The soybean genome has between 46,000-66,000 protein coding genes, which determine the traits of the soybean plant. Out of these thousands of genes only a few gene promoters have been studied and well characterized. Promoter evaluation is very important especially for biotechnology applications as they determine gene expression levels, patterns and their profiles. Some of these characterized promoters in soybean are the lectins promoters of Le1, Le2, Le3 genes. In this study we have cloned the Le4 gene promoter and transformed into Arabidopsis thaliana by floral dip transformation technique to determine the expression profile using gusA as reporter gene. The expression profile was compared with plants already transformed with the promoters from Le1, Le2 and Le3. Part of the project was conducted in silico, in which promoter sequences of these homologues were retrieved from Phytozome (www.phytozome.net) and DNA motifs present in these promoters were predicted using PLACE database. The protein 3D structure of Le1 was used as template to compare with Le4. / Le génome du soja contient 46,000 à 66,000 gènes codant pour des protéines, qui déterminent les traits de la plante de soja. Cependant, parmi ces milliers de gènes, seulement quelques promoteurs de gènes ont été étudiés de façon approfondie. L'évaluation du promoteur est très importante, surtout pour les applications de biotechnologies, car elles déterminent les niveaux d'expression, les habitudes et les profils des gènes. Certains de ces promoteurs caractérisés dans le soja sont les promoteurs de lectines des gènes Le1, Le2 et Le3. Dans cette étude, nous avons cloné le promoteur du gène Le4 dans un vecteur binaire. Puis, nous l'avons transformé en Arabidopsis thaliana par la technique « floral dip transformation » afin de déterminer le profil d'expression en utilisant gusA comme étant un gène rapporteur. Le profil d'expression a été comparé avec les promoteurs déjà transformés à partir des gènes Le1, Le2 et Le3. Une partie du projet a été réalisée « in silico » dans lesquelles des séquences promotrices de ces homologues ont été récupérées à partir du programme Phytozome (www.phytozome.net). Des motifs d'ADN présents dans ces promoteurs ont été prédits en utilisant la base de données PLACE. Les motifs uniques ont été comparés. La structure des protéines en 3D de Le1 a été utilisée comme modèle pour comparer avec le gène Le4.

Type 1 diabetes susceptibility is associated with genetic variants that cause a lower level of insulin expression in the thymus, and more specifically in the medullary thymic epithelial cells (mTECs). The expression of insulin as well as other self-antigens in these mTECs has been demonstrated to be an essential component in the maintenance of self-tolerance. Although the Aire regulator is a known modulator of self-antigen expression in mTECs, not much else is known on the regulation of specific self-antigens and particularly of insulin's expression. My thesis project centers on this question.I first generated direct evidence that higher glucose, the main metabolic stimulus regulating insulin secretion in the pancreas, had no effect on the expression of insulin in the thymus with studies both in vivo and in vitro. I then showed that pro-inflammatory cytokines Ifn-γ and Tnf-α have a regulatory effect whereby their addition to cultured mTECs decreased levels of insulin, and mice lacking either of the two cytokines had increased levels of both insulin and other self-antigens. In addition, this mechanism was found to be independent of Aire, the first finding where Aire and insulin expression are discordant. Another factor that modulated the expression of insulin was the co-culturing of thymocytes with mTECs. The direct cell-to-cell contact of the two cell types upregulated insulin expression, as well as the expression of Aire. Furthermore, a microarray analysis generated an expression profile for two individual clones of mTECs, one that expresses insulin and one which does not. This has enabled a comprehensive view of the genes expressed by single mTECs, which had previously been impossible to define. A new surface marker was found to be differentially expressed in the insulin positive clone; CD34. The isolation of CD34+ primary mTECs showed an increased level of insulin expression and Aire expression. These findings have uncovered some of the Aire-independent regulatory mechanisms for insulin expression as a self-antigen in mTECs. / La prédisposition au diabète de type 1 est associé aux variantes génétiques qui modulent le taux d'expression de l'insuline dans le thymus et particulièrement dans les cellules médullaires epithéliales (mTECs). Cette expression de l'insuline ainsi que d'autres auto-antigènes dans les mTECs est essentielle pour maintenir l'auto-tolérance. Bien que le régulateur Aire est reconnu comme le principal contrôleur de l'expression des auto-antigènes il n'existe pas beaucoup plus d'information sur la régulation des auto-antigènes spécifiques et particulièrement sur l'insuline. Ma thèse est centrée sur ces questions.J'ai premièrement obtenu la preuve directe que le taux de glucose, le stimulus principal qui module l'insuline dans le pancréas ne modifie pas les niveaux d'expression de l'insuline dans le thymus, et ceci avec des études in vivo et in vitro. J'ai par après aussi démontré que les cytokines pro-inflammatoires Ifn-γ et Tnf-α ont des effets régulateurs dans le thymus, et l'addition de ces cytokines aux lignées cellulaires mTECs réduit les niveaux de l'insuline. Dans les souris manquant les gènes pour ces cytokines l'expression de l'insuline et d'autres auto-antigènes augmente. En plus, ce mécanisme est indépendant du régulateur Aire et constitue la première observation montrant l'absence de correlation entre l'insuline et Aire. Un autre facteur qui modifie les niveaux de l'insuline est la co-culture des thymocytes avec les mTECs. Le contact direct des deux types de cellules a augmenté l'expression de l'insuline ainsi que l'expression de Aire. De plus, nous avons procédé à l'analyse du profil transcriptionnel d'ARN de deux souches clonales de mTECs, une qui exprime l'insuline et une qui ne l'exprime pas. Ces résultats ont permis une vue d'ensemble des gènes qui sont exprimés par un mTEC individuel, que auparavant était impossible. Un nouveau marqueur de surface a été ainsi identifié, CD34, qui est exprimé à plus haut niveau dans le clone positif pour l'insuline. Les cellules mTECs primaires qui expriment CD34 ont étés séparées et elles expriment un niveau élevé l'insuline et le Aire. Ces résultats ont démontrés des nouveaux mécanismes indépendants de Aire qui contrôlent l'expression de l'insuline comme auto-antigène dans les mTECs.

Short, repetitive G-rich DNA sequences present at telomeres are synthesized by telomerase, a ribonucleoprotein consisting of a catalytic subunit, the telomerase reverse transcriptase, TERT, and an integrally associated RNA, TR. Human TERT (hTERT) can repetitively reverse transcribe its short RNA template, acting processively to add multiple telomeric repeats onto the same DNA substrate. We investigated if threshold levels of telomerase activity and processivity are required to maintain telomere length and/or function and immortalize human cells with limited lifespan. Specifically, we assessed hTERT variants with mutations in several motifs implicated in processivity, namely the N terminus (E79A, E90K), RT motif 1 (I624M), the 'Insertion in Fingers' domain (V791Y), the C 'catalytic center' motif (L866Y), the E 'primer grip' motif (W930F) and the C terminus (∆1047-1056 and ∆1107-1118). The N-terminal and motif 1 hTERT mutants did not reveal any interesting phenotypes in vitro or in cells. On the other hand, the remaining variants, except L866Y, displayed a substantial decrease in processivity. Despite the presence of short telomeres in cells expressing these low processivity telomerase variants, only W930F could immortalize limited lifespan human cells. We demonstrate that limiting levels of DNA synthesis on the order of 20% of wild-type, and extension of as few as three telomeric repeats displayed by W930F are sufficient to maintain functional telomeres and immortalize limited lifespan human cells. The hTERT-C-terminal mutants likely could not immortalize cells due to synthesis of only 2 or less telomeric repeats. V791Y could not maintain telomere function due to a failure to localize to telomeres. On the other hand, L866Y displayed a 2-3 fold increase in proccessivity compared to wild-type telomerase. Cells expressing this mutant displayed telomere elongation followed by heterogenous telomere lengths and an increase in short telomeres, and fragile sites at telomeres accompanied by telomere trimming, indicating that processivity levels above that displayed by wild-type telomerase lead to telomere replication stress. These results suggest that telomere function and length, and immortalization in human cells are regulated by telomerase enzyme processivity. / Des courtes séquences répétées et G-riches d'ADN présentes aux télomères sont synthétisées par télomérase, une ribonucléoprotéine constituée d'une sous-unité catalytique, 'telomerase reverse transcriptase' ou 'TERT', et un ARN associé nommé 'TR'. TERT humain (hTERT) peut diriger de façon répétitive la transcription inverse de son ARN, agissant processivement en ajouteant de multiples répétitions télomériques sur le substrat d'ADN. Nous avons étudié si des niveaux limites d'activité ou de processivité de télomérase sont nécessaires pour maintenir la taille ou la fonction des télomères et pour immortaliser des cellules humaines possédant une durée de vie limitée. Plus précisément, nous avons évalué plusieurs variants de hTERT avec des mutations dans des motifs impliqués dans la processivité, incluant l'extrémité N-terminale (E79A, E90K), le motif 1 du Reverse Transcriptase (RT) (I624M), le domaine 'Insertion in Fingers' (V791Y), le motif C (L866Y), le motif E (W930F) et l'extrémité C-terminale (Δ1047-1056 et Δ1107-1118). Les mutations dans le terminus N et le motif 1 de hTERT n'ont pas révélées de phénotypes intéressants. Les autres variants, sauf L866Y, ont demontré une diminution substantielle des niveaux de processivité. Malgré la présence de télomères courts dans les cellules exprimant ces variantes de processivité faibles, seul W930F pouvait immortaliser les cellules. Nous démontrons que le niveau de synthèse d'ADN de l'ordre de 20% de hTERT sauvage, et l'extension de seulement trois répétitions télomériques par W930F sont suffisants pour maintenir des télomères fonctionnels et immortaliser les cellules. Les variants avec des mutations dans le terminus C ne pouvaient pas immortalizer les cellules dues à la synthèse de seulement 2 ou moins de répétitions télomériques. V791Y ne pouvait pas maintenir la fonction des télomères en raison d'une incapacité à se localiser aux télomères. D'autre part, L866Y a demontré une augmentation des niveaux de proccessivité de 2-3 fois par rapport à la télomérase sauvage. Les cellules exprimant ce mutant ont presenté un rallongement des télomères, suivi de télomères de tailles hétérogènes et une augmentation du nombre de télomères courts, accompagné d'une augmentation de sites fragiles aux télomères et de télomères tronqués, tout ce qui indique que des niveaux de processivité plus élevés que ceux du type sauvage mènent à des difficultés réplicatives aux télomères. Ces résultats suggèrent que la fonction et la taille des télomères, et l'immortalisation des cellules humaines sont réguléss par la processivité de l'enzyme télomérase.

Immunoglobulin superfamily, member 1 (IGSF1, formerly known as InhBP/p120) is a protein of unknown function, highly expressed in the pituitary gland. In this thesis, I characterized: 1) co- and post-translational processing of IGSF1, 2) expression of IGSF1 in several tissues, and 3) the link between IGSF1 and the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis. The IGSF1/Igsf1 gene is located on the X chromosome, and multiple mRNA isoforms have been identified in both humans and mice. The canonical full-length protein is encoded by human mRNA isoforms IGSF1-1, IGSF1-3, and IGSF1-4, and murine Igsf1-1. Along with our collaborators, I demonstrated that the canonical full-length protein is co-translationally cleaved at an internal signal peptide into N-terminal (NTD) and C-terminal domains (CTD), and that N-linked glycosylation is important for trafficking of the CTD to the cell surface. I then investigated expression of IGSF1-CTD in the pituitary gland and several other tissues. Using a combination of approaches, I demonstrated Igsf1/IGSF1-CTD expression in anterior pituitary thyrotropes, somatotropes, and lactotropes, as well as in the murine hypothalamus and fetal liver. I also characterized the relative abundance of Igsf1 isoforms in the pituitary and hypothalamus, and the glycosylation patterns of IGSF1-CTD in different tissues.Finally, I sought to determine the function of IGSF1. Igsf1-deficient mice were previously generated by ablation of non-coding exon 1 (Igsf1Δex1). The mice were reported to be overtly normal, although analyses were largely limited to reproductive function, as IGSF1 had been predicted to play a role in the regulation of follicle-stimulating hormone synthesis. Our clinical collaborators identified mutations in IGSF1 in several male patients with central hypothyroidism. I showed that the disease-associated mutations lead to intracellular retention of the IGSF1-CTD protein, consistent with IGSF1 loss-of-function. Further, I analyzed HPT axis function of Igsf1-deficient male mice, and found that they phenocopy several features of the human disorder, thus confirming that loss of IGSF1 leads to central hypothyroidism. In addition, the mice have decreased pituitary thyroid-stimulating hormone (TSH) content and thyrotropin-releasing hormone receptor (Trhr) expression, suggestive of impaired TRH signaling. Overall, my work contributes to our understanding of IGSF1 expression, and describes a potential function for IGSF1 in regulating the HPT axis. Delineating molecular mechanisms of how IGSF1 acts in the pituitary gland to affect endocrine axes will contribute to the ongoing search for the function of this mysterious protein. / Le membre 1 de la superfamille des immunoglobulines (IGSF1, anciennement connu sous le nom InhBP/p120) est une protéine ayant une fonction inconnue, fortement exprimé dans la glande pituitaire. Dans cette thèse, j'ai caractérisé: 1) les processus co-et post-traductionnels de IGSF1, 2) l'expression de IGSF1 dans plusieurs tissus, et 3) le lien entre IGSF1 et l'axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HPT).Le gène IGSF1/Igsf1 est situé sur le chromosome X, et de multiples isoformes d'ARNm ont été identifiés chez les humains et les souris. La protéine canonique complète est codée par l'ARNm des isoformes IGSF1-1, IGSF1-3, et IGSF1-4 (homme), et Igsf1-1 (murine). Avec nos collaborateurs, j'ai démontré que la protéine canonique est clivé durant sa traduction en deux parts: le domaine N-terminal (NTD) et le domaine C-terminal (CTD) à cause d'un peptide signal interne, et que la N-glycosylation est importante pour le transport du CTD à la surface de la cellule. J'ai ensuite étudié l'expression d'IGSF1-CTD dans la glande pituitaire et de plusieurs autres tissus. En utilisant une combinaison d'approches, j'ai démontré l'expression d'Igsf1/IGSF1-CTD dans les thyrotropes, somatotropes, et lactotropes de l'hypophyse antérieure, ainsi que dans l'hypothalamus murin et le foie fœtal. J'ai également caractérisé l'abondance relative des isoformes Igsf1 dans l'hypophyse et l'hypothalamus, et les motifs de glycosylation des IGSF1-CTD dans différents tissus.Enfin, j'ai cherché à déterminer la fonction d'IGSF1. Des souris déficientes en Igsf1 ont été précédemment générées par l'ablation de l'exon 1 non-codant (Igsf1Δex1). Les souris ont été ouvertement normales, même si les analyses ont été largement limitées à la fonction de reproduction, comme cela avait été prédit IGSF1 à jouer un rôle dans la régulation de la synthèse de l'hormone folliculo-stimulante. Nos collaborateurs cliniciens ont identifiés des mutations dans IGSF1 dans plusieurs patients de sexe masculin atteints d'hypothyroïdie centrale. J'ai démontré que les mutations associées à la maladie causent la rétention intracellulaire de la protéine IGSF1-CTD, menant à une perte de fonction d'IGSF1. De plus, j'ai analysé la fonction de l'axe HPT des souris males déficientes en Igsf1, et j'ai constaté qu'ils phénocopient plusieurs traits de la maladie humaine, confirmant ainsi la perte de IGSF1 conduisant à l'hypothyroïdie centrale. En outre, les souris ont une diminution de thyrotropine (TSH) dans l'hypophyse et une diminution des récepteurs thyréolibérine (Trhr) suggérant une détérioration de la signalisation de thyréolibérine (TRH).Dans l'ensemble, mon travail contribue à notre compréhension de l'expression d'IGSF1, et décrit une fonction potentielle pour IGSF1 dans la régulation de l'axe HPT. La recherche des mécanismes moléculaires de la façon dont IGSF1 affecte les axes endocriniens dans l'hypophyse contribuera à la recherche permanente de la fonction de cette protéine mystérieuse.

Cancer and chronic pain are two common pathologies affecting millions of patients worldwide. Much like most other disease states, they can be determined genetically, environmentally, or both. Unlike the static genome, the epigenome is responsible for interpreting environmental interactions and is often altered in disease states. A subset of epigenetic modifications, known as DNA methylation, is capable of mediating gene silencing. In this thesis, two cases will be explored probing the nature of DNA methylation in cancer and in peripheral neuropathy. Aberrant DNA methylation is a common hallmark of cancer often resulting in the methylation of tumor suppressors and the demethylation of oncogenes. The identity of a DNA methylase, however, remains elusive. One candidate, methyl binding domain 2 (MBD2), has been previously characterized as a demethylase and also functions as a transcriptional repressor. One possible explanation for its role as a repressor may involve the direct activation of a repressor which can then mediate silencing. An attractive class of genes for this model are microRNAs, which are capable of binding several targets in the cell and mediate their silencing. We therefore test the hypothesis that MBD2 is capable of activating a microRNA which is capable of negatively-regulating target genes. In this thesis, we delineate mechanisms that demonstrate MBD2 is capable of binding a microRNA, mir-496, which is then capable of inducing itsiactivation. We further show that mir-496 can mediate a repressive action on three separate genes in the cell that have tumor suppressive roles in cancer. Chronic pain has been shown to alter gene expression and brain anatomy and is often accompanied with comorbidities that affect cognitive processing, sleep and anxiety. Interestingly, these changes have been shown to be reversible following effective treatment of pain, suggesting the mechanisms behind pain may also be reversible, thus prompting the study of pain epigenetics. We therefore proposed to test the hypothesis that the methylome and transcriptome are altered in the brain following peripheral nerve injury. We were able to identify a signature of DNA methylation and transcription specific to the prefrontal cortex and amygdala that accompanied peripheral nerve injury and behavioral signs of neuropathy. Furthermore we were able reverse behavioral signs of neuropathic pain and altered methylation states in the prefrontal cortex with environmental enrichment, demonstrating their reversible nature. Taken together, this thesis explores the role of DNA methylation in two complex diseases: through small scale processes in cancer and through broader changes at the level of the methylome and transcriptome in chronic pain. In identifying these molecular pathways and signatures, we hope to improve the mechanistic understanding of these pathologicaliistates, ultimately resulting in better treatment outcomes for millions of patients worldwide. / Le cancer et la douleur chronique sont deux pathologies courantes qui affectent des millions de personnes à travers le monde. Comme beaucoup d'autres états pathologiques, ils peuvent être déterminés génétiquement et par l'environnement. Contrairement au génome qui est statique, l'épigénome est responsable de l'interprétation des interactions avec l'environnement et est souvent altéré dans des états pathologiques. Un sous-ensemble de modifications épigénétiques, appelé méthylation de l'ADN, est capable de médier l'inactivation génique. Dans cette thèse, deux cas seront explorés pour sonder la nature de la méthylation de l'ADN dans le cancer et dans la neuropathie périphérique. Une méthylation de l'ADN aberrante est une caractéristique commune du cancer qui entraîne souvent la méthylation de gènes suppresseurs de tumeurs et la déméthylation d'oncogènes. L'identité d'une déméthylase de l'ADN, cependant, reste insaisissable. Un candidat, "methyl binding domain 2" (MBD2), a été précédemment caractérisé comme étant une déméthylase et fonctionnant également comme un répresseur transcriptionnel. Une explication possible pour son rôle en tant que répresseur pourrait impliquer l'activation directe d'un répresseur qui pourrait ensuite servir de médiateur de la répression. Une classe de gènes intéressante dans ce modèle est celle des microARN, qui sont capables de se lier à plusieurs cibles dans la cellule et de conduire à leur répression. Nous avons donc testé l'hypothèse que MBD2 serait capable d'activer un micro-ARN capable de réguler négativement les gènes cibles. Dans cette thèse, nous avons étudié les mécanismes qui démontrent que MBD2 est capable de se lier à un microARN, mir-496, qui est alors capable d'induire son activation. Nous montrons en outre que mir-496 peut servir de médiateur d'une action répressive sur trois gènes distincts qui ont des rôles de suppresseurs de tumeur dans les cellules cancéreuses. La douleur chronique a été montrée comme modifiant l'expression des gènes et l'anatomie du cerveau. Elle est souvent accompagnée de comorbidités qui touchent le traitement cognitif, le sommeil et l'anxiété. Fait intéressant, ces changements se sont montrés réversibles après un traitement efficace de la douleur, suggérant que les mécanismes à l'origine de la douleur pourraient aussi être réversibles, incitant ainsi à l'étude de l'épigénétique de la douleur. Nous avons donc proposé de tester l'hypothèse que le méthylome et le transcriptome seraient altérés dans le cerveau après une lésion nerveuse périphérique. Nous avons pu identifier une signature de méthylation de l'ADN et de transcription spécifique au cortex préfrontal et à l'amygdale qui accompagne une lésion du nerf périphérique et les signes comportementaux de la neuropathie. En outre, nous avons pu inverser les signes comportementaux de la douleur neuropathique et les niveaux de méthylation dans le cortex préfrontal par un enrichissement de l'environnement, démontrant ainsi leur caractère réversible. L'ensemble de cette thèse explore le rôle de la méthylation de l'ADN dans deux maladies complexes : au travers de processus à petite échelle dans le cancer et par des changements plus larges au niveau du méthylome et du transcriptome dans la douleur chronique. En identifiant ces voies moléculaires et les signatures épigénétiques, nous espérons améliorer la compréhension mécanistique de ces états pathologiques, ouvrant la voie à de meilleurs traitements pour des millions de patients dans le monde.

The objective of my research project was to study and characterize the transcriptional role of the CUX1 transcription factor both on a global scale and with regards to specific cellular processes. I have carried out genome-wide location analysis experiments to identify large numbers of potential direct targets of CUX1 and investigated their regulation by CUX1 using expression profiling experiments following both overexpression of the active p110 CUX1 isoform and following its knockdown using shRNA. This study demonstrated that CUX1 can both activate and repress its targets even when binding at a distance from their promoters and that its consensus binding sequence does play a role in its binding but is not required forit in many cases. Analysis of the putative targets of CUX1 identified by genome-wide location analysis strongly suggested a role for the factor in the cellular response of cells to DNA damage. I used molecular biology methods to investigate this and demonstrated that CUX1's transcriptional activity is required for the maintenance of adequate levels of several key proteins constituting the machinery necessary for an effective response to DNA damage. Cells lacking CUX1 expression have defective cell cycle arrest and DNA damage repair capacities, reduced survival following DNA damage and show a phenotype of increased genomic instability. Previous studies of a mouse model of mammary gland tumours showed that a subset of tumours from p110 and p75 CUX1 over-expressing mice display activation of the Wnt/β-Catenin pathway. However, the mechanism by which only some of these tumours displayed this phenotype were not fully understood. I used expression profiling on microdissected material from these tumours to characterize the transcriptional effect of p110 and p75 CUX1 expression in these tumours and to identify collaborating events in Wnt/β-Catenin pathway activation. I identified members of the GLI family of transcription factors as being required for activation of the Wnt/β-Catenin pathway in these tumours. I also showed that these tumours display features of epithelial to mesenchymal transition, which may have implications for the invasiveness and severity of these tumours. The cooperation between CUX1 and GLI genes was confirmed by meta-analysis of human tumour datasets as well as cell based assays testing the ability of each factor to activate the Wnt/β-Catenin pathway on their own and in combination. / L'objectif global de ma thèse était d'étudier et de caractériser l'activité transcriptionelle du facteur de transcription CUX1, autant de façon globale que dans le contexte de processus cellulaires spécifiques. J'ai effectué des expériences de localisation génomiques à grande échelle afin d'identifier un grand nombre de cibles potentielles directes de transcription de CUX1 et j'ai analysé leur régulation par CUX1 en effectuant des expériences de profilage d'expression génétique à la suite de la surexpression de l'isoform p110CUX1 ainsi qu'à la suite de la répression de CUX1 par shRNA. Cette étude a démontré que CUX1 peut activer ou réprimer l'expression de ces cibles, même lorsqu'il se lie à une distance considérable du promoteur de ces gènes, et que la séquence consensus de liaison de CUX1 joue un rôle dans sa liaison à l'ADN mais n'est pas nécessaire pour celle-ci dans plusieurs cas. L'analyse de cibles potentielles de CUX1 identifiées par des expériences de localisation génomique a grande échelle ont fortement suggéré l'implication de CUX1 dans la réponse des cellules au dommage à l'ADN. J'ai utilisé diverses techniques de biologie moléculaire pour étudier ce phénomène et j'ai démontré que l'activité transcriptionelle de CUX1 est nécessaire au maintien de niveaux suffisants de nombreuses protéines constituant la machinerie essentielle à la réponse des cellules au dommage à l'ADN. Les cellules n'exprimant pas ou peu de CUX1 sont déficientes dans leur capacité d'arrêt du cycle cellulaire et de réparation du dommage à l'ADN, sont plus sensibles au dommage et montrent un phénotype d'instabilité génomique accrue. Des études précédentes de tumeurs des glandes mammaires dans un modèle de souris ont montré qu'une partie des tumeurs provenant de souris surexprimant p110 ou p75 CUX1 montraient une activation du processus de signalement Wnt/β-Catenin. Cependant, le mécanisme par lequel seule une partie des tumeurs montrait ce phénotype n'était pas connu. J'ai donc effectué du profilage d'expression génétique sur ces tumeurs afin de caractériser l'effet transcriptionel de CUX1 dans celles-ci et d'identifier d'autres facteurs qui collaborent dans l'activation de Wnt/β-Catenin. J'ai ainsi identifié des membres de la famille de facteurs de transcription GLI comme étant requis pour l'activation de Wnt/β-Catenin dans ces tumeurs. J'ai aussi observé des caractéristiques de transition épithélio-mésenchymateuse dans ces tumeurs, ce qui pourrait avoir des implications sur la capacité d'invasion et la sévérité de celles-ci. La coopération entre CUX1 et les gènes GLI a été confirmée par une méta-analyse de données de profilage d'expression de tumeurs humaines ainsi qu'avec des expériences cellulaires testant la capacité de chacun de ces deux facteurs à activer Wnt/β-Catenin, individuellement et en combinaison.

Wnts are secreted extracellular signaling molecules that act locally to control diverse developmental processes such as cell fate specification, cell proliferation, and cell differentiation. Three WNT signaling pathways have been identified. The best characterized is the canonical or WNT/β-catenin signaling pathway. Recently, the WNT signaling pathway has been implicated in ovarian development and differentiation. However, little is known about the expression or role of β-catenin/Tcf-signaling activity within ovarian compartments. In order to aid in the ongoing pursuit of elucidating the mechanisms that govern ovarian differentiation and development, I explored the possible roles of the canonical WNT signaling pathway in the development of the ovarian surface epithelium (OSE) and follicular ovulatory capability. To examine canonical Wnt-signaling within the ovary, I utilized the Tcf-lacZ-reporter mice. In Manuscript I, I present a detailed spatio-temporal pattern of β-catenin/Tcf mediated expression in the OSE throughout development. Cells covering the indifferent gonad at E11.5 were β-catenin/Tcf signaling (lacZ-positive). With further development and sexual differentiation, lacZ staining was lost over the testis but maintained on embryonic ovaries. This staining became dispersed and the proportion of lacZ-positive OSE cells decreased to relative constancy when female mice reached maturity. FACS analyses revealed the lacZ-positive cell population exhibits cytoprotective mechanisms as indicated by enrichment within a side population. The results indicate that the mouse OSE is heterogeneous and may contain a population of progenitor cells. In Manuscript II, I investigated the molecular connection between β-catenin and Tcf-mediated lacZ activity and assessed whether β-catenin stabilization regulates β-catenin/Tcf-mediated gene expression and OSE proliferation. β-catenin was detected on the lateral membranes of ovarian epithelium. I demonstrated that treatment of OSE cells with Wnt agonist stabilized β-catenin but failed to induce β-catenin/Tcf-lacZ expression. Furthermore, E-cadherin expression was down-regulated and the proliferative potency of OSE cells increased. Of four ovarian cancers cell lines screened, only the HEY cell line demonstrated induction of luciferase reporter expression upon canonical WNT stimulation. These studies indicate that nuclear localization of β-catenin is insufficient for β-catenin/Tcf mediated gene expression in OSE cells, suggesting GSK-3β inhibition as a result of altered WNT signaling is of major importance in the control of epithelial-mesenchymal transition and cell proliferation leading to tumorigenesis. In Manuscript III, I investigated the role of the canonical WNT signaling pathway in the development of follicular ovulatory capability. Oocytes in primordial and primary follicles did not show active WNT signaling. β-catenin/Tcf-signaling was activated at the secondary follicle stage and the proportion of β-catenin/Tcf-signaling (lacZ-positive) follicles increased with follicular maturation. In contrast, the majority (>90%) of oocytes recovered from the oviducts at estrus and following hormone stimulation were lacZ-negative. The results indicate that the canonical WNT signaling pathway is active in growing oocytes and suggest that canonical WNT signaling may be involved in the development of follicular ovulatory capability and identifies non-ovulatory follicles. / Les Wnts sont des molécules de signalisation sécrétées dans l'espace extracellulaire pour réagir localement et contrôler divers processus du développement comme la spécification, la prolifération et la différenciation des cellules. Trois voies de signalisation WNTS ont été identifiées. La plus connue est la voie canonique appelée aussi la voie WNT/β-catenin. Récemment des études ont montré que la voie de signalisation WNT serait impliquée dans le développement et la différenciation ovarienne. Malgré ces études, peu est connu sur l'expression et la fonction de l'activité β-catenin/Tcf dans les différents compartiments d'ovaire. Pour clarifier les mécanismes moléculaires responsables dans le développement d'ovaire, j'ai étudié le rôle de la signalisation WNT/β-catenin durant la formation d'épithélium superficiel ovarien et dans la capacité ovulatoire des follicules. Pour visualiser l'implication de la voie canonique dans l'activation ovarienne, nous avons utilisé des souris transgéniques qui expriment la protéine β-galactosidase (lacZ) en réponse des protéines β-catenin/Tcf.Le premier article que je présente (Manuscrit I) décrit l'activation spatiotemporal de β-catenin/Tcf dans l'épithélium superficiel ovarien au cours du développement de la souris. Au jour E11.5, la gonade non-différenciée est marquée positivement pour LacZ indiquant que β-catenin/Tcf est activée. Au cours de la différenciation sexuelle de la souris, l'expression de LacZ disparait dans les testicules. Par contre, dans l'ovaire embryonnaire l'expression de LacZ est maintenue. À la maturation sexuelle de la souris femelle, l'expression de LacZ est devenue plus diffuse et la quantité de cellules qui expriment LacZ a diminué. Une analyse de cytométrie en flux a indiqué que la population de cellules positive pour LacZ démontre des mécanismes cytoprotecteurs. En conclusion, les résultats suggèrent que l'épithélium superficiel ovarien est constitué d'une population de cellules hétérogène et mais aussi de cellules progénitrices. Le deuxième article que je présente (Manuscrit II) étudie la stabilisation de β-catenin, les gènes induit par le complexe de β-catenin/Tcf et la prolifération d'épithélium superficiel ovarien. β-catenin est localisée dans les membranes latérales d'épithélium ovarien. J'ai démontré que la stimulation des cellules d'épithélium superficiel ovarien avec une agoniste Wnt stabilise β-catenin mais n'induit pas l'expression de lacZ dans les souris transgéniques. En plus, le niveau d'expression du gène E-cadherin a baissé et la prolifération des cellules d'épithélium superficiel ovarien a augmenté. Des quatre lignées cellulaires de cellules ovariennes cancéreuses qu'on a examinées, seulement la lignée HEY avait une réponse transcriptionelle à la stimulation de protéines WNT canoniques. Nos études révèlent que la localisation nucléaire de β-catenin n'est pas suffisante pour induire l'expression de ces gènes cibles dans l'épithélium superficiel ovarien. Dans les cellules cancereuses la voie de signalisation WNT est altèrée de sorte que l'inhibition de GSK-3β est augmentée et β-catenin est activée ce que contrôle la prolifération et la transition d'éptihelium à mésenchyme durant la tumorigenèse.Le troisième article que je présente (Manuscrit III) examine le rôle de la voie canonique durant le développement folliculaire. Les ovocytes des follicules primordiaux et primaires ne montraient aucune activation de la signalisation WNT. L'activation de β-catenin/Tcf était présente dans les follicules secondaires et la proportion de follicules positifs pour l'expression de lacZ a augmenté durant la maturation des follicules. Au contraire, la majorité (>90%) d'ovocytes retrouvés dans les oviductes durant l'oestrus et aprés un traitement hormonal n'exprimait pas le gène lacZ. Nos résultats indiquent que la voie de signalisation canonique de WNT est activée durant la croissance des ovocytes et peut identifier les follicules non-ovulatoires.

Trypanosomatid pathogens cause devastating diseases in humans and animals and continue to pose a major challenge in the drug development. Mitochondrial gene expression in trypanosomatid pathogens requires extensive post transcriptional modification, known as RNA editing which generates translatable transcripts for essential components of parasite respiratory complex. RNA editing is catalyzed by a multiprotein complex called editosome. Most of the editosome proteins are essential for parasite survival, thereby making editosome a suitable target for drug discovery. However, how editosome proteins are assembled and perform RNA editing is not fully understood. We hypothesized that identification of novel compounds targeting and perturbing this unique process will not only help to determine the function and assembly of the editosome proteins but may also be used as compounds against all three major trypanosomatid pathogens. In the first part of the thesis, I present developing and testing of a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based high throughput screening assay for identification of compounds that inhibit editosome function. Furthermore, we use our assay to confirm inhibiting effect of known inhibitors of an essential editosome protein, T. brucei RNA editing ligase 1(TbREL1). Using our assay, we also show that these inhibitors are able to inhibit RNA editing in the context of partially purified editosome.The second part of thesis describes a pilot screen of a small set of compounds that were identified via virtual screening of a chemical library against TbREL1. Using secondary biochemical assays we confirmed the specificity of inhibition and showed that these compounds find other targets in addition to the intended TbREL1 target. We showed for the first time that the inhibitory compounds interfere with the interaction of editosome with substrate RNA and consequently lead to the loss of all activities associated with the functional editosome. Moreover, we show that this inhibition is able to interfere with the assembly of the editosome proteins and propose a model to describe possible mode of inhibition by these compounds. In the third part of thesis, I present a study that compares the mechanism of action of inhibitory compounds in the context of recombinant versus native TbREL1 in the editosome. We show that these compounds interfere with RNA substrate binding activities of the editosome accessory factors MRP1&MRP2 (mitochondrial RNA binding proteins 1&2) which result in perturbing other editing activities. We show that these compounds can only inhibit TbREL1 function when the accessory factors are not present. Furthermore, we performed alanine mutagenesis of the amino acid residues of TbREL1 that are predicted to bind inhibitors. We provide a detailed map of the structure of enzyme-inhibitor complex with an opportunity for future design of more potent inhibitors of TbREL1. These studies have led to identification and characterization of novel inhibitors that result in inactivation of editosome function. Moreover, elucidation of the mechanism of RNA editing inhibition provides a basis for future selection of more efficient and potent inhibitors against the editosome proteins. Therefore, this work contributes to both the functional studies of an essential gene expression mechanism and to an exciting possibility for future drug development against three related trypanosomatid pathogens. / Pathogènes des trypanosomatides sont responsable de maladies dévastatrices chez les humains et les animaux et continuent de poser un défi majeur dans le développement de médicaments. L'expression du gène mitochondrial chez les agents pathogènes de la famille des trypanosomatides nécessite une modification post transcriptionnelle vaste, connue sous le nom d'édition de l'ARN, qui génère des transcrits traduisibles pour les composants essentiels du complexe respiratoire du parasite. L'édition de l'ARN est catalysée par un complexe multiprotéique appelé éditosome, dont la plupart des protéines sont essentiels pour la survie du parasite, ce qui fait de l'éditosome une cible appropriée pour la découverte de médicaments. Cependant, la façon dont les protéines de l'éditosome sont assemblés et effectue l'édition de l'ARN n'est pas entièrement comprise. Nous émettons l'hypothèse que l'identification de nouveaux composés ciblant et perturbant ce processus unique permettra non seulement de déterminer la fonction et l'assemblage des protéines de l'éditosome mais également d'être utilisé en tant que composés contre les trois principaux pathogènes de la famille des trypanosomatides. Dans la première partie de la thèse, je présente l'élaboration et l'essai basé sur la fluorescence avec un criblage à haut débit pour l'identification de composés qui inhibent la fonction de l'éditosome. En outre, nous avons utilisé notre test pour confirmer l'effet inhibiteur des inhibiteurs connus d'une protéine essentielle de l'éditosome, T. brucei RNA editing ligase 1(TbREL1). Grâce à notre test, nous avons montré également que ces inhibiteurs sont capables d'inhiber la fonction d'édition de l'ARN dans le contexte de l'éditosome partiellement purifié. La deuxième partie de la thèse décrit un essai pilote d'un petit ensemble de composés qui ont été identifiés par criblage virtuel contre TbREL1. En utilisant des tests secondaires, nous avons confirmé la spécificité de l'inhibition et montré que ces composés ont trouvé d'autres cibles en plus de celle de TbREL1. Nous avons montré pour la première fois que les composés inhibiteurs interférent avec l'interaction de l'éditosome à l'ARN substrat et par conséquent entraîne la perte de toutes les activités liées à la fonction de l'éditosome. De plus, nous avons montré que cette inhibition est capable d'interférer avec l'assemblage des protéines de l'éditosome et avons proposé un modèle pour décrire le mécanisme possible d'inhibition par ces composés. Dans la troisième partie de la thèse, je présente une étude qui compare le mécanisme d'action des composés inhibiteurs dans le contexte de TbREL1 recombinant ou natif dans l'éditosome. Nous avons montré que ces composés interfèrent avec les activités de liaison à l'ARN des facteurs accessoires de l'éditosome MRP1 et MRP2 (protéines liant les ARN mitochondriaux 1 & 2) qui aboutissent à la perturbation d'autres activités d'édition. Nous avons montré que ces composés peuvent seulement inhiber la fonction de TbREL1 en l'absence des facteurs accessoires. En outre, nous avons effectué une mutagenèse d'alanine des résidus d'acides aminés de TbREL1 qui sont prévus dans la liaison aux inhibiteurs. Nous fournissons une carte détaillée de la structure du complexe enzyme-inhibiteur avec une opportunité de conception future de plus puissants inhibiteurs de TbREL1. Ces études ont conduit à l'identification et la caractérisation de nouveaux inhibiteurs qui se traduisent par l'inactivation de la fonction de l'éditosome. En outre, l'élucidation du mécanisme d'inhibition de l'édition de l'ARN fournit une base pour la sélection future d'inhibiteurs plus efficaces et plus puissants contre les protéines de l'éditosome. Par conséquent, ce travail contribue à la fois aux études fonctionnelles d'un mécanisme d'expression d'un gène essentiel et à une possibilité passionnante pour le développement de futur médicament contre trois agents pathogènes liés de la famille des trypanosomatides.

Cancer is a leading cause of death worldwide and accounts for about one fifth of all death in the Western world. In 2008, nearly 12.7 million new cancer cases and 7.6 million cancer deaths occurred worldwide. The development of cancer is a multistage process, during which cells acquire a series of mutations that eventually lead to unrestrained cell growth, evasion of cell death, angiogenesis, invasion of the surrounding tissue and finally spreading to other parts of the body. The mammalian proprotein convertases (PCs) constitute a family of nine secretory serine proteases that are related to bacterial subtilisin and yeast kexin. They have been associated with cancer since the early 1990s. By processing cancer-associated factors, PCs are believed to play key roles in almost every step of cancer development. Seven of these PCs (PC1, PC2, furin, PC4, PC5/6, PACE4 and PC7) activate, or less frequently inactivate, a wide variety of substrates, including hormones, growth factors, receptors, adhesion molecules, angiogenic factors, metalloproteases. Among these substrates, some of them are key factors controlling cancer progression and metastasis. The last member of this family proprotein convertase subtilisin kexin 9 (PCSK9) only cleaves itself and participates in maintaining the levels of cholesterol, which was shown to have impacts on cancer incidence.In this thesis, I focused on the role of two PCs, PC5/6 and PCSK9, in cancer development. I first showed that PC5/6 is systematically down-regulated in human and mice intestinal tumors. In ApcMin/+ mice which are a colonic cancer model and develop numerous adenocarcinomas along the intestinal tract, the specific knockout of PC5/6 in the intestine and colon leads to higher number of tumors, particularly in duodenum. This suggests that PC5/6 plays a protective role against tumorigenesis in the intestine. Although PC5/6 is protective in intestinal cancer, it has been shown to promote tumor progression in other cancer types e.g., brain and skin. Interestingly, PC5/6 is inhibited by some natural inhibitors, the latent TGFbeta binding proteins 2 and 3 (LTBP-2, -3). These two proteins reduce the enzymatic activity of PC5/6A and reduce the bio-availability of PC5/6A by sequestering the zymogen proPC5/6 in the extracellular matrix. Finally, I demonstrated that the lack of PCSK9 leads to a significantly lower level of liver metastasis of melanoma cells. This cancer protective effect is due to low plasma cholesterol levels as well as high apoptosis in liver stroma and metastasized tumors that are associated with PCSK9 deficiency.In summary, the present cumulative data define some of the in vivo roles of PC5/6 and PCSK9 in cancer and should enhance our appreciation of the physiological impact of PC inhibition. / Le cancer est à l'origine d'environ 20% des décès dans le monde occidental. En 2008, près de 12,7 millions de nouveaux cas et 7,6 millions de décès sont survenus dans le monde. Le développement du cancer est un processus multi-étapes, au cours duquel les cellules acquièrent des mutations qui mènent à une croissance cellulaire incontrôlée, l'échappement à la mort cellulaire, l'angiogenèse, l'invasion des tissus environnants et, finalement, la propagation des tumeurs à d'autres parties du corps. Les proprotéines convertases (PC) constituent une famille de neuf sérine-protéases sécrétoires similaires à la subtilisine bactérienne et à la kexine de levure. Dès le début des années 1990, il a été montré que les PC contrôlent l'activation de facteurs clés dans presque toutes les étapes du développent du cancer. Les sept premiers membres de la famille des PC (PC1, PC2, furin, PC4, PC5/6, PACE4 et PC7) activent, et moins fréquemment inactivent, des hormones, des facteurs de croissance, des récepteurs, des molécules d'adhésion, des facteurs angiogéniques, ou encore des métalloproteases, qui peuvent être impliqués dans la progression du cancer. Le dernier membre de cette famille, la proprotéine convertase de type subtilisine/kexin 9 (PCSK9), participe au maintien de l'homéostasie du cholestérol. Ce dernier a été lié à la fois positivement et négativement au dévelopement de cancers.Au cours de mon travail de thèse, je me suis concentrée sur le rôle de deux PC, PC5/6 et PCSK9, dans le développement du cancer. J'ai d'abord montré que l'expression de PC5/6 est systématiquement diminuée dans les tumeurs intestinales chez l'homme et chez la souris. Chez les souris ApcMin/+, modèle du cancer du côlon, qui développent de nombreux adénocarcinomes le long de l'intestin, l'absence de PC5/6 spécifiquement dans l'intestin et le côlon conduit à un plus grand nombre de tumeurs, en particulier dans le duodénum. Ceci suggère que PC5/6 ait un rôle protecteur contre la tumorigenèse dans l'intestin. Cependant, PC5/6 a été montré favoriser la progression de tumeurs dans d'autres types de cancers, par exemple le cancer du cerveau et de la peau. J'ai ensuite mis en évidence l'existence de deux inhibiteurs naturels de PC5/6 : les «latent TGFbeta binding proteins -2 et -3» (LTBP-2 et -3). Ils réduient l'activité enzymatique de PC5/6A ainsi que sa disponibilité en séquestrant le zymogène dans la matrice extracellulaire. Enfin, j'ai également démontré qu'une déficience en PCSK9 conduit à plus de métastases hépatiques, induites par injection de cellules mélanocytaires. Cet effet protecteur est dû aux faibles taux de cholestérol associé à la perte de PCSK9 et à une mort cellulaire programmée accrue dans le foie injecté ainsi que dans les métastases chez les souris n'exprimant pas PCSK9.En résumé, ces travaux définissent le rôle des PC5/6 et PCSK9 dans le cancer in vivo et nous aident à évaluer l'impact physiologique potentiel de l'inhibition des PC.

Female reproduction is limited by the oocyte pool, which establishes soon after birth in the mouse. It is dogma that more than half of the initial oocyte population is eliminated during the first meiotic prophase progression in fetal life. Apoptosis has been proposed as a mechanism for this oocyte loss; however, its pathway remains to be clarified. The mitochondrial apoptotic pathway is mediated by initiator caspase 9, which in turn activates effector caspase 3, 6, or 7 leading to cell death. The purpose of my study is to investigate the role of caspase 9 in the loss of oocytes during meiotic prophase progression. We first examined the activation of various caspases by immunofluorescence (IF) staining of cleaved caspases in ovarian sections. The results showed that both caspase 9 and 7 were constitutively activated in oocytes in the meiotic prophase. We then examined Casp9 deficient mice. Casp9 +/- mutants were crossed and ovaries were isolated from female progeny at 16.5-19.5 days postcoitum (dpc). The ratio of Casp9 -/- females drastically decreased during this period, confirming the perinatal lethality of caspase 9 deficiency. The total number of germ cells, identified by IF staining of GCNA1, in dissociated cells of Casp -/- ovaries were comparable to those in control ovaries at 16.5 dpc but became twice as large than those in +/+ or +/- ovaries at 19.5 dpc. Meiotic prophase progression, assessed by IF staining of synaptonemal complex components, was similar in all genotypes. IF staining of GCNA1 and γH2AX, a marker of double strand breaks, showed that the excessive numbers of oocytes were accumulated at the end of meiotic prophase in the Casp -/- ovary. Our results suggest that caspase 9 plays an essential role leading to oocyte loss and a block of caspase 9 dependent apoptotic pathway allows for a greater number of oocytes to survive and progress through the meiotic prophase / La reproduction chez les femelles est limitée par le pool d'ovocytes qui est établi peu après la naissance chez la souris. Il est considéré comme un dogme que la moitié de la population initiale d'ovocytes est éliminée durant la vie fœtale pendant la première progression de la prophase méiotique. L'apoptose a été proposée comme mécanisme expliquant la perte de ces ovocytes, mais ceci reste à être clarifié. La voie apoptotique mitochondriale est médiée par la caspase 9 initiatrice, qui active à son tour les caspases effectrices 3, 6 ou 7, amenant à la mort cellulaire. Le but du projet était d'étudier le rôle de la caspase 9 dans la perte des ovocytes pendant la progression de la prophase méiotique. Premièrement, nous avons étudié par immunofluorescence (IF) l'activation de différentes caspases en marquant des caspases clivées dans des sections de tissus ovariens. Les résultats ont montré que les caspases 9 et 7 sont activées de manière constitutive dans les ovocytes durant la prophase méiotique. Par la suite, nous avons étudié des souris déficientes pour Casp9. Des souris mutantes Casp9 +/- ont été croisées, puis les ovaires des femelles de la progéniture ont été isolés aux jours 16,5-19,5 post-coïtum. Le ratio de femelles Casp9 -/- a drastiquement diminué pendant cette période, confirmant la mortalité périnatale lorsqu'il y a une déficience de caspase 9. Le nombre total de cellules germinales dans des cellules dissociées d'ovaires de souris Casp9 -/-, identifiées par IF en marquant GCNA1, était comparable au contrôle des ovaires au jour 16,5 post- coïtum mais a augmenté deux fois chez les ovaires de souris +/+ ou +/- au jour 19.5 post-coïtum. La progression de la prophase méiotique, telle qu'observée par IF en marquant les composantes de complexe synaptonemale, était similaire dans tous les génotypes. Le marquage par IF de GCNA1 et H2AX, un marqueur de bris doubles brins de l'ADN, a démontré que le nombre excessif d'ovocytes est accumulé à la fin de la prophase méiotique dans les ovaires des souris -/-.Nos résultats suggèrent que la caspase 9 joue un rôle essentiel amenant à la perte des ovocytes et le blocage de la voie apoptotique dépendante à la caspase 9 permet la survie d'un nombre plus important d'ovocytes qui progresseront dans la prophase méiotique I.