Visceral glomerular epithelial cells (GEC), also known as podocytes, are essential components of the kidney glomerulus, and play a pivotal role in maintaining normal glomerular permselectivity. The regulation of the actin cytoskeleton is central to podocyte morphology and function. In the rat model of membranous nephropathy, passive Heymann nephritis (PHN), heterologous antibody binds to GEC antigens. Following immune complex formation the complement system is activated with the assembly of the C5b-9 membrane attack complex. In GEC, C5b-9 induces sublytic injury associated with morphological changes and proteinuria. We have previously reported that complement activates RhoA, member of the Rho family of small GTPases, in vitro and in vivo. The current study addresses the role of GEF-H1, a Rho GEF protein, in complement-mediated RhoA activation in GEC injury. In glomeruli from rats with PHN and cultured GEC, complement stimulation increased GEF-H1 activity, in a parallel fashion with RhoA activation. Activation of GEF-H1 by complement was at least partially dependent on the extracellular signal-regulated kinases (ERK) pathway, but not on the epidermal growth factor (EGF) receptor, or Src-family kinases, or microtubules. To address the functional effects of GEF-H1, GEC were transduced with lentivirus-mediated shRNA of GEF-H1, to knockdown the expression. GEC transduced with shRNA of GEF-H1 significantly blocked RhoA activation and augmented cytotoxicity in response to complement stimulation, implicating a cytoprotective effect of GEF-H1 on GEC in complement-mediated injury. / Les cellules glomérulaires épithéliales viscérales (CGE), ou podocytes, sont des composantes essentielles du glomérule du rein, et jouent un rôle important dans le maintien de la permsélectivité glomérulaire. La régulation du cytosquelette d'actine est à la base du fonctionnement normal du podocyte, ainsi qu'à sa morphologie. Dans le modèle de rat de la néphropathie membraneuse, passive Heymann nephritis (PHN), les anticorps hétérologues se lient aux antigènes des podocytes. Après formation de complexes immuns, le système du complément est activé avec l'assemblage du complexe d'attaque membranaire C5b-9. Dans les CGE, C5b-9 induit des effets sublytiques associés à des modifications morphologiques et à la protéinurie. Nous avons déjà signalé que le complément active RhoA, membre de la famille Rho des petites GTPases, in vitro et in vivo. La présente étude porte sur le rôle de GEF-H1, une protéine de la famille des Rho GEF, dans l'activation de RhoA dans les CGE méditée par le complément. Dans les glomérules de rats avec PHN et dans les CGE cultivés in vitro, la stimulation du complément a augmenté l'activité de GEF-H1, d'une façon parallèle avec l'activation de RhoA. L'activation du GEF-H1 par le complément a été au moins partiellement dépendante de l'extracellular signal-regulated kinase (ERK), mais pas du facteur de croissance épidermique (EGF), de la famille des kinases Src, ou des microtubules. Pour faire face aux effets fonctionnels de GEF-H1, CGE ont été infectées par des lentivirus contenants un petit ARN en épingle à cheveu, pour réduire l'expression de GEF-H1. Les CGE infectées par les lentivirus ont bloqué de manière significative l'activation de RhoA et ont augmenté la toxicité en réponse à la stimulation du complément, impliquant un effet protecteur de GEF-H1 sur les CGE.

Spliced-leader (SL) trans-splicing is a splicesomal process by which the 5'-ends of diverse mRNAs are replaced by a common sequence originating from a specialized SL donor RNA. The patchy phylogenetic distribution of SL trans-splicing, including its recent discovery in the deuterostomes in the tunicate Ciona intestinalis presents two equally possible evolutionary histories. Either it is an ancestral eukaryotic trait that has been lost in multiple lineages, or, it was invented de novo in various lineages including the tunicates. SL trans-splicing has a known function in the resolution of polycistronic operons. However, for monocistronic transcripts there are many proposed but not substantiated functions, including the 5'-untranslated region (5'-UTR) sanitization hypothesis. I investigated the phylogenetic distribution of SL trans-splicing in the deuterostomes and its possible function as a 5'-UTR sanitization mechanism in the monocistronic troponin I gene (CiTnI) in Ciona. I produced oligo-capped 5'-RACE cDNA libraries to survey mRNA 5'-end sequences for common candidate SL sequences in the cephalochordate Branchiostoma, the hemichordate Saccoglossus and the echinoderm Strongylocentrotus. Following steps taken to eliminate short primer-related sequences created during the 5' oligo-capping reaction, and apparently hidden in the form of heteroduplex complexes, the cDNA libraries were subjected to 454 ultra high-throughput sequencing. Several indicators, including the presence of 5'-TOP sequences at the 5'-termini of mRNAs encoding ribosomal proteins and translation factors showed that the 5'-RACE libraries effectively represented the extreme 5'-termini of mRNAs. No common 5'-ends that could represent SL sequences were observed in any of the species examined. This result strongly supports the independent evolution of SL trans-splicing in the tunicates. To further examine the postulated functional role of SL trans-splicing in removing deleterious sequences from the 5'-UTR, I made and used an internal transfection control construct to validate the observation, previously made in our lab, that an experimental CiTnI reporter construct with a long retained-outron 5'-UTR showed low reporter gene activity when electroporated in Ciona embryos. I then created a new CiTnI construct to directly assess the possible presence of a specific deleterious element in the long retained-outron 5'-UTR. My results clearly indicated that there is no specific deleterious element, but that it is the length of the retained-outron 5'-UTR, per se, that leads to low TnI reporter construct expression. / Le “spliced-leader” (SL) trans-épissage est un processus dépendant du spliceseome dont l'éxtremité 5' de divers ARNms sont remplacés par une séquence commune dérivant d'un SL ARN donneur spécialisé. À cause de sa répartition phylogénétique compliquée et sa découverte récente dans le tunicier Ciona intestinalis, un deutérostomiens, il existe deux possibilités d'évolution plausible pour le SL trans-épissage. Le SL trans-épissage est soit; un caractère ancestral qui s'est perdu plusieurs fois dans différentes lignées où il s'est inventé de novo dans différentes lignées, y compris les tuniciers. Une des fonctions connues du SL trans-épissage est la résolution de transcrits polycistroniques, cependant sa fonction concernant les transcrits monocistroniques est moins évidente. Il existe plusieurs hypothèses en ce qui concerne la fonction du SL trans-épissage de gènes monocistroniques, une d'entre-elles est l'assainissement des régions 5' non-traduit (5'-UTR). Mes travaux de recherche ont portés sur la répartition phylogénétique de SL trans-épissage dans les deutérostomiens et sa fonction en tant d'assainissement de la région 5' non-traduite pour le gène troponine I (CiTnI) de Ciona. J'ai créé des banques d'ADNc 5'-RACE coiffés d'oligonucleotide pour bien étudier les séquences à l'extrémité 5' de différents ARNms et ainsi découvrir un motif SL commun dans le Branchiostoma céphalochordé, le Saccoglossus hemichordate et le Strongylocentrotus échinodermes. Après avoir éliminé les courtes séquences reliées à l'amorce qui se sont crée au cours de la réaction de coiffe des ARNs et qui étaient apparemment cachées sous forme de complexes hétéroduplexes, les banques d'ADNc ont été soumises au séquençage 454 ultra à haut débit. La présence des séquences 5'-TOP sur les ARNms des proteines ribosomique et gènes de facteurs de traduction était un des indicateurs confirmant que les banques comprenaient des extrémités 5' de ARNm de qualité. Des extrémités 5' en communs, qui pourraient représenter des séquences SL, n'ont pas été observées dans les organismes examinés. Ce résultat appuie fortement l'évolution indépendante de SL trans-épissage dans les tuniciers.Pour examiner davantage le rôle d'élimination des séquences néfastes de la 5'-UTR postulé pour le SL trans-épissage, j'ai produit et utilisé un contrôle interne de transfection. Ce contrôle a été construit afin de valider des résultats obtenus il y a quelques années dans notre laboratoire, qu'un rapporteur expérimental de CiTnI qui contient un outron-5'-UTR non-épissé a une faible activité du gène rapporteur lorsqu'électroporé dans des embryons de Ciona. Ensuite, j'ai créé un nouveau rapporteur CiTnI pour évaluer la présence possible d'un élément néfaste dans la séquence du 5'-UTR. Mes résultats indiquent qu'il n'y a aucun élément néfaste spécifique, mais que la longueur du outron-5'-UTR retenu, en soi, mène à la faible expression du rapporteur TnI.

MCLK1 (a.k.a. COQ7) is an evolutionarily conserved mitochondrial hydroxylase necessary ubiquinone biosynthesis. Mclk1+/- mice display a 50% reduction in this protein, as well as an array of phenotypes including increased longevity, decreased ubiquinone in the inner mitochondrial membrane, decreased mitochondrial respiration, and increased mitochondrial oxidative stress. We report here by various measures that Mclk1+/- mutants also exhibit an enhanced immune response in vivo. That is, Mclk1+/- mice mount a more extreme inflammatory response to bacterial lipopolysaccharide stimulation and bacterial infection, evidenced by increased measures of plasma cytokine levels. These mice also demonstrate resilience to tumour development, evidenced by a prolonged, dose-dependent delay in tumour onset following tumour cell xenograft. Furthermore, we report that Mclk1+/- mice react differently than wild-type mice following rapamycin injection. That is, circulating cytokine levels are attenuated in mutants but increased in wild-type mice following rapamycin administration. Despite their more extreme immune response, we demonstrate that Mclk1+/- mutants sustain less tissue damage as a result of infection or old age. Finally, using mouse models of high mitochondrial or cytoplasmic oxidative stress, we report that the Mclk1+/- phenotype is not simply due to increased reactive oxygen species in the mitochondria. These findings suggest characteristics that may contribute to the increased lifespan of these mice, though the causes of these characteristics require further investigation. / MCLK1 (COQ7) est une enzyme hydroxylase conservée au cours de l'évolution et nécessaire pour la biosynthèse de l'ubiquinone. Les souris Mclk1+/- présentent une réduction de 50% du niveau de cette protéine, ainsi qu'une gamme de phénotypes, tels qu'un accroissement de la longévité, une réduction de la quantité d'ubiquinone dans la membrane interne mitochondriale, une réduction de la respiration mitochondriale, et une augmentation du stress oxydatif mitochondrial. Différentes mesures ont démontrées que les souris Mclk1+/- arborent également une meilleure réponse immunitaire suite à la stimulation par des lipopolysaccharides bactériens (LPS) ainsi que par l'infection bactérienne, comme en témoigne une augmentation du niveau de plusieurs cytokines plasmatiques en réponse à ces stimulations. Les mutants Mclk1+/- sont aussi plus résistants au développement de tumeurs, comme en témoigne le délai dans l'apparition de tumeurs après une xénogreffe de cellules tumorales. En outre, nous avons découvert que les souris Mclk1+/- réagissent différemment par rapport aux souris de type sauvage à un traitement avec la rapamycine. Nous avons observé que suite à l'administration prolongée de rapamycine suivi par une injection de LPS, le niveau de cytokines circulantes diminue chez les souris mutantes alors que chez les souris de type sauvage ce niveau augmente. Malgré leur réponse immunitaire plus intense, nous avons démontré que les souris Mclk1+/- subissent moins de dommages tissulaires à la suite d'une infection ou du processus de vieillissement. Enfin, en utilisant des modèles murins de stress oxydatif mitochondrial ou cytoplasmique augmenté, nous avons aussi établi que le phénotype Mclk1+/- ne résulte pas simplement de l'augmentation des radicaux libres dans les mitochondries.

One of the major challenges facing cancer therapy today is the resistance to radiation and chemotherapy that some tumor cells exhibit. Our study was aimed at exploring the role of CUX1 in resistance to both radiation and chemotherapy. CUX1 is a metazoan transcription factor which is cleaved by cathepsin L from its p200 full-length form into the p110 isoform during the G1/S phase transition, thus allowing transcriptional activation of genes involved in cell cycle progression and DNA replication. Overexpression of p110 CUX1, as seen in many tumors and cancer cell lines, is known to accelerate cell proliferation by shortening the G1 phase of the cell cycle. We first investigated whether a relationship existed between the CUX1 and RAS oncogenes in the context of radioresistance. Expression of constitutively activated RAS has been shown to promote radioresistance in many cell lines. Previous results from our laboratory have demonstrated a correlation between RAS activation and upregulation of p110 CUX1. Throughout this study, we have shown that overexpression of p110 CUX1 leads to radioresistance whereas knockdown of CUX1 sensitizes cells to radiation therapy. It has been documented that RAS activation stimulates production of short nuclear cathepsin L and production of p110 CUX1. In line with this, we have demonstrated that inhibition of cathepsin L causes a reduction in p110 CUX1 levels and concomitantly sensitizes cells to radiation therapy. As such, we hypothesize that there is interplay between RAS, cathepsin L and CUX1 leading to radioresistance. In parallel to this, CUX1 has been linked to DNA damage response via transcriptional activation of several genes enabling cells to mount an efficient response to DNA damage. We have shown that compromising the DNA binding activity of p110 CUX1 in the presence of radiation, a potent source of DNA damage, causes decreased clonogenic survival. We have also shown that compromising the DNA binding activity of p110 CUX1 impairs recruitment of Ku80 to DNA, thus suggesting a direct role for CUX1 in Non-Homologous End Joining (NHEJ) DNA repair. During the second part of our study, we investigated whether CUX1 plays a role in resistance to chemotherapy. We found that overexpression of p110 CUX1 increases resistance to chemotherapeutic drugs affecting microtubule dynamics such as Paclitaxel and Vincristine. Conversely, knockdown of CUX1 was shown to promote sensitivity to the aforementioned drugs. RAS-transformed cells are known to exhibit heightened mitotic stress and CUX1 knockdown was found to be synthetic lethal for RAS-transformed cells. We have found that knockdown of CUX1 selectively over-sensitizes RAS cells to chemotherapeutic drugs affecting microtubule dynamics, thus suggesting that CUX1 helps alleviate mitotic stress exhibited by RAS-transformed cells. / L'un des défis majeurs auquel est confronté le traitement du cancer aujourd'hui est la résistance à la radiothérapie et la chimiothérapie de certaines cellules tumorales. Notre étude visait à explorer le rôle de CUX1 dans la résistance à la radiothérapie et la chimiothérapie. CUX1 est un facteur de transcription métazoaire qui est clivé pendant la transition de phase G1/S par la cathepsine L à partir de sa forme pleine longueur p200 pour générer l' isoforme p110. p110 CUX1 permet l'activation transcriptionnelle de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire et de la réplication d'ADN. La surexpression de p110 CUX1, observée dans de nombreuses tumeurs et lignées cellulaires cancéreuses, stimule la prolifération cellulaire en raccourcissant la phase G1 du cycle cellulaire. Nous avons d'abord cherché à connaître si une relation existait entre les oncogènes CUX1 et RAS dans le contexte de la radiorésistance. Il a été démontré que l'expression constitutive de RAS promouvoit la radiorésistance dans de nombreuses lignées cellulaires. De plus, certains résultats antérieurs provenant de notre laboratoire ont démontré une corrélation entre l'activation de RAS et l'augmentation de p110 CUX1. À travers cette étude, nous avons démontré que la surexpression de p110 CUX1 conduit à la radiorésistance alors qu'une diminution dans l'expression de CUX1 sensibilise les cellules à la radiothérapie. Il a été démontré que l'activation de RAS stimule la production de la cathepsine L nucléaire ainsi que celle de p110 CUX1. Nous avons démontré que l'inhibition de la cathepsine L entraîne une réduction des niveaux de p110 CUX1 et sensibilise les cellules à la radiothérapie. De ce fait, nous émettons l'hypothèse qu'il existe un mécanisme reliant RAS, la cathepsine L et CUX1 conduisant à la radiorésistance. En parallèle à cela, CUX1 a été lié à la réponse du dommage à l'ADN à travers l'activation transcriptionnelle de plusieurs gènes permettant aux cellules de monter une réponse efficace aux dommages à l'ADN. Nous avons démontré que compromettre l'activité de liaison à l'ADN de p110 CUX1 en présence de radiation, une puissante source de dommages à l'ADN, entraîne une diminution de la survie cellulaire. Nous avons également démontré que compromettre l'activité de liaison à l'ADN de p110 CUX1 prévient le recrutement de Ku80 à l'ADN, suggérant ainsi la possibilité que CUX1 puisse jouer un rôle direct dans le mécanisme de réparation de l'ADN de type « NHEJ ». Au cours de la deuxième partie de notre étude, nous avons examiné si CUX1 pouvait jouer un rôle dans la chimiothérapie. Nous avons trouvé que la surexpression de p110 CUX1 augmente la résistance aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le paclitaxel et la vincristine qui affectent la dynamique des microtubules. De même, une réduction de CUX1 semble favoriser la sensibilité aux médicaments mentionnés ci-dessus. Il a été démontré que les cellules contenant RAS constitutivement activé contiennent non seulement un niveau de stress mitotique élevé, mais possèdent aussi CUX1 comme cible synthétique létale. Nous avons constaté qu'une réduction de CUX1 résulte en une sensibilisation séléctive des cellules surexprimant RAS envers les médicaments chimiothérapeutiques affectant la dynamique des microtubules. Ainsi, ceci suggère que CUX1 aide à soulager le stress mitotique subit par les cellules RAS.

RPTP_Sigma, RPTP_Delta and RPTP_Lar are the three members of the LAR_RPTPs family. These members share similar structures and superposed expression patterns in different tissues. Although they are key players in different cellular functions their role in embryonic development is little known. We show that RPTP_Sigma, RPTP_Delta and RPTP_Lar are redundant in the heart and liver. Triple mutant (SDLKO) embryos show lethality starting with E12.5 and have defect in erythrocytes maturation translated by a delay in erythroblasts enucleation and persistent truncus arteriosus that leads to a failure in separation of aorta from pulmonary artery. / RPTP_Sigma, RPTP_Delta et RPTP_Lar sont trois membres de la famille des LAR_RPTPs. Ces membres partagent un patron d'expression dans différents tissus et des structures similaires. Malgré le fait qu'ils sont des acteurs important de différentes fonctions cellulaires, leur rôle dans le développement embryonnaire reste mal compris. Nos résultats montrent que RPTP_Sigma, RPTP_Delta et RPTP_Lar agissent de façon redondante dans le cœur et le foie. Les embryons triple mutants (SDLKO) commencent à présenter une létalité à partir E12.5 et un défaut dans la maturation des érythrocytes se traduisant par un délai d'énucléation des érythroblastes. De plus, ces embryons montrent un truncus arteriosus persistant causant un défaut dans la séparation entre l'aorte et l'artère pulmonaire.

Cells, and in fact all living organisms, are capable of responding to stimuli. Regardless of the source and purpose of the signal, when responding to varying factors, complex mechanisms ensure tight regulation of cellular processes. This is particularly true during cellular response to stress. Depending on the severity of a stress stimulus, cells may attempt to cope with and overcome the assault, or they may opt for an organized suicide, in the face of too potent a signal. To provide a tight control over cellular survival and death, numerous protein factors promote or inhibit apoptotic cell death. Intriguingly, not only does the mRNA-binding protein HuR contribute to regulating the expression of pro- and anti-apoptotic factors, but we previously discovered that in response to lethal stress, HuR is cleaved by active caspases, and that this event enhances apoptotic cell death. Given the broad spectrum of mRNAs regulated by HuR, and the well-documented overexpression of this protein in cancer development, we aimed to characterize the caspase-mediated cleavage of HuR and its implication in apoptotic progression. In doing so, we first delineated the signalling cascade that enables stress stimuli to trigger the cleavage of HuR, and confirmed that the HuR cleavage products (HuR-CPs) are capable of inducing apoptosis in non-lethal conditions. Furthermore, we clarified how one of these HuR-CPs, HuR-CP1, can further promote the cleavage of HuR. This is done by competitively binding to the HuR nuclear import factor TRN2, thus causing full-length HuR to accumulate in the cytoplasm, as has been reported to occur during apoptosis. Finally, we obtained data suggesting that the HuR-CPs may coordinate a post-transcriptional regulatory program that is distinct from that of full-length HuR. The HuR-CPs bind and stabilize the mRNA of the pro-apoptotic caspase-9 to a greater extent than does full-length HuR, and bind to a lesser degree to the HuR mRNA target Prothymosin α, which encodes an anti-apoptotic regulator of cell death. Collectively, our findings have revealed the mechanism by which HuR switches its function from promoting cell survival in normal and non-lethal conditions, to becoming a promoter of apoptotic cell death in response to lethal stress. Mechanistically, this occurs via the cleavage of HuR, through particular signalling pathways. The two HuR-CPs that are generated may exercise different functions to mediate altered post-transcriptional regulatory events, thus enhancing the progress of apoptosis. Beyond extensively characterizing the cleavage of HuR, this cumulative work brings to light previously undiscovered mechanisms of regulation of gene expression, particularly during the strictly-controlled process of cell stress response. / Les cellules, ainsi que tous les êtres vivants sont capables de réagir à des stimuli. Quelque soit la source et le rôle de ces signaux, les mécanismes d'action en réponse à ces stimuli sont fortement régulés au sein de la cellule. Ceci s'avère particulièrement vrai en réponse à des stress puisque leur intensité détermine la réponse cellulaire. En effet, les cellules peuvent décider de continuer à vivre, en s'adaptant à cet assaut, ou bien elles peuvent décider d'induire leur mort si le stress est trop fort. Pour bien contrôler la balance entre la survie et la mort, plusieurs protéines activent ou inhibent la mort cellulaire par l'apoptose. Notamment, la protéine HuR, qui s'associe avec des ARN messagers (ARNms), peut réguler l'expression de facteurs activateurs et inhibiteurs de l'apoptose. De plus, nous avons découvert que de forts stress induisent un clivage de HuR par des caspases activées ainsi que l'apoptose. Malgré l'implication de HuR dans l'apoptose, ses niveaux d'expression sont élevés durant le développement de certains cancers et permettent la régulation de l'expression de divers ARNms. Nous nous sommes donc posés comme objectif de caractériser le clivage de HuR et son rôle dans l'apoptose. Premièrement, nous avons déterminé la cascade de signaux induisant le clivage de HuR. En même temps, nous avons confirmé que les produits de clivage de HuR (HuR-CPs) sont capables d'induire l'apoptose dans des conditions non toxiques. Deuxièmement, nous avons découvert comment un de ces produits de clivage, HuR-CP1, peut augmenter le clivage propre de HuR. HuR-CP1 accompli ceci en s'associant compétitivement avec le facteur TRN2, qui régule l'import nucléaire de HuR, causant ainsi une augmentation du niveau de HuR non-clivé dans le cytoplasme, comme déjà constaté durant l'apoptose. Finalement, nous avons obtenu des résultats qui suggèrent que les HuR-CPs peuvent coordonner un programme de régulation au niveau post-transcriptionel différent de celui effectué par HuR. Les produits de clivage de HuR s'associent et stabilisent l'ARNm du facteur apoptique caspase-9 plus fortement que HuR non-clivé, et ils s'associent moins fortement que HuR avec l'ARNm de Prothymosin α, qui code un facteur de survie. En résumé, nos découvertes ont dévoilé le mécanisme par lequel la fonction de HuR transite entre activateur de la survie cellulaire dans des conditions normales et non-toxiques, et inducteur de l'apoptose suite à un signal toxique. Ceci est dû au clivage de HuR induit par des voies de signalisations spécifiques. Les deux HuR-CPs qui sont produits ont des effets différents de HuR pour influencer la régulation post-transcriptionel, et en conséquence, peuvent promouvoir l'apoptose. Nos travaux ont non seulement caractérisé le clivage de HuR, mais nous avons découvert un nouveau mécanisme de régulation d'expression génétique, spécifiquement durant la réponse cellulaire aux stress.

Retinoblastoma (RB) is a tumour-suppressing protein involved in many cellular functions including: cell cycle regulation, cellular differentiation and cell death. In the past, its function has been intrinsically linked to its role in the cell cycle, wherein it acts as a key regulator of the G1 to S-phase transition checkpoint. However, evidence has emerged in support of cell cycle-independent roles for RB. In particular, it has been demonstrated that RB plays an important role in promoting normal animal development and survival to adulthood, a function that is conserved between mammals and metazoans. This role has been extensively studied using RBF1, the Drosophila melanogaster homolog of mammalian RB. An outstanding question in this field is whether or not the mutation of RB results in tissue-specific biological outcomes that ultimately affect adult viability. The results of this research thesis suggest that the mutation RBF1 can lead to tissue-specific developmental defects; however, the defects observed did not affect the ability of animals in surviving to adulthood. For example, a male germline-specific phenotype was observed when RBF1 expression was absent from germ cells. Adult male flies in which RBF1 expression was absent from the germline were sterile. Upon closer inspection, changes in germ cell number and patterning in the testes were observed. As well, an increase in cyclin E expression in RBF1-null mutants suggested that germ cells were being arrested at an early stage of spermatogenesis. A role for RBF1 in the fly germline has not been previously investigated. Therefore, this research project has identified a novel function of RBF1 with respect to germline regulation. Additionally, this research thesis also aimed to investigate whether RB interacted with a subset of known RB-associating factors in a tissue-specific manner. While this question was not completely addressed by the research presented herein, phosphorylation of Serine 728 on RBF1 was detected in vivo. This site was previously investigated in vitro and was suggested to be a putative phosphorylation target by cyclin/Cdk complexes. Therefore, the data of this research thesis have demonstrated the potential for this site to be phosphorylated in vivo. Further experimentation is required in order to verify the authenticity of this site as an endogenous target of phosphorylation. Overall, the data presented in this research thesis provide new insight into the various roles of RBF1 and the manner in which it is regulated. / Le rétinoblastome (RB) est une protéine classifiée comme suppresseur de tumeur. Elle joue plusieurs rôles importants dans la cellule, incluant: la régulation du cycle cellulaire, la différentiation cellulaire et l'apoptose. Dès sa découverte, le rétinoblastome a été caractérisé par son rôle primaire en règlant le cycle cellulaire dans lequel RB fonctionne comme régulateur de la transition entre la phase G1 et la phase S. Depuis ce temps, d'autres rôles pour RB indépendents de son fonctionnement dans le cycle cellulaire ont été identifiés. Notamment, il a été démontré que RB joue un rôle important dans la promotion de processus de dévelopement normal dans l'animal et la survie jusqu'à l'âge d'adulte. La plupart des recherches concentrant sur ce rôle ont été faites en utilisant la Drosophile, une espèce modèle qui convient à la manipulation génétique et en laquelle l'homologue de RB se nomme RBF1.Il reste plusieurs questions à rechercher à propos du rôle de RBF1 concernant la survie de l'animal jusqu'à l'âge d'adulte. Cette thèse essaie de répondre à la question suivante; est-ce que les effets biologiques résultant de mutater RBF1 sont spécifiques à des tissus particuliers, et est-ce qu'ils ont un effet sur l'abilité de la Drosophila de survivre jusqu'au stage d'adulte? Les résultats de cette thèse indiquent qu'en mutant RBF1, il est possible de produire des effets biologiques unique dans des tissus spécifiques. Quand même, aucun de ces effets ont affecté la survie de l'animal. Par example, il a été démontré que RBF1 joue un rôle unique dans le tissu gonade des mâles. Dans des Drosophiles qui n'expriment pas RBF1 dans les cellules de la lignée germinale, les adultes mâles étaient stériles. En examinant les testicules, le phénotype des cellules de la lignée germinale était différent en comparaison au phenotype sauvage. Aussi, le nombre de cellules da la lignée germinale qui expriment la cycline E avait augmenté. Précédemment, il n'y avait pas d'études qui ont recherché un rôle pour RBF1 dans la lignée germinale des Drosphiles mâles; donc, les résultats de cette thèse ont démontré un rôle unique pour RBF1 en régularisant la spermatogenèse dans les Drosophiles.En plus, cette thèse essaie de répondre à une autre question liée à celle ci-haut: est-ce que RB s'associe avec des macromolécules particulières (dont il est déjà connue à faire des associations), mais d'une manière unique à chaque tissu de la Drosophile? Les données de cette thèse ne donnent pas une réponse complète à cette question, mais elles ont identifié in vivo un site de phosphorylation (Sérine 728) sur RBF1. Ce site a déjà été recherché et a été suggéré in vitro d'être une cible de phosphorylation par les complexes Cdk-cyclines. Alors, les données présentées ci-haut démontrent que Sérine 728 peut être phosphorylé in vivo aussi. Plus de recherche est requis pour vérifier si ce site est un cible authentique de phosphorylation endogène in vivo. En conclusion, les données de cette thèse démontrent de nouvelles façons de régler le fonctionnement de RBF1, et elles présentent des informations nouvelles à propos des rôles variés de RBF1 dans la Drosophile.

Histone deacetylase inhibitors (HDACi) are anti-cancer agents, which have shown promising activity in hematological malignancies. However, only a small percentage of patients initially respond to treatment and all will eventually develop resistance. HDACi are known to inhibit deacetylation of histones as well as various non-histone proteins. Revealing mechanisms of HDACi resistance will help elucidate their modes of action, as well as help overcome de novo and acquired resistance in the clinic. We chose to conduct our studies on vorinostat, which is a pan-HDACi and the first HDACi to be approved by the FDA for cancer treatment. To study HDACi resistance in hematological malignancies, we developed two vorinostat resistant cell lines from the diffuse-large B cell lymphoma (DLBCL) cell line SUDHL6 and the monocytic-like lymphoma cell line U937, which is associated with acute myeloid leukemia (AML). The resistant clones are called SUDHL6-X and U937-B8. Our lab has previously shown that these clones are also cross-resistant to other HDACi (such as LBH). However they are highly sensitive to autophagy inhibitors such as chloroquine, suggesting that elevated autophagy is necessary to maintain vorinostat resistance. Endoplasmic reticulum (ER) stress is caused by an accumulation of misfolded proteins in the ER lumen. This causes a multifaceted response that is primarily cytoprotective called the unfolded protein response (UPR). The misfolded proteins that are deemed unsalvageable by the ER are targeted for degradation by the proteasome. We found that, in addition to elevated autophagy, vorinostat resistant cells have dilated ER and an accumulation of ubiquitinated proteins compared to their parental counterparts. Moreover, they show increased sensitivity to induction of cell death by the proteasome inhibitor bortezomib. We hypothesized that activation of UPR could be a mechanism of vorinostat resistance, because the UPR induces the upregulation of pro-survival genes and may induce autophagy. Understanding vorinostat resistance holds clinical relevance in terms of improving HDACi therapy and being able to identify subsets of patients who would benefit most from combination therapy such as vorinostat with bortezomib. / Les inhibiteurs d'histones deacetylases (HDACi) ont démontré des résultats prometteurs chez des patients atteints de cancers hématologiques. Cependant, une faible proportion de patients répondent favorablement à cette thérapie et de ce nombre, la presque totalité tombera en rechute. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires menant à la résistance aux HDACi permettra de surmonter la résistance acquise en clinique et, aiderait à développer des combinatoires permettant d'augmenter leur efficacité. Afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux HDACi, nous avons développé des lignées cellulaires résistantes au vorinostat dans un modèle en culture de de lymphome diffus à grandes cellules B, les SUDHL6, et de lymphome d'apparence monocytique, les U937. Notre laboratoire a récemment démontré que ces lignées cellulaires résistantes, les SUDHL6-X et les U937-B8 sont également résistantes à plusieurs autres HDACi, tel le LBH589 (panobinostat). En contraste, ces lignées cellulaires présentent une plus grande sensibilité aux inhibiteurs d'autophagie que leurs lignées parentales respectives. L'autophagie est activée en réponse à un stress au niveau du réticulum endoplasmique (ER). Ce dernier est causée par un mauvais repliement des protéines nouvellement synthétisées, ce qui occasionne l'activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) ayant pour fonction entres autres, de diriger les protéines mal repliées vers la dégradation par le protéasome. Nous avons découvert que, les cellules résistantes au vorinostat présentent certaines caractéristiques de stress au niveau du ER dont notamment, un ER dilaté, et une accumulation considérable de protéines ubiquitinées contrairement à leur lignée parentale respective. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que l'activation de la réponse UPR est responsable de la survie des cellules résistantes. Par l'activation de gènes favorisant la survie et l'autophagie, l'activation de la réponse UPR pourrait être un mécanisme de résistance au vorinostat.

Patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) develop limb muscle atrophy partly due to proteasomal activation. Whether autophagy, a proteolysis pathway involved in organelles recycling, is also induced in limb muscles of COPD patients remains unclear. We investigate whether autophagy is induced in limb muscles of COPD patients and identify the mechanisms of initiation and maintenance of autophagy in these patients. Two studies were performed. Study 1 was aimed at counting autophagosome formation using electron microscopy in the vastus lateralis and tibialis anterior of control subjects and COPD patients. Study 2 was aimed at detecting LC3B protein lipidation (marker of autophagosome formation) and autophagy-related gene expression in the vastus lateralis of control subjects and COPD patients. Proteasome activation, oxidative stress and AKT, mTOR and AMPK pathway activation were also monitored. Autophagosome numbers were significantly greater in limb muscles of COPD patients compared to control subjects. LC3B protein lipidation and expression of autophagy-related genes in the vastus lateralis of COPD patients were significantly higher than control subjects. LC3B protein lipidation correlated negatively with thigh cross sectional areas and FEV1/FVC ratios. Autophagy induction was associated with inhibition of AKT and mTOR pathways and upregulation of AMPK and FOXO1 transcription factor expressions and with the development of oxidative stress in muscles of COPD patients. These results indicate that autophagy is significantly induced in limb muscles of COPD patients and the level of autophagy correlates with the severity of muscle atrophy and lung disease. / Les patients souffrant de la Broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) développent de l'atrophie musculaire des membres causée en partie par l'activation de la protéasome. L'implication de l'autophagie, une méthode de protéolyse utilisée pour le recyclage des organites, dans le développement de l'atrophie musculaire des patients de la BPCO n'est pas encore certaine. Nous investiguons si l'autophagie est induite dans l'atrophie musculaire des membres des patients de la BPCO et nous identifions le mécanisme de l'initiation et de la maintenance de l'autophagie dans ces patients. Deux études ont été conduites. La première étude visait à compter le nombre d'autophagosomes formés dans le vastus lateralis et le tibialis antérieur des patients contrôle et des patients de la BPCO en utilisant le microscope électronique. La deuxième étude consistait de la détection de la lipidation de la protéine LC3B (un marquer de formation d'autophagosome) et de mesuré l'expression de gènes liés a l'autophagie dans le vastus lateralis et le tibialis antérieur des patients contrôle et des patients de la BPCO. L'activation de la protéasome, le stresse oxydatif ainsi que l'activation des systèmes de l'AKT, mTOR et l'AMPK ont été surveillés. Le nombre d'autophagosome était largement augmenté dans les muscles des patients de la BPCO comparé aux contrôles. La lipidation de la protéine LC3B ainsi que l'expression des gènes de l'autophagie dans la vastus lateralis des patients de la BPCO étaient largement plus élevées comparé aux contrôles. Une corrélation inverse existe entre la lipidation de la protéine LC3B et l'aire de la section des cuisses et le rapport du FEV1/FVC (coefficient de Tiffeneau) des patients. L'induction de l'autophagie était associée avec l'inhibition des systèmes d'AKT et mTOR et l'augmentation de l'expression de l'AMPK et FOXO1. De plus, l'induction de l'autophagie correspondait avec le stress oxydatif dans les muscles des patients de la BPCO. Ces résultats indiquent que l'autophagie est induite significativement dans les muscles des membres des patients de la BPCO et que le niveau d'autophagie suit la sévérité d'atrophie des muscles et de la maladie du poumon.

Breast cancer is a heterogeneous disease, but is invariably associated with genome wide deregulation of transcription. The silencing of tumor suppressor genes (TSGs) in particular is thought to be an early, initiating event in many cancers. While re-expressing these genes is a clinically relevant goal, the development of therapeutics targeting the reactivation of TSGs has been hampered by a lack of understanding of the mechanisms responsible for TSG silencing. Recently, however, we have described a novel means through which several TSGs become silenced in cancer, which may highlight new therapeutic targets. This involves the epigenetic regulatory factor Ctcf which is critical for maintaining transcriptional activation and organizing chromatin at several TSG loci. In cells where these TSGs are silenced, the DNA binding of Ctcf to these TSGs is lost. This lack of DNA binding is associated with a loss of the post-translational modification by poly(ADP)ribosylation (known as PARylation). Aberrant dePARylation of Ctcf is associated with breast cancer progression, underscoring the importance of this Ctcf post-translational modification. We have novel data indicating that the dePARylating enzyme Parg is overexpressed in cancer. We hypothesize that inhibition of Ctcf PARylation by Parg disrupts normal epigenetic patterns at TSGs leading to subsequent gene silencing. We propose to examine the impact of Parg overexpression on the epigenetic programming and expression of Ctcf target genes, as well as the proliferation of breast epithelial cells. To determine the relevance of Parg in breast cancer, we have accumulated evidence from bioinformatics sources and through our own experimentation revealing an enrichment of Parg in a significant proportion of breast cancers. For instance, we have evidence from the Oncomine database and the UCSC Cancer Genome Browser that Parg is overexpressed at the mRNA level in 30-50% of breast cancers. Likewise, at the protein level, higher Parg expression is found in breast cancer cell lines compared to untransformed cell lines and is found to be enriched in more aggressive stages of a mouse tumor model. This is complemented with clinical breast tissue samples showing overexpression of Parg protein in breast cancer.In support of clinical data, we have generated Parg-overexpressing Mcf10a cells to assess the role of this protein in mediating cellular transformation. Interestingly, Parg overexpression induced cells to shift from an epithelial morphology to a mesenchymal one. This was met with a decrease in the rate of proliferation in vitro. The expression of the Parg transgene, however, was quickly lost and alludes to a significant role for Parg in cellular biology. Overexpression studies were complemented with drug and knockdown studies. This work illustrated that a shRNA knockdown of Parg was met with a significant decrease in cell growth. Similar results were obtained for cells treated with the Parg inhibitor, tannic acid. Use of this drug caused a decrease in the repressive histone mark H3K27me3 which we believe may restore the expression of silenced TSGs. Likewise, tannic acid induced DNA damage foci over the course of long treatments with the drug, suggesting that DNA damage, too, may contribute to the decrease in cellular proliferation observed. Ultimately, this work provides evidence for a therapeutic benefit of targeting Parg in breast cancer. / Le cancer du sein est une maladie hétérogène, invariablement associée à une perturbation de l'expression génique. Le silençage des gènes suppresseurs de tumeurs (GST) est l'un des phénomènes jouant un rôle lors de l'initiation du cancer. Si la réactivation de l'expression de ces gènes est une stratégie attractive sur le plan clinique, la mise au point de traitements efficaces a été entravée par la compréhension insuffisante des mécanismes responsables du silençage des GST. Récemment, de nouveaux mécanismes régulant le silençage des GST dans le contexte du cancer ont été décrit, ce qui pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Un des exemples concerne la protéine CTCF, un facteur essentiel au maintien de l'organisation de la chromatine et de l'activité transcriptionnelle à de nombreux loci du génome. Dans des cellules où des GST sont « silencés », la capacité de liaison de CTCF proche de ces gènes est perdue. La perte de cette liaison est due à l'abrogation d'une modification post-traductionnelle sur CTCF : la poly-(ADP)-ribosylation (aussi appelée PARylation). Selon notre hypothèse, l'inhibition de la PARylation de CTCF par l'enzyme PARG, responsable de la déPARylation, perturbe les patrons de modification épigénétiques normaux des GST, ce qui aboutit au silençage de ces gènes. Nous nous proposons d'analyser l'impact de la surexpression de PARG dans le cadre du cancer du sein sur la programmation des modifications épigénétiques et l'expression de gènes cibles de CTCF, ainsi que sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires.Dans un premier temps, nous avons recueilli des données de sources bio-informatiques et de nos propres expériences, et nous avons pu observer une surexpression de l'ARNm de PARG dans 30 à 50% des cas de cancer du sein (UCSC Cancer Genome Browser et Oncomine). De plus, les niveaux protéiques de PARG sont plus importants dans les lignées cellulaires de cancer du sein par rapport aux lignées cellulaires non transformées. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé la lignée MCF10A (immortalisée mais non transformé) pour générer une lignée cellulaire surexprimant PARG afin d'évaluer le rôle de cette protéine dans la transformation cellulaire. Nous avons pu observer que les cellules surexprimant PARG étaient passées d'une morphologie épithéliale à une morphologie mésenchymateuse, et que leurs vitesses de prolifération avaient diminué. L'expression du transgène PARG a toutefois été rapidement perdue, ce qui laisse entrevoir le rôle significatif de PARG en biologie cellulaire.Dans un troisième temps, nous avons voulu observer les effets de la perte de PARG sur des lignées de cancer du sein en utilisant soit une drogue (acide tannique : TA) soit la technique des shARNs. Par ces deux méthodes, nous avons montré que la déplétion de PARG (ou inactivation) ralentie significativement la prolifération des cellules cancéreuses. De plus, le traitement avec l'acide tannique conduit d'une part à la formation de nombreux foyers de dommages à l'ADN, et d'autre part à la diminution de la marque répressive H3K27me3, ce qui pourrait conduire à la réexpression de GST. Enfin, ce travail permet de mettre en avant le potentiel de PARG comme cible thérapeutique dans le traitement du cancer du sein.