LIM and SH3 protein 1 (LASP1) is a nucleocytoplasmic scaffolding protein. LASP1 interacts with various cytoskeletal proteins via its domain structure and is known to participate in physiological processes of cells. In the present study, a detailed investigation of the expression pattern of LASP1 protein in normal skin, melanocytic nevi and melanoma was carried out and the melanocyte–specific function of LASP1 was analyzed. LASP1 protein was identified in stratum basale of skin epidermis and a very high level was detected in nevi, the benign tumor of melanocyte. In the highly proliferative basal cells, an additional distinct nuclear localization of the protein was noted. In different tumor entities, an elevated LASP1 expression and nuclear localization, correlated positively with malignancy and tumor grade. However, LASP1 level was determined to be very low in melanoma and even reduced in metastases. Melanoma is distinguished as the first tumor tested to date – that displayed an absence of elevated LASP1 expression. In addition no significant relation was observed between LASP1 protein expression and clinicopathological parameters in melanoma. The epidermal melanin unit of skin comprises of melanocytes and keratinocytes. Melanocytes are specialized cells that synthesize the photo protective coloring pigment, melanin inside unique organelles called melanosomes. The presence of LASP1 in melanocytes is reported for the first time through this study and the existence was confirmed by immunoblotting analysis in cultured normal human epidermal melanocyte (NHEM) and in melanoma cell lines, along with the immunohistostaining imaging in normal skin and in melanocytic nevi. LASP1 depletion in MaMel2 cells revealed a moderate increase in the intracellular melanin level independently of de novo melanogenesis, pointing to a partial hindrance in melanin release. Immunofluorescence images of NHEM and MaMel2 cells visualized co-localization of LASP1 with dynamin and tyrosinase concomitant with melanosomes at the dendrite tips of the cells. Melanosome isolation experiments by sucrose density gradient centrifugation clearly demonstrated the presence of LASP1 and the melanosome specific markers tyrosinase and TRP1 in late stage melanosomes. The study identified LASP1 and dynamin as novel binding partners in melanocytes and provides first evidence for the existence of LASP1 and dynamin (a protein well–known for its involvement in vesicle formation and budding) in melanosomes. Co-localization of LASP1 and dynamin along the dendrites and at the tips of the melanocytes indicates a potential participation of the two proteins in the membrane vesicle fission at the plasma membrane. In summary, a possible involvement of LASP1 in the actin–dynamin mediated membrane fission and exocytosis of melanin laden melanosome vesicles into the extracellular matrix is suggested. / LIM und SH3 protein 1 (LASP1) ist ein nukleozytoplasmatischen Gerüstprotein. LASP1 interagiert über seine Domänenstruktur mit verschiedenen Zytoskelettproteinen und ist an physiologischen Prozessen wie Migration und Zellproliferation beteiligt. In der vorliegenden Studie wurde eine detaillierte Untersuchung des Expressionsmusters von LASP1 in normale Haut, Nävi und Melanom durchgeführt und die Melanozyten-spezifische Funktion des Proteins analysiert. LASP1 konnte durch immunhistologische Färbungen im Stratum basale der Epidermis und in hoher Konzentration in Nävi (gutartige Tumore der Melanozyten) nachgewiesen werden, während die Expression in Melanom und Metastasen sehr gering ist. Auch wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen der LASP1 Proteinexpression in Melanomen und den klinisch-pathologischen Parametern bei 58 Patienten festgestellt. Dies steht im Gegensatz zu allen bisher getesteten Tumoren (u.a. Brust, HCC und Medulloblastom), bei der eine erhöhte LASP1 Expression in den Tumoren beobachtet wurde, die mit dem Tumorgrad korrelierte. Die hochproliferativen Basalzellen der Epidermis bestehen aus Keratinozyten und Melanozyten und weisen, im Gegensatz zu Nävi und Melanomzellen, eine deutliche Kernlokalisation des LASP1 Proteins auf. Melanozyten sind spezialisierte Zellen, die das UV-Schutzfarbpigment Melanin in einzigartigen Organellen, genannt Melanosomen, synthetisieren. Die Expression von LASP1 in diesen Melanozyten konnte zum ersten Mal in dieser Studie nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzaufnahmen und Western Blots mit kultivierten normalen menschlichen epidermalen Melanozyten (NHEM) und Melanom-Zelllinien bestätigen die LASP1 Expression. Funktionelle Experimente mit LASP1 depletierten Zellen zeigen eine erhöhte Melaninkonzentration, die unabhängig von der de novo Melanogenese ist. Immunfluoreszenaufnahmen visualisieren eine Ko-Lokalisation von LASP1 mit Tyrosinase an den Melanosomen in den Zellausläufern von pigmentierten MaMel2 Zellen. Eine Auftrennung der einzelnen Melanosomenstadien durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation erlauben die Detektion von LASP1 mit Dynamin, TRP1 und Tyrosinase in späten Stadium IV Melanosomen. Die vorliegende Studie liefert den ersten Beweis für die Existenz von Dynamin (einem für die Vesikelbildung essentiellem Protein) in Melanosomen und identifiziert Dynamin als neuartigen Bindungspartner von LASP1 in Melanozyten. Die Ko-Lokalisierung LASP1 und Dynamin entlang der Dendriten und in den Spitzen der Melanozyten weist auf eine mögliche Beteiligung beider Proteine an der Melanosomen-Vesikel-Abspaltung an der Plasmamembran hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass LASP1 an der Actin-Dynamin vermittelten Exocytose von Melanin-beladenen Melanosomvesikeln in die Extrazellulärmatrix beteiligt ist.

Die Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, weckte aufgrund ihrer karnivoren Lebensweise schon sehr früh das Interesse vieler Wissenschaftler. Für karnivore Pflanzen, die auf Nährstoff-armen Böden wachsen, spielen Insekten als Beute und somit als Nährstofflieferant eine entscheidende Rolle. So können die Pflanzen durch die Verdauung der Beute mit wichtigen Makro- und Mikronährstoffen, wie Stickstoff, Phosphat, Kalium oder Natrium versorgt werden. Aus diesem Grund sollte im Rahmen meiner Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die molekularen Mechanismen der Kationenaufnahme während der Nährstoffresorption gerichtet werden. Insbesondere die aus dem Insekt stammenden Nährstoffe Kalium und Natrium waren dabei von großem Interesse. Im Allgemeinen sind Kaliumionen für Pflanzen eine essentielle anorganische Substanz und von großer physiologischer Bedeutung für die Entwicklung, den Metabolismus, die Osmoregulation, das Membranpotential und viele zelluläre Prozesse. Analysen der Kaliumaufnahme an Wurzeln von Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana und Reis zeigten, dass die Aufnahme von K+ ein Zusammenspiel von hoch-affinen K+-Transportern der HAK5-Familie und nieder-affinen Kaliumkanälen (AKT1/AtKC1) erfordert, die in ein komplexes (De-)Phosphorylierungsnetzwerk eingebunden sind. In der vorliegenden Arbeit war es mir möglich das Netzwerk zur Kaliumaufnahme in den Drüsen der Venusfliegenfalle zu entschlüsseln. Es konnten Orthologe zum Kaliumtransporter HAK5 aus Arabidopsis (DmHAK5) und zum Kaliumkanal AKT1 (DmKT1) identifiziert und im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten elektrophysiologisch charakterisiert werden. Dabei zeigte sich, das DmKT1 durch einen Ca2+-Sensor/Kinase-Komplex aus der CBL/CIPK-Familie phosphoryliert und somit aktiviert wird. Phylogenetische Analysen von DmKT1 bestätigten die Eingruppierung dieses Kaliumkanals in die Gruppe der pflanzlichen Shaker-Kaliumkanäle des AKT1-Typs. Die Transporteigenschaften zeigten zudem, dass DmKT1 bei hyperpolarisierenden Membranpotentialen aktiviert wird und einen K+-selektiven Einwärtsstrom vermittelt. In Oozyten konnte eine Kaliumaufnahme bis zu einer externen Konzentration von ≥1 mM beobachtet werden. DmKT1 repräsentiert also einen Kaliumkanal mit einer hohen Transportkapazität, der die nieder-affine Kaliumaufnahme in die Drüsenzellen der Venusfliegenfalle vermitteln kann. Unterhalb einer externen Kaliumkonzentration von 1 mM würde der anliegende elektrochemische Kaliumgradient einen Kaliumausstrom und somit einen Verlust von Kalium favorisieren. Hoch-affine K+/H+-Symporter können durch die Ausnutzung des Protonengradienten eine Kaliumaufnahme im mikromolaren Bereich gewährleisten. In Wurzelhaaren von Arabidopsis vermittelt der Transporter AtHAK5 die Kaliumaufnahme unter Kaliummangelbedingungen. DmHAK5, ein Ortholog zu AtHAK5, ist in Dionaea Drüsen exprimiert und konnte zum ersten Mal im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten im Detail charakterisiert werden. Interessanterweise zeigte sich, dass DmHAK5 wie der K+-Kanal DmKT1 durch denselben CBL/CIPK-Komplex posttranslational reguliert und aktiviert wird. Die Transporteigenschaften von DmHAK5 wiesen auf einen Transporter mit einer breiten Substratspezifität hin, sodass sich DmHAK5 neben Kalium auch für Ammonium permeabel zeigte. Affinitätsuntersuchungen von DmHAK5 zu seinem Substrat Kalium klassifizierten das Protein als einen hoch-affinen Kaliumtransporter, der im Symport mit Protonen die Kaliumaufnahme im mikromolaren Konzentrationsbereich vermitteln kann. Das Kaliumtransportmodul besteht also aus dem K+-selektiven Kanal DmKT1 und dem K+/H+-Symporter DmHAK5, die die hoch- und nieder-affine Kaliumaufnahme in den Drüsenzellen während der Beuteverdauung in Dionaea muscipula Fallen ermöglichen. Beide Transportmodule werden Kalzium-abhängig durch die Kinase CIPK23 und den Ca2+-Sensor CBL9 auf posttranslationaler Ebene reguliert. Zusammenfassend gelang es in dieser Arbeit Einblicke in die Kationenaufnahme während der Nährstoffresorptionsphase der Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, zu gewinnen. Dabei wurde klar, dass Dionaea muscipula im Laufe ihrer Evolution zu einer karnivoren Pflanze, nicht neue Transportmodule zur Nährstoffresorption aus der Beute entwickelte, sondern bekannte aus Wurzeln stammende Transportmodule umfunktionierte. Auf molekularer Ebene konnten die biophysikalischen Charakteristika der K+- und Na+-Transportproteine, sowie ihre Regulation entschlüsselt werden. Diese Erkenntnisse wurden schließlich in den Kontext des Beutefangs der Venusfliegenfalle gebracht und diskutiert. / The Venus flytrap, Dionaea muscipula, is one of the most exciting carnivorous plants. Since the time of Charles Darwin, scientists are interested in the highly specialized mechanisms, which enable Dionaea plants to grow on nutrient-poor habitats. These Dionaea plants have the possibility to catch insects and to purchase the necessary nutrients from their prey. For catching the prey, the Venus flytrap evolved morphological adaptions in form of bilobed leaf traps. Trigger hairs are arranged inside the traps and by touching these mechano-sensory organs an electrical signal spreading over the lobes leads to the fast trap-closure. By continual mechanical stimulation of the trigger hairs by the caught insect, the edges of the lobes are sealed hermetically and an “external stomach” is formed. The prey digestion starts with the secretion of lytic enzymes from the glands. These glands, which are covering the inner surface of the trap-lobes, are also responsible for the nutrient-uptake. Insects represent an important nutrient-provider for carnivorous plants. The capture of prey mainly contributes to the nutrient-supply like nitrogen, phosphorous, potassium and sodium. Within the scope of this work, my focus was on the molecular uptake mechanism of prey-derived cations, such as potassium and sodium. Potassium is an essential macronutrient for plants in general. Studies on the K+ uptake systems in roots revealed a complex potassium uptake network consisting of high-affinity uptake carriers such as HAK5 and low-affinity potassium channels such as the AKT1/AtKC1 module. In glands of Dionaea muscipula a HAK5-like potassium transporter (DmHAK5) and an orthologue of AKT1 (DmKT1) were identified within the framework of my Ph.D.-thesis. Following the heterologous expression in Xenopus laevis oocytes, electrophysiological measurements revealed that DmKT1 is activated by phosphorylation through a Ca2+-sensor-protein kinase complex of the CBL/CIPK family. Its transport properties and structural homology to the Arabidopsis AKT1 K+ channel classified DmKT1 as a member of the hyperpolarisation-activated, inwardly rectifying plant Shaker potassium channel family. Due to the electrochemical gradient for K+ ions across the gland plasma membrane, the K+ selective channel DmKT1 can acquire external K+ down to concentrations of 1 mM. Thus, the peculiar electrophysiological properties assigned the low-affinity high-capacity potassium uptake system in Dionaea gland to DmKT1. Below 1 mM, K+ fluxes reverse their direction and the plant would lose the essential macronutrient. In root hairs of Arabidopsis high-affinity transporters (HAK5) are expressed which are believed to facilitate K+ accumulation from potassium depleted soils. Interestingly an orthologue of HAK5 was shown to be expressed also in the trap lobes of Dionaea. Thus, DmHAK5 was cloned and for the first time a HAK5-like protein could be analysed in Xenopus oocytes. Interestingly, DmHAK5 K+/H+-co-transporter was post translationally activated by the same CBL/CIPK complex just like the DmKT1 Shaker channel. Compared to DmKT1, DmHAK5 is of low selectivity and against all assumptions, the transporter is permeable for and not inhibited by NH4+. A Km value of 127 μM, describes DmHAK5 as a high-affinity transporter that is apparently the only system capable of operating at micromolar K+ concentrations. To overcome the outward-directed chemical gradient at low external K+ concentrations, DmHAK5 utilises the electrochemical gradient of protons and acts as a K+/H+-co-transporter. The reported findings demonstrate the contribution of DmKT1 and DmHAK5 in the highly regulated potassium uptake network utilizing K+ from captured insects. The high-capacity of DmKT1 and the high-affinity of DmHAK5 enable Dionaea glands to acquire potassium from high to very low levels during the digestion and resorption process. Taken together, these studies elucidated the molecular origin and regulation of cation uptake during prey digestion and nutrient resorption of the Venus flytrap. For efficient potassium and sodium uptake into gland cells Dionaea muscipula co-opted root-derived transport modules and the associated regulatory components rather than inventing new uptake systems during its evolution to a carnivorous plant.

Spermiogenesis describes the differentiation of haploid germ cells into motile, fertilization-competent spermatozoa. During this fundamental transition the species-specific sperm head is formed, which necessitates profound nuclear restructuring coincident with the assembly of sperm-specific structures and chromatin compaction. In the case of the mouse, it is characterized by reshaping of the early round spermatid nucleus into an elongated sickle-shaped sperm head. This tremendous shape change requires the transduction of cytoskeletal forces onto the nuclear envelope (NE) or even further into the nuclear interior. LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) complexes might be involved in this process, due to their general function in bridging the NE and thereby physically connecting the nucleus to the peripheral cytoskeleton. LINC complexes consist of inner nuclear membrane integral SUN-domain proteins and outer nuclear membrane KASH-domain counterparts. SUN- and KASH-domain proteins are directly connected to each other within the perinuclear space, and are thus capable of transferring forces across the NE. To date, these protein complexes are known for their essential functions in nuclear migration, anchoring and positioning of the nucleus, and even for chromosome movements and the maintenance of cell polarity and nuclear shape. In this study LINC complexes were investigated with regard to their potential role in sperm head formation, in order to gain further insight into the processes occurring during spermiogenesis. To this end, the behavior and function of the testis-specific SUN4 protein was studied. The SUN-domain protein SUN4, which had received limited characterization prior to this work, was found to be exclusively expressed in haploid stages during germ cell development. In these cell stages, it specifically localized to the posterior NE at regions decorated by the manchette, a spermatid-specific structure which was previously shown to be involved in nuclear shaping. Mice deficient for SUN4 exhibited severely disorganized manchette residues and gravely misshapen sperm heads. These defects resulted in a globozoospermia-like phenotype and male mice infertility. Therefore, SUN4 was not only found to be mandatory for the correct assembly and anchorage of the manchette, but also for the correct localization of SUN3 and Nesprin1, as well as of other NE components. Interaction studies revealed that SUN4 had the potential to interact with SUN3, Nesprin1, and itself, and as such is likely to build functional LINC complexes that anchor the manchette and transfer cytoskeletal forces onto the nucleus. Taken together, the severe impact of SUN4 deficiency on the nucleocytoplasmic junction during sperm development provided direct evidence for a crucial role of SUN4 and other LINC complex components in mammalian sperm head formation and fertility. / Die Spermiogenese beschreibt die Differenzierung haploider Keimzellen zu beweglichen, fortpflanzungsfähigen Spermatozoen. Während dieses fundamentalen Entwicklungsabschnittes wird neben dem Aufbau von spermienspezifischen Strukturen und der Kompaktierung des Chromatins auch der speziesspezifische Spermienkopf geformt. Im Falle der Maus ist dies eine aktive Umformung des runden Zellkerns in einen gestreckten, sichelförmigen Spermienkopf. Eine derart gravierende Formveränderung erfordert eine Kraftweiterleitung aus dem Zytoskelett auf die Kernhülle und das Kerninnere. In diesem Zusammenhang könnten LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) Komplexe eine Rolle spielen, da ihre grundlegende Funktion darin besteht die Kernhülle zu überbrücken und somit den Kern mit dem peripheren Zytoskelett zu verbinden. LlNC Komplexe werden aus SUN und KASH Domänen Proteinen aufgebaut, welche in die innere beziehungsweise äußere Kernmembran eingelagert sind. Diese membranintegralen Proteine sind direkt miteinander verbunden, so dass sie einen Komplex bilden, der zur Kräfteübertragung geeignet ist. LINC Komplexe besitzen vielfältige Funktionen in Prozessen wie nuklearer Migration, Verankerung und Positionierung des Zellkerns, Chromosomenbewegungen und in der Aufrechterhaltung der Zellpolarität oder der Kernform. Um ein größeres Verständnis der Prozesse während der Spermiogenese zu gewinnen, wurden in dieser Studie die Funktionen von LINC Komplexen in der Spermiogenese und ihre spezifische Rolle bei der gerichteten Spermienkopf-strukturierung untersucht. Dabei wurde insbesondere das Verhalten und die Funktion des bisher wenig charakterisierten SUN Domänen Proteins SUN4 erforscht. Entsprechend der Ergebnisse dieser Studie ist SUN4 ein hodenspezifisches Protein, das ausschließlich in haploiden Keimzellen exprimiert wird. In diesen lokalisiert es in der posterioren Kernhülle, spezifisch in Regionen, an die sich die spermatidenspezifische Manschette anlagert. Dies ist eine Struktur, für die bereits gezeigt wurde, dass sie an der Verformung des Kerns beteiligt ist. SUN4 defiziente Mäuse zeigten ausschließlich Spermatiden mit stark desorganisierten Manschettenüberresten und einen gravierend verformten Spermienkopf. Insgesamt führten die Fehlbildungen zu einem globozoospermieartigen Phänotyp und männlicher Sterilität bei Mäusen. Dabei zeigte sich, dass SUN4 nicht nur zwingend erforderlich ist für den korrekten Aufbau und die Verankerung der Manschette, sondern auch für die korrekte Lokalisation von SUN3 und Nesprin1, wie auch für weitere Komponenten der posterioren Kernhülle. Interaktionsstudien zeigten, dass SUN4 sowohl mit SUN3 und Nesprin1 als auch mit sich selbst interagieren kann, vermutlich um funktionsfähige LINC Komplexe zu bilden, die die Manchette verankern und Kräfte aus dem Zytoskelett auf den Kern übertragen. Zusammenfassend zeigen die schwerwiegenden Auswirkungen auf die kernzytoplasmatische Verbindung während der Spermienentwicklung, die durch den Verlust von SUN4 entstanden, einen direkten Nachweis einer entscheidenden Rolle von SUN4 und anderen LINC-Komplex-Komponenten für die Spermienkopfentwicklung und Fertilität bei Säugetieren.

Das Cytokin Interleukin-4 (IL-4) ist ein essentieller Faktor bei der Entstehung von Sofort-Typ Allergien. Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor und die anschließende Phosphorylierung des IL-4 aktivierten Transkriptionsfaktors Stat6 ist ein Schlüsselereignis bei der allergischen Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse zur Hemmung der Stat6 vermittelten Signaltransduktion des IL-4 Rezeptors vorgestellt. Dazu wurde ein Vektorsystem etabliert, bei dem ein von dem Drosophila-Transkriptionsfaktor Antennapedia abgeleitetes 16 AS langes Peptid benutzt wird. Dieses Antennapediapeptid kann Plasmamembranen lebender Zellen energie- und rezeptorunabhängig durchqueren und dabei andere hydrophile Moleküle mittransportieren. Stat6 bindet über eine SH2 Domäne an phosphorylierte Reste von IL4Ra und bildet, nachdem es selbst phosphoryliert ist, mit anderen Stat6-Molekülen aktive Dimere. Ein aus der Stat6-Bindestelle des IL-4Ra abgeleitetes phosphoryliertes Peptid (Stat6BP) wurde mit Hilfe des Antennapediapeptids in verschiedene humane und murine Zellinien transportiert. Für Stat6BP konnte mit Hilfe von spezifischer Immunpräzipitation und Western-Blot gezeigt werden, dass es IL-4 induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von Stat6 transient hemmen kann. Durch zusätzliche Applikation des Tyrosinphosphataseinhibitors Natriumpervanadat gelang es, die hemmende Wirkung von Stat6BP zu verlängern. Unter gleichen Bedingungen konnte auch gezeigt werden, dass Stat6BP spezifisch die Aktivierung von Stat6 hemmt, da die durch IL-4 oder IL-3 induzierte Phosphorylierung des eng verwandten Stat5 völlig unbeeinträchtigt bleibt. Ferner wurde durch das Peptid die Expression eines Stat6 kontrollierten Reportergens gehemmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Rolle der Src-Typ Kinasen p56lck und p59fyn in der IL-4 Signaltransduktion in unterschiedlichen T-Zellinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivierung der beide Kinasen stark von der getesteten Zellinie abhängt. In einigen T-Zellinien aktiviert IL-4 eher p56lck, in anderen eher p59fyn. / Interleukin-4 (IL-4) is the major factor in the development of allergic diseases like hay fever or asthma. The most important cytoplasmic event following stimulation with IL-4 is the activation of the transcription factor Stat6 (signal transducer and activator of transcription 6). Stat6 binds via a single SH2 domain first to tyrosine-phosphorylated motifs in the IL-4Ra-chain, and then to another Stat6 molecule, which results in the formation of active dimers. Since Stat6 is exclusively used by the IL-4 receptor, it is a promising approach to specifically disrupt IL-4 signal- transduction by inhibiting Stat6 activation. A vector system was established for the delivery of hydrophilic agents into living cells. To this purpose, a 16 amino acid membrane-permeable peptide derived from the Drosophila transcription factor Antennapedia was used. The Antennapedia peptide has been shown to internalize into living cell in a receptor- and energy-independent manner. In this thesis it is shown that a peptide derived from the Stat6-binding region of IL-4Ra (Stat6BP) is an effective inhibitor when it is delivered into cells by coupling with the Antennapedia peptide. Stat6BP completely inhibited IL-4 dependent phosphorylation of Stat6 in different human and murine cell lines, while IL-3 and IL-4 dependent phosphorylation of Stat5 was not affected. The inhibitory effect of Stat6BP was transient, but could be prolonged by treating the cells with the phospatase inhibitor sodium pervanadate. Transcription from a reporter gene construct with a Stat6-dependent promoter was inhibited by Stat6BP as well, indicating that the peptide is a suitable inhibitor for cellular responses downstream from Stat6 phosphorylation. Another aim of this study was to investigate the role of the src-kinases p56lck and p59fyn in IL-4 signaltransduction. The results indicate, that the activation of both kinases is celline dependent. In some T-cellines p56lck was activated dominantly, in others p59fyn.

No abstract available

In der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Aquaporine aus Nicotiana tabacum und Samanea saman mit molekularbiologischen Methoden analysiert und durch heterologe Expression in Oozyten von Xenopus laevis funktionell charakterisiert. Das aus Tabak isolierte Aquaporin NtAQP1 wird am höchsten in Wurzeln exprimiert, ist trotz vorhandener Cysteine nicht quecksilbersensitiv und permeabel für Glycerin und Harnstoff. Sowohl eine Ionenleitfähigkeit, als auch eine Regulation auf Proteinebene konnten im Oozytensystem nicht nachgewiesen werden. Die Leguminose Samanea saman bewegt im Tag-/Nachtrhythmus ihre Fiederblätter und -stengel. Dieses wird durch Variieren des Turgors im Flexorgewebe von Pulvini realisiert. Während SsAQP1 in seinen Charakteristika mit NtAQP1 übereinstimmt, ist SsAQP2 quecksilbersensitiv und hoch selektiv für Wasser. Der für SsAQP2 ermittelte Permeabilitätskoeffizient war um den Faktor 10 höher als der von SsAQP1. Northern Experimente zeigten, dass SsAQP2 ausschließlich im Flexorgewebe exprimiert wird. Die Expression ist zum Zeitpunkt der Streckungsbewegung des Pulvinus um 7 Uhr am stärksten. Dagegen wurde SsAQP1 zu allen untersuchten Zeitpunkten nur schwach in Pulvini exprimiert. / Plant aquaporins from Nicotiana tabacum and Samanea saman were analysed with molecular techniques and functionally characterised by heterologous expression in Xenopus laevis oocytes. The tobacco aquaporin NtAQP1 is highly expressed in roots and flowers. Though it possesses several cysteines residues it is not sensitive to mercurials. Additionally NtAQP1 is permeable for glycerol and urea, but not for ions. A regulation on the protein level could not be detected. The leguminose Samanea saman moves its leaflets by bending or stretching of motor organs called pulvini. This turgor related movement is restricted to the flexor and accompanied by a high flow of water. While the characteristics of SsAQP1 resemble those of NtAQP1, SsAQP2 is sensitive to mercurials and highly selective for water. The calculated permeability coefficient of SsAQP2 was ten times higher than that for SsAQP1. Northern experiments revealed a high expression of SsAQP2 exclusively in the flexor tissue, when the pulvinus is stretching in the morning. In contrast, SsAQP1 is poorly expressed in pulvini.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression der Protein Phosphatase-gene TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 und STH2 analysiert. Alle fünf ausgewählten Gene kodieren für PP des PP1/PP2A-Typs. Es wurde untersucht, ob homologen PP-Isoformen individuelle Expressionsmuster zugewiesen werden konnten. Besonderes Augenmerk richtete sich dabei auf die Expression von PP-Genen in den Schließzellen von A. thaliana. In mehreren Inhibitorstudien wurde beschrieben, dass PP1/PP2A-Proteine eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion pflanzlicher Schließzellen spielen. Bisher konnte allerdings noch keine der entsprechenden katalytischen Untereinheiten auf molekularer Ebene identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass mit TOPP1 ein Protein des PP1-Typs präferenziell in den Schließzellen von A. thaliana exprimiert wird. Ein Vergleich der Genexpression von TOPP1, TOPP2 und TOPP5 zeigte für die drei homologen Gene sehr Isoform-spezifische Expressionsmuster. Dies war ein deutlicher Hinweis, dass diese eng verwandten PP trotz großer Übereinstimmung auf Aminosäureebene vermutlich unterschiedliche Funktionen in planta haben. <p> Die Untersuchung der Genexpression von STH1 und STH2 zeigte, dass die fast identischen Proteine zum Teil in unterschiedlichen Geweben vorkommen. Die Transkripte der beiden Gene, welche eine eigene Untergruppe von PP2A-verwandten Sequenzen bilden, konnten aus EF isoliert werden. Der in dieser Arbeit entwickelte Screeningansatz ermöglichte es, die sehr ähnlichen cDNA-Fragmente eindeutig voneinander zu unterscheiden. Die gefundenen Isoform-spezifischen Expressionsmuster waren ein deutlicher Hinweis auf unterschiedliche Funktionen in planta. <p> Zur weiteren Untersuchung der PP-Funktionen in planta wurden Pflanzen mit veränderter Genaktivität von TOPP2 oder STH1 untersucht. In Pflanzen mit RNAi-vermittelter Reduktion des TOPP2-Transkriptgehalts ließ sich ein deutlich verändertes Blattwachstum beobachten. Die eingerollten oder asymmetrisch entwickelten Blätter waren vermutlich ein Hinweis, dass diese PP1-Isoform auch in A. thaliana eine Rolle bei der Zellteilung spielt. Für TOPP2-Expression in Hefen wurde diese Funktion schon nachgewiesen. Die Analyse von Insertions-mutanten mit T-DNA Insertionen in beiden STH1-Allelen waren neben den Expressions-studien ein weiterer Hinweis, dass sich STH1 nicht funktionell durch STH2 ersetzen lässt. Die Experimente in dieser Arbeit zeigten, dass das Fehlen der STH1-Genaktivität zu einem deutlichen Blattphänotyp mit gezahnten Blatträndern führte. Für STH2-Insertionsmutanten wurde dieses veränderte Wachstum nicht beschrieben. <p> Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Gen NIC1, welches für ein MATE-Membranprotein kodiert, identifiziert und charakterisiert. Die Sequenzierung des Genoms von A. thaliana hatte gezeigt, dass mindestens 56 MATE-Gene in dieser Pflanze vorhanden sind. Zum Zeitpunkt der Identifikation von NIC1 war keines dieser Gene charakterisiert. Außer für das MATE-Protein ERC1 aus S. cerevisiae gab es keine Studien zu eukaryotischen Mitgliedern dieser großen Familie von Membranproteinen. Anhand NIC1 wurden heterologe Expressionssysteme zur funktionellen Charakterisierung von MATE-Proteinen aus Pflanzen etabliert. <p> Die cDNA von NIC1 wurde nach ihrer Klonierung in X. laevis Oozyten und S. cerevisiae exprimiert. In S. cerevisiae erhöhte die NIC1-Expression die Lithumtoleranz der Hefen und führte zu einer Verminderung der Natriumtoleranz. Parallele Versuche mit NIC2 und NIC4 (in den Diplomarbeiten von Blazej Dolniak und Mandy Kursawe) zeigten, dass auch diese beiden Proteine die Salztoleranz von S. cerevisiae beeinflussten. Während NIC2 die Lithium- und Natriumtoleranz erhöhte, führte NIC4-Expresion zu einer höheren Sensibilität gegenüber diesen beiden Kationen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der drei homologen Proteine zeigten sich auch bei ihrer Expression in X. laevis Oozyten. NIC1 induzierte in den Oozyten auswärts gerichtete Chloridströme, die spannungsabhängig waren und durch mikromolare Konzentrationen der trivalenten Kationen Lanthan oder Gadolinium inhibiert werden konnten. NIC4 induzierte Barium-inhibierbare Kaliumströme, die spannungsunabhängig waren. Für NIC2 ließ sich in diesem Expressionssystem keine Aktivität detektieren. <p> Zur Untersuchung der NIC1-Funktion in planta wurde die Genaktivität in transgenen Pflanzen lokalisiert und reduziert. Die NIC1-Genexpression war hauptsächlich in den vaskulären Geweben der Pflanze detektierbar und einer Verminderung des NIC1-Transkriptgehalts beeinflusste die Entwicklungsgeschwindigkeit der Pflanzen. Sie entwickelten sich deutlich langsamer als der parallel kultivierte Wildtyp. Der deutliche Phänotyp bei Veränderung der Genaktivität von nur einem der mindestens 56 vorhandenen MATE-Gene in A. thaliana zeigte, dass vermutlich keine weitere MATE-Isoform in der Lage ist, die Funktion von NIC1 zu übernehmen. / Gene expression analysis of the protein phosphatase (PP) genes, TOPP1, TOPP2, TOPP5, STH1 and STH2, of Arabidopsis thaliana was investigated in the first part of this thesis. All five genes encode PP of subgroups PP1 or PP2A. It was determined that homologous isoforms show individual and differing expression patterns. The PP-expression in guard cells was analysed further, because previous inhibitor studies showed an important influence of PP1/PP2A on signal transduction processes in these specialised cells. The previous studies had not addressed molecular identification of the inhibited PP1-/PP2A-subunits. This work demonstrates for the first time a preferential expression of a PP1 isoform, TOPP1, in guard cells. Further analysis of TOPP1, TOPP2 and TOPP5 gene expression also revealed isoform-specific expression patterns, suggesting non-redundant functions in planta. <p> Characterisation of the nearly identical PP2A-related genes, STH1 and STH2, also revealed individual expression patterns. An established screening approach (this work) for the identification of PP-genes from EF (epidermal fragments; a preparation enriched for guard cells) made it possible to distinguish the cDNAs of STH1 and STH2. The two genes form a subgroup of PP2A-related sequences. Differences in their expression patterns suggest that STH1 and STH2 have different functions in A. thaliana. <p> The analysis of plants with altered gene expression of TOPP2 and STH1 gave further insights into the roles of individual PP isoforms. The RNAi-mediated reduction of TOPP2-expression led to changed morphology of leaves, which showed curling and asymmetric development. The reason for this phenotype is probably due to changes of the cell cycle in certain parts of the leaf. Previous studies have already shown that heterologously expressed TOPP2 complements yeast cell cycle mutants. The selection and characterisation of plants with insertions in both STH1-allels revealed the individual roles of STH1 and STH2 in planta. Although STH2 was not affected, plants developed an extreme phenotype with reduced growth and altered leave shape. Previous studies with STH2 loss-of-function mutants did not show this morphology. <p> The second part of this thesis includes the identification and characterisation of a MATE (multidrug and toxic extrusion) membrane protein in plants. Described is NIC1, the first of at least 56 MATE proteins in A. thaliana. Indeed a study of the MATE protein, ERC1, of Saccharomyces cerevisiae was the only description of a eukaryotic member of this large family of membrane proteins.

Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2009.

Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2008.

Würzburg, Univ., Diss., 2008