molecules and targets. We also analyzed transcription factors potentially regulating Lepr expression in GCs. To examine the response of GCs to leptin in vivo, leptin hormone was administered at various times of follicular and luteal development. Lastly, we blocked Lepr action using a Lepr antagonist (SMLA) and determined its effects on ovulation. LeprA and LeprB were upregulated at 4h post- human chorionic gonadotropin (hCG) with LeprA being the most abundant isoform showing a 23-fold increase from 0 to 4h post-hCG. Leptin was upregulated at the same time and Lepr signaling molecules: signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3), and suppressor of cytokine signaling 3 (Socs3), were upregulated just after Lepr induction at 7 and 12h post-hCG, respectively. CCAAT/enhancer-binding protein beta (Cebpb), which was induced at 1h post-hCG, was shown to associate with the Lepr promoter and thus regulate Lepr expression. Early growth response protein 1 (Egr1) protein and mRNA data revealed it to be another potential regulatory transcription factor with upregulation at 1h post-hCG, just prior to Lepr upregulation. Thus, the mRNA profiles of genes examined provide evidence of a role for Lepr during the periovulatory period. This was further confirmed as the in vivo response of GCs to a physiological dose of leptin was enhanced at 6h post-hCG evidenced by phosphorylation of mitogen-activated protein kinase (Mapk) and Stat3 proteins; however showed no change during the early follicular or luteal periods. Leptin treatment also increased expression of ovulation genes: a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 (Adamts1), programmed cell death 1 (Pdcd1), and Egr1. Antagonizing Lepr action reduced ovulation rate by 60% in SMLA-treated animals. This reduction appeared, at least in part, to be due to deregulated gene expression of Adamts10, Adamts19, Hyaluronan synthase 2 (Has2), amphiregulin (Areg), Pentraxin-related protein (Ptx3), and Forkhead box protein O1 (Foxo1). Overall, the results of this study provide molecular mechanisms for Lepr induction and signaling in GCs. In addition, it provides evidence that leptin and Lepr play a positive role during ovulation and are thus essential for optimal female fertility. / Les écarts extrêmes de poids par rapport à ce qui est considéré comme un poids normal, telles que l'anorexie et l'obésité, sont liées à des problèmes de la fonction reproductrice chez la femme. Découverte en 1994, la leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux dans le but d'informer l'hypothalamus sur l'état de satiété de l'organisme. La libération de leptine est directement proportionnelle à la quantité de tissu adipeux et la présence de l'hormone et de son récepteur (Lepr) a été montrée dans différents tissus incluant les cellules de la granulosa des ovaires. Par conséquent, la leptine, via son récepteur, joue un rôle dans la fonction reproductrice de la femme. De nombreuses études ont étudié les effets de Lepr dans les cellules de la granulosa et dans l'ovaire, mais elles ont toutes été réalisées in vitro et les résultats sont contradictoires. Nous présentons ici la première étude in vivo dans le but d'examiner le rôle de Lepr dans les cellules de la granulosa pendant le développement folliculaire et l'ovulation. Des souris immature produisant un grand nombre d'ovocytes ont été utilisées dans toutes nos expériences et les cellules de la granulosa ont été collectées par ponction folliculaire. Les profils d'expression des isoformes de Lepr (LeprA et LeprB) durant les développements folliculaire et lutéal ont été d'abord déterminés, ainsi que ceux des molécules de la voie de signalisation de la leptine et leurs cibles. Les facteurs de transcription régulant potentiellement l'expression de Lepr dans les cellules de la granulosa ont aussi été analysés. Pour évaluer la réponse des cellules de la granulosa à la leptine in vivo, l'hormone leptine a été administrée à différents moments des développements folliculaire et lutéal. Enfin, le récepteur Lepr a été bloqué grâce à l'utilisation d'un antagoniste de Lepr (SMLA) et les effets de ce blocage sur l'ovulation ont été analysés. L'expression de LeprA et LeprB ont augmenté 4h après administration d'hCG, LeprA étant l'isoforme la plus abondante et présentant une expression 23 fois plus importante de 0 à 4h post-hCG. L'expression de la leptine a augmenté durant le même temps ainsi que celle des molécules de la voie de signalisation de Lepr, Stat3 et Socs3, juste après l'induction de Lepr, respectivement 7h et 12h post-hCG. Cebpb, qui a été induit 1h post-hCG, a été identifié comme étant associé au promoteur de Lepr et donc comme étant un régulateur de l'expression de Lepr. Les données concernant la protéine Egr1 et ses ARNm suggèrent qu'il peut s'agir d'un autre potentiel facteur de transcription régulant l'expression de Lepr, notamment en raison d'une augmentation de son expression 1h post-hCG, juste avant l'augmentation de l'expression de Lepr. Les profils d'ARNm des gènes examinés ont donc fourni la preuve du rôle de Lepr durant la période périovulatoire. Ceci a été ensuite confirmé par l'augmentation de la réponse des cellules de la granulosa in vivo suite à une dose physiologique de leptine 6h post-hCG , mise en évidence par la phosphorylation des protéines Mapk et Stat3. Le traitement avec la leptine a aussi accru l'expression des gènes impliqués dans l'ovulation Adamts1, Pdcd1 et Egr1. Le blocage de l'action de Lepr a réduit le taux d'ovulation de 60% chez les animaux traités avec SMLA. Cette réduction apparaît être due, au moins en partie, à la dérégulation de l'expression des gènes de Adamts10, Adamts19, Has2, Areg, Ptx3, et Foxo1. En conclusion, les résultats de cette étude éclairent les mécanismes moléculaires de l'induction du récepteur Lepr ainsi que de la voie de signalisation qui lui est associée dans les cellules de la granulosa. Pour finir, cette étude fournit des preuves concernant le rôle positif joué par la leptine et Lepr durant l'ovulation, ce qui est essentiel pour optimiser la fertilité de la femme.

Heat shock cognate 70 kDa protein (hsc70) is a well conserved molecular chaperone involved in many physiological functions such as the stress response, protein folding, and protein transport. Moreover, hsc70 plays roles in human disease, such as cancer, neurodegenerative disease, heart and brain ischemia, and it also takes part in the aging process. With the help of co-chaperones and ATP hydrolysis, hsc70 can restore proper protein folding by binding to normally inaccessible hydrophobic residues on its target. Following heat shock, hsc70 traffics from the cytoplasm to the nucleoplasm. Hsc70 further accumulates in nucleoli during heat stress recovery. Using GFP-tagged portions of hsc70, I identified the nucleolar localization sequence (NoLS) of hsc70. Following quantification of the fluorescence signal, I showed that the nucleolar accumulation of different constructs varied. This allowed me to identify a heat inducible segment on hsc70, residues 225 to 297, which is sufficient for nucleolar accumulation during recovery from stress. The analysis of deletion mutants generated for segment 225-297 revealed that some constructs accumulated in the nucleolus constitutively, while others did not target GFP to nucleoli. Using pharmacological inhibitors, I also showed that PI3-kinase, MEK (MAP kinase kinase) and tyrosine dephosphorylation are involved in the hsc70 nucleolar accumulation process. The nucleolus is a well defined compartment in the nucleus that is dynamic and characterized by multiple functions. Nucleoli are currently at the center of important discoveries as they play a role in diseases such as cancer. The nucleolus participates in the control of cell cycle progression and viral infections, but its fundamental function is the assembly of ribosomes. Several thousand proteins have been identified in the nucleolus; however, as the nucleolus is dynamic, this composition depends on physiological and environmental conditions. My work focused on reviewing our knowledge of the possible chaperone networks present in the nucleolus. A new set of proteins, the nucleolar multitasking proteins (NoMPs), has been identified as chaperones that are necessary for the specific function of the nucleolus. These multitasking proteins include B23 and nucleolin. This work provided the basis for us to predict interactions between chaperones in the nucleolus.Many proteins of the nucleolus are dynamic: they can traffic to other cellular compartments when environmental conditions change. To define the mechanisms of hsc70 nucleolar accumulation during stress recovery, my work aimed at identifying the nucleolar binding partners of hsc70. I provided evidence that RNA plays a role for hsc70 nucleolar accumulation by treating heat shocked cells with detergent and RNase. Furthermore, inhibition of RNA polymerase I increased the retention time of endogenous hsc70 in the nucleolus. In further studies I examined the GFP-tagged hsc70 NoLS in transfected cells. This reporter displayed increased nucleolar accumulation and delayed release from the nucleolus during the recovery from heat shock when cells were treated with actinomycin D. On the other hand, RNA polymerase I inhibition was not sufficient to accumulate hsc70 or the GFP-tagged NoLS in nucleoli under normal growth conditions. In addition to the links between nucleolar RNA and hsc70, my research demonstrated that hsc70 and its NoLS bind to polyA+ RNA under normal growth conditions.Taken together, my studies advance our current understanding of the nucleolar accumulation of hsc70 during heat stress recovery. I identified important sequence elements, pathways and possible nucleolar anchors that contribute to hsc70 nucleolar accumulation. My work congregates important concepts that will likely be beneficial to human health. / La protéine apparentée à la protéine de choc thermique 70 kDa (hsc70: heat shock cognate 70 kDa protein) est une chaperonne moléculaire impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques telles que la réponse au stress, le repliement des protéines, ainsi que dans le transport de celles-ci. Hsc70 joue des rôles dans les maladies humaines, comme le cancer, les maladies neurodégénératives, l'ischémie du cerveau et du cœur, et elle prend part au processus de vieillissement. Avec l'aide des co-chaperonnes et de l'hydrolyse de l'ATP, hsc70 peut replier correctement les protéines en se liant aux résidus hydrophobes normalement inaccessibles.Suivant un choc thermique, hsc70 se déplace du cytoplasme vers le nucléoplasme. Hsc70 s'accumule subséquemment dans les nucléoles, pendant la récupération du stress thermique. Utilisant des portions de hsc70 liées à GFP, j'ai identifié la séquence de ciblage au nucléole (NoLS: nucleolar localization sequence) de hsc70. En quantifiant le signal fluorescent, j'ai démontré que l'accumulation nucléolaire des constructions variait. J'ai ainsi identifié un fragment inductible par la chaleur sur hsc70, aux résidus 225 à 297, qui est suffisant pour l'accumulation au nucléole pendant la récupération du stress. Des délétions générées dans le segment 225-297 ont révélé que certaines constructions s'accumulaient constitutivement au nucléole, alors que d'autres ne ciblaient jamais GFP au nucléole. Utilisant des inhibiteurs pharmacologiques, j'ai également démontré que PI3-kinase, MEK (MAP kinase kinase) et la déphosphorylation des tyrosines, sont impliqués dans le processus de l'accumulation nucléolaire de hsc70.Le nucléole, compartiment bien défini du noyau, est dynamique et a de multiples fonctions. Les nucléoles sont importants car ils jouent un rôle dans les maladies telles les cancers, participent au contrôle de la progression du cycle cellulaire, et aux infections virales, mais leurs fonction fondamentale est l'assemblage des ribosomes. Plusieurs milliers de protéines ont été identifiées dans le nucléole, cependant, comme le nucléole est dynamique, cette composition dépend des conditions physiologiques et environnementales. Mon projet focalise aussi sur la revue des connaissances portant sur les possibles réseaux de chaperonnes présents dans le nucléole. Une nouvelle catégorie de protéines, les protéines multitâches (NoMP: nucleolar multitasking protein), a été identifiée comme étant des chaperonnes nécessaires pour la fonction spécifique du nucléole. Celles-ci sont B23 et la nucléoline. Ce travail nous a procuré les bases permettant de prédire les interactions entre les chaperonnes dans le nucléole.Plusieurs protéines du nucléole sont dynamiques: elles peuvent se déplacer vers d'autres compartiments cellulaires selon les conditions. Mon projet visait à identifier les partenaires qui se lient à hsc70. J'ai démontré que l'ARN joue un rôle dans l'accumulation nucléolaire de hsc70. De plus, l'inhibition de l'ARN polymérase I augmente la duré de rétention nucléolaire de la hsc70 endogène. Avec des cellules transfectées et l'actinomycine D, j'ai examiné le NoLS lié à GFP qui démontre une accumulation nucléolaire plus élevée, ainsi qu'un délai dans le relâchement du nucléole pendant la récupération du stress à la chaleur. D'autre part, l'inhibition de l'ARN polymérase I n'était pas suffisante pour accumuler hsc70, ou le NoLS liée à GFP, dans le nucléole lors de conditions normales. En plus des liens entre l'ARN nucléolaire et hsc70, ma recherche a démontré que hsc70 et son NoLS se lient à l'ARN polyA+.Mes travaux contribuent à notre compréhension de l'accumulation de hsc70 dans le nucléole lors de la récupération du stress à la chaleur. J'ai identifié d'importants éléments de séquence, des voies et des ancres nucléolaires possibles qui contribuent à l'accumulation de hsc70 au nucléole. Mes travaux regroupent d'importants concepts qui vont possiblement être bénéfiques à la santé humaine.

Freezing stress limits crop productivity and generates substantial economic losses every year. While most temperate cereal crops exhibit some degree of cold tolerance, they require exposure to low, non-freezing temperatures in order to acclimate. This involves the induced expression of cold-regulated (COR) genes. COR gene promoters contain sequences that are recognized by C-repeat Binding Factor 1 (CBF1), a transcription factor that may mediate gene expression via the SAGA (SPT-ADA2-GCN5-acetyltransferase) complex in response to cold stress. The goal of this study was to characterize the function of the adaptor protein ADA2, a member of the SAGA complex that may link CBF1 to chromatin remodeling proteins. Expression analysis confirmed that Brachypodium CBF1 and ADA2 were expressed synchronously in response to cold treatment. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis demonstrated that ADA2 and CBF1 interact directly in planta. These results further support the hypothesis that the SAGA complex exists in Brachypodium and that it may play an important role in mediating the cold response mechanism. / Pour les pays nordiques, les épisodes de gel précoces et tardifs limitent considérablement le rendement des cultures et génèrent de lourdes pertes économiques. Bien que la plupart des plantes céréalières cultivées au Canada possèdent d'emblée un certain niveau de tolérance au gel, elles nécessitent toutes une période d'exposition à de basses températures (de 2 à 10°C) afin de maximiser leurs niveaux de tolérance. Ce processus d'acclimatation repose sur l'expression induite des gènes COR (Cold-Regulated Genes) contrôlés en grande partie par le régulateur CBF1 (C-repeat Binding Factor 1). Récemment, il a été proposé que CBF1 pourrait interagir avec le complexe chromatinien SAGA dans le but d'accomplir sa fonction. Cette interaction serait médiée par une sous-unité du complexe SAGA, la protéine adaptatrice ADA2. Cette dernière représenterait donc le lien moléculaire unissant les mécanismes de régulation génique traditionnels et chromatiniens impliqués dans le développement de la tolérance au gel des plantes. Le but de cette étude était de caractériser l'interaction physique entre CBF1 et ADA2 dans un contexte in planta. Des analyses d'expression en temps réel ont démontré que BradiCBF1 et BradiADA2 sont exprimés de façon similaire en réponse aux basses températures. De plus, des analyses d'interactions utilisant la technique de complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC) ont démontré pour la première fois une interaction in planta entre les protéines BradiCBF1 and BradiADA2. Les résultats présentés ici suggèrent fortement qu'un complexe apparenté au complexe SAGA existe chez Brachypodium distachyon et que ce dernier pourrait jouer un rôle important lors du développement de la tolérance au gel chez les plantes céréalières.

Nephrin, a key component of the filtration slit diaphragm, undergoes post-translational modifications in the endoplasmic reticulum (ER). Mutations in nephrin lead to proteinuria. We examined the effects of missense mutations in nephrin on protein folding in the ER, cellular trafficking, and induction of the unfolded protein response (UPR). Wild type (WT) nephrin and the I171N, G270C, S366R, S724C and R743C mutant cDNAs were expressed in 293T cells or glomerular epithelial cells (GECs) by transient transfection. Association of nephrin with the ER chaperone, calnexin, was studied by co-immunoprecipitation. Activation of the UPR was assessed by monitoring expression of the ER chaperone, Grp94, phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor-2α subunit (eIF2α), and induction of C/EBP homologous protein-10 (CHOP), as well as activating transcription factor-6 (ATF6)-luciferase reporter activity. All nephrin mutants showed increased association with calnexin, compared with WT nephrin. The I171N and G270C mutants increased expression of Grp94 in 293T cells, and stimulated ATF6-luciferase activity in both 293T cells and GECs. Nephrin S366R and S724C tended to induce the UPR, but changes in Grp94 and ATF6-luciferase activity were less consistent. The R743C mutant did not enhance Grp94 expression, nor ATF6-luciferase activity. All nephrin mutants did not increase eIF2α phosphorylation, nor CHOP expression. Immunofluorescence microscopy showed WT nephrin at the plasma membrane, while the I171N and S366R mutants were perinuclear, colocalized with calnexin. Moreover, the two nephrin mutants induced aggregation of the ER chaperone, calreticulin, compared with WT. Treatment of cells with castanospermine (which reduces the interaction of nephrin with calnexin) resulted in a portion of nephrin I171N and S366R appearing at the plasma membrane. Thus, certain nephrin mutants show impaired folding in the ER, and activate the ATF6 branch of the UPR. Induction of ER chaperones may represent a cytoprotective response, allowing cells to withstand proteotoxic injury. Blocking the interaction of nephrin with calnexin results in a partial rescue of certain nephrin mutants to the plasma membrane. / La néphrine, un composant clé du diaphragme de fente, subit des modifications post-traductionnelles dans le réticulum endoplasmique (RE). Des mutations de la néphrine provoquent une protéinurie. Nous avons examiné les effets des mutations faux-sens de la néphrine sur le repliement de cette protéine dans RE, sur son trafic cellulaire et sur l'induction de réponse déplié protéines (UPR). Le type sauvage (TS) de la néphrine et les mutants d'ADNc, I171N, G270C, S366R, S724C et R743C ont été exprimés dans des cellules 293T ou cellules glomérulaires épithéliales (GECs) par une transfection transitoire. Association de néphrine avec le chaperon de RE, la calnexine, a été étudiée par la co-immunoprécipitation. Activation de l'UPR a été évaluée par l'étude de l'expression du chaperon du RE, Grp94, la phosphorylation de la sous-unité (eIF2α) du facteur 2α d'initiation de la traduction eucaryote, et l'induction de C/EBP homologue de la protéine-10 (CHOP), ainsi que l'activation du facteur-6 de la transcription (ATF6)- l'activité luciférase du gène rapporteur. Tous les mutants de la néphrine ont montré l'association accrue avec la calnexine, par rapport au TS de la néphrine. Les mutants I171N et le G270C ont augmenté l'expression du Grp94 dans les cellules 293T, ont stimulé l'ATF6-activité luciférase dans les deux cellules 293T et GECs. Néphrine S366R et S724C ont tendance à induire l'UPR, mais les changements dans le Grp94 et l'activité ATF6-luciférase ont été moins cohérents. Le mutant R743C n'a pas amélioré l'expression de Grp94, ni l'ATF6-activité luciférase. Tous les mutants de la néphrine n'ont pas augmenté ni la phosphorylation d'eIF2α, ni l'expression de CHOP. La microscopie en immunofluorescence a montré la localisation du TS néphrine à la membrane plasmique, tandis que les mutants I171N et S366R à la partie périnucléaire, colocalisés avec la calnexine. Par ailleurs, les deux mutants de néphrine ont provoqué l'agrégation du chaperon du RE, la calréticuline, par rapport au TS. Le traitement des cellules avec la castanospermine (qui réduit l'interaction de la néphrine avec la calnexine) a entraîné la localisation d'une partie des mutants I171N et S366R de la néphrine à la membrane plasmique. Ainsi, certains mutants de néphrine montrent une déficience du repliment de la protéine dans RE et activent la branche ATF6 de l'UPR. L'induction de chaperons du RE peut représenter une réponse cytoprotectrice, permettant aux cellules de résister aux lesions protéotoxique. Le blocage de l'interaction de la néphrine avec la calnexine resulte à un retour partiel au TS de certains mutants de néphrine, et donc à la localisation de néphrine à la membrane plasmique.

The ErbB2 and TGFβ signaling pathways cooperate to promote breast cancer progression and metastasis. The formation of distant metastases is the leading cause of mortality for breast cancer patients. To identify the mechanisms underlying the synergy between ErbB2 and TGFβ pathways, we transformed mammary epithelial cells with a panel of activated ErbB2 receptors, in which specific autophosphorylation sites that initiate distinct signaling pathways were mutated. We determined tyrosine residues 1226/1227 and 1253 within the ErbB2 receptor are required for TGFβ-induced migration and invasion of breast cancer cells. Using transient knockdown approaches, we subsequently demonstrated that ShcA was required downstream of these tyrosine residues for these TGFβ-mediated effects. In addition, TGFβ stimulation of ErbB2-expressing breast cancer cells with diminished ShcA expression resulted in the formation of larger and more numerous focal adhesions. These results indicated that signaling through ShcA is required for the TGFβ-induced formation of pro-migratory, dynamic focal adhesions in ErbB2-expressing cells. To investigate a requirement for ShcA signaling in the promotion of tumor progression and metastasis in vivo, we generated ErbB2-expressing breast cancer cells with a stable shRNA-mediated knockdown of ShcA expression. Diminished ShcA expression impaired tumor growth and spontaneous metastasis. Immunohistochemical staining revealed that loss of ShcA signaling results in decreased tumor proliferation and endothelial cell recruitment, coupled with an increase in apoptosis. Rescue experiments with wild-type ShcA or a panel of ShcA functional domain mutants revealed that the PTB-domain and three tyrosine residues (239/240 and 313) were necessary for TGFβ-induced migration and invasion. The Grb2 and Crk adaptor proteins have been implicated in signaling downstream of these ShcA tyrosine residues. A transient knockdown of these adaptors uncovered specific roles for Grb2 downstream of ShcA Y313 and the Crk adaptors downstream of ShcA Y239/240 for TGFβ-induced effects. An investigation of the significance of these ShcA tyrosine sites for tumor growth in vivo demonstrated that ShcA signaling through Y313 enhances tumor cell survival while signaling through ShcA Y239/240 promotes the recruitment of endothelial cells. Finally, we employed an inducible knockdown of ShcA to identify acute TGFβ-induced gene expression changes in ErbB2-expressing cells that depend on ShcA expression. We identified numerous candidate genes that were regulated by TGFβ in a ShcA-dependent manner, including the BMP antagonist, Chordin-like 1. We confirmed that reduced ShcA signaling results in the up-regulation of secreted Chordin-like 1 protein in ErbB2-expressing cells following TGFβ stimulation. Functional roles for Chordin-like 1 in ErbB2-driven tumor growth, survival and angiogenesis are currently being investigated.The work described in this thesis is the first to identify ShcA as an integral mediator underlying the cooperation between the ErbB2 and TGFβ signaling pathways in breast cancer progression and to define molecular mechanisms through which ShcA functions in this context. / Les voies de signalisation ErbB2 et TGFβ coopèrent pour favoriser la progression tumorale et la formation de métastases associées au cancer du sein. La formation de métastases appert comme la principale cause de mortalité chez les patientes atteintes du cancer du sein. Dans le but d'identifier les mécanismes impliquants les voies de signalisation ErbB2 and TGFβ, nous avons transformé des lignées de cellules mammaires épithéliales avec différentes versions activées du récepteur ErbB2, dans lesquelles chacun des sites individuels d'autophosphorylation sont mutés. Ainsi, nous avons identifié les tyrosines 1226/1227 et 1253 du récepteur ErbB2 comme nécessaires pour l'augmentation de la migration et de l'invasion observée dans les cellules de cancer de sein traitées avec TGFβ. Par la suite, nous avons démontré que ShcA agissait en aval de ces résidus tyrosines pour médier les effets associés au traitement par TGFβ. Par ailleurs, la stimulation par TGFβ de cellules de cancer du sein exprimant ErbB2 et dans lesquelles l'expression de ShcA était atténuée se traduisait par la formation d'adhésions focales plus larges et plus nombreuses. Ensemble, ces résultats suggèrent qu'une voie de signalisation impliquant ShcA est nécessaire pour la formation d'adhésions focales pro-migratoires en réponse au traitement par TGFβ dans les cellules exprimant ErbB2. Afin de déterminer un rôle potentiel de ShcA pour favoriser la progression tumorale et la formation de métastases in vivo, nous avons généré des lignées cellulaires de cancer du sein dans lesquelles le niveau d'expression de ShcA était diminué de façon stable. Nous avons observé que la diminution du niveau d'expression de ShcA se traduisait par une réduction de la croissance tumorale et la formation de métastases. Par marquage immunohistochimique, nous avons observé que la perte d'expression de ShcA s'accompagnait d'une réduction de la prolifération tumorale et du recrutement des cellules endothéliales associée à une augmentation de l'apoptose. Des expériences de réexpression de ShcA de type-sauvage ou de versions mutantes des différents domaines fonctionnels ont montré que le domaine PTB ainsi que 3 résidus tyrosines (239/240 et 313) étaient impliqués dans l'augmentation de la migration et de l'invasion induite par traitement par TGFβ. Les protéines adaptatrices Grb2 et Crk peuvent signaler en aval de ces trois résidus tyrosines. Une diminution du niveau d'expression de ces différentes protéines adaptatrices a révélé un rôle joué par Grb2 en aval de Y313 de ShcA ainsi qu'un rôle de Crk en aval de Y239/240 de ShcA pour favoriser les effets associés au traitement des cellules par TGFβ. Une analyse in vivo a démontré que la signalisation utilisant Y313 favorisait la survie des cellules tumorales alors que la signalisation utilisant Y239/240 favorisait le recrutement des cellules endothéliales.Finalement, en réduisant l'expression inductible de ShcA nous avons identifié des gènes dont l'expression, qui dépend de l'expression de ShcA, est modifiée en réponse au traitement par TGFβ de cellules de cancer de sein exprimant ErbB2. Ainsi, nous avons identifié plusieurs candidats dont Chordin-like 1, un antagoniste des BMP. Nous avons par la suite confirmé que la réduction d'expression de ShcA se traduisait par une augmentation de la forme secrétée de la protéine Chordin-like 1 dans des cellules exprimant ErbB2 stimulées par TGFβ. Les rôles fonctionnels joués par Chordin-like 1 dans la formation, la croissance, la survie ou l'angiogenèse associées aux tumeurs exprimants ErbB2 est actuellement sous investigation.L'ouvrage présenté dans cette thèse est le premier à identifier ShcA comme étant un médiateur «integral » de la collaboration de signalisation intracellulaire entre ErbB2 et TGF-β lors de la progression du cancer du sein et qui définie le mécanisme moléculaire par lequel ShcA entreprend ses fonctions dans cette situation.