Einleitung: Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) stellen das hauptsächliche Energiesubstrat für Wiederkäuer dar. In Anbetracht des - bedingt durch höhere Milch-, Mast und Reproduktionsleistung - steigenden Energiebedarfs von Hauswiederkäuern wie Milchkuh und Mastbulle ist es von zentraler Bedeutung, die Mechanismen zur Resorption dieser Energielieferanten bzw. Ansatzpunkte für die Beeinflussung dieser Transportprozesse genau zu kennen. Dieses Wissen kann möglicherweise dabei helfen, zukünftig die Energieaufnahme der Tiere zu unterstützen bzw. sogar effizienter zu gestalten. Ziele der Untersuchungen: Deshalb war es Ziel der vorliegenden Arbeit, die Mechanismen zur Resorption von SCFA zu charakterisieren, wobei der Schwerpunkt auf den Transport aus den Pansenepithelzellen ins Blut gelegt wurde, da hierzu im Gegensatz zu ihrer Aufnahme aus dem Pansenlumen in die Epithelzellen noch sehr wenig bekannt war. In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, inwiefern die nachgewiesenen Mechanismen einer Regulation unterliegen und über welche Signalwege diese vermittelt werden könnte. Materialien und Methoden: Zur Charakterisierung der beteiligten Resorptionsmechanismen wurden Epithelstücke aus dem ventralen Pansensack von Schafen in Ussing-Kammern eingespannt und mit Hilfe radioaktiv markierten Azetats, Butyrats und L-Laktats der Transport dieser Substrate unter verschiedenen Bedingungen sowie verschiedenen Hemmstoffeinflüssen untersucht. Zur Charakterisierung regulativer Einflüsse wurden die Epithelstücke über sechs bzw. 24 Stunden mit Butyrat inkubiert und anschließend RNA bzw. Totalprotein extrahiert. Hiermit konnten Veränderungen in mRNA- und Proteinexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bzw. Western Blot nachgewiesen werden. Ergebnisse: Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit konnten zeigen, dass der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels hauptsächlich proteinvermittelt erfolgt. Eine signifikante Beteiligung lipophiler Diffusion, d.h. ein passiver Transport, kann weitgehend ausgeschlossen werden. Der aktive Transport wies eine bikarbonatabhängige und eine bikarbonatunabhängige Komponente auf. Der Einsatz von Hemmstoffen verschiedener Transportproteine ergab deutliche Hinweise darauf, dass der Monocarboxylattransporter (MCT) 1 eine Rolle beim bikarbonatgekoppelten Transport von Azetat bzw. allgemein unmetabolisierten SCFA spielt. Diese Hinweise wurden untersetzt durch die Beobachtung, dass MCT 1, aber auch der apikal bzw. intrazellulär lokalisierte MCT 4 durch langfristige Inkubation des Epithels mit Butyrat sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene signifikant erhöht exprimiert wurden, was als Anpassungsreaktion an eine Substratakkumulation interpretiert werden kann. Außerdem wurde auch die mRNA-Expression des Putativen Anionentransporters (PAT) 1 durch Inkubation mit Butyrat erhöht, was für eine Beteiligung auch dieses Transportproteins am SCFA-Transport über das Pansenepithel spricht. Allerdings ist im Gegensatz zu MCT 1 die Lokalisation des PAT 1 in der basolateralen Membran noch fraglich. Die Expressionssteigerung von Zielgenen des Nukleären Faktors ĸB und des Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptors α sowie des Hypoxie-induzierbaren Faktors selbst deuten weiterhin darauf hin, dass die Steigerung der Transportkapazitäten von MCT 1 und 4 und auch PAT 1 über diese Signalwege vermittelt wird. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels näher charakterisiert werden, sodass es nun möglich ist, zusammen mit den bereits vorliegenden Befunden für die apikale Membran ein komplettes Modell dafür zu erstellen. Auch wurden Erkenntnisse zu regulativen Einflüssen auf diesen Transport gewonnen, die es zukünftig ermöglichen könnten, die Resorption der SCFA aus dem Pansen nutritiv oder eventuell pharmakologisch zu beeinflussen. / Introduction: The main energy source for ruminants are short chain fatty acids (SCFA). Considering the ever increasing energy requirements of cattle due to increasing milk yield and meat production, it is crucial to identify the mechanisms for the resorption of these energy sources as well as possibilities to influence these transport mechanisms. This knowledge could help support the animals’ energy uptake or even making it more efficient. Aim: Thus, the aim of the present study was to characterise mechanisms for the resorption of SCFA focusing on their transport from the epithelial cells into the blood. In particular, since – compared to the research findings on the uptake of SCFA from ruminal lumen into the cells – so far only very little was known regarding this side of the epithelium. In a second step, the study aimed to elucidate whether the mechanisms observed are subject to regulatory processes and which signalling pathways are involved. Materials and methods: To characterise the transport mechanisms involved, epithelial pieces from the ventral sac of ovine rumen were mounted in Ussing chambers. Using radioactively labelled acetate, butyrate and L-lactate, the transport of these substrates was investigated under different conditions and by applying different inhibitors for potential SCFA transport proteins. To characterise regulatory influences, epithelial pieces were incubated with butyrate for six and 24 hours, respectively. Subsequently, total RNA and protein were extracted to detect changes in mRNA and protein expression using quantitative real time PCR and western blot, respectively. Results: The present study could show that transport of SCFA across the basolateral membrane of rumen epithelium is mainly realised by protein-mediated mechanisms. A significant participation of lipophilic diffusion, i.e. a passive transport, can almost entirely be excluded. The active transport could be divided into a bicarbonate-dependent and a bicarbonate-independent part. The experiments with inhibitors of different transport proteins showed clear evidence of an involvement of monocarboxylate transporter (MCT) 1 in the bicarbonate-dependent transport of acetate and non-metabolised SCFA in general. This evidence was supported by the finding that the expression of MCT 1 but also of the apically and intracellularly localised MCT 4 was increased significantly on both mRNA- and protein-level after long-term incubation of the epithelium with butyrate. This can be interpreted as an adaptation to a substrate accumulation. Additionally, butyrate incubation led to an increased mRNA expression of putative anion transporter (PAT) 1, which makes an involvement of this transport protein in SCFA transport across ruminal epithelium likely as well. However, in contrast to MCT 1 the localisation of PAT 1 in the basolateral membrane is still questionable. The increased expression of target genes of nuclear factor ĸB and peroxisome-proliferator activated receptor α as well as of hypoxia inducible factor strongly point to an involvement of these pathways in the increased expression of MCT 1 and 4 as well as PAT 1. Conclusions: In summary, this study could characterise the transport of SCFA across the basolateral membrane of ruminal epithelium in detail for the first time. This enables us to draw a complete model of ruminal SCFA transport. Also, evidence for regulatory influence on this transport processes was found, perhaps making it possible to influence resorption of SCFA from rumen by nutritive or pharmacological means in the future.

Einleitung: Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) stellen das hauptsächliche Energiesubstrat für Wiederkäuer dar. In Anbetracht des - bedingt durch höhere Milch-, Mast und Reproduktionsleistung - steigenden Energiebedarfs von Hauswiederkäuern wie Milchkuh und Mastbulle ist es von zentraler Bedeutung, die Mechanismen zur Resorption dieser Energielieferanten bzw. Ansatzpunkte für die Beeinflussung dieser Transportprozesse genau zu kennen. Dieses Wissen kann möglicherweise dabei helfen, zukünftig die Energieaufnahme der Tiere zu unterstützen bzw. sogar effizienter zu gestalten. Ziele der Untersuchungen: Deshalb war es Ziel der vorliegenden Arbeit, die Mechanismen zur Resorption von SCFA zu charakterisieren, wobei der Schwerpunkt auf den Transport aus den Pansenepithelzellen ins Blut gelegt wurde, da hierzu im Gegensatz zu ihrer Aufnahme aus dem Pansenlumen in die Epithelzellen noch sehr wenig bekannt war. In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, inwiefern die nachgewiesenen Mechanismen einer Regulation unterliegen und über welche Signalwege diese vermittelt werden könnte. Materialien und Methoden: Zur Charakterisierung der beteiligten Resorptionsmechanismen wurden Epithelstücke aus dem ventralen Pansensack von Schafen in Ussing-Kammern eingespannt und mit Hilfe radioaktiv markierten Azetats, Butyrats und L-Laktats der Transport dieser Substrate unter verschiedenen Bedingungen sowie verschiedenen Hemmstoffeinflüssen untersucht. Zur Charakterisierung regulativer Einflüsse wurden die Epithelstücke über sechs bzw. 24 Stunden mit Butyrat inkubiert und anschließend RNA bzw. Totalprotein extrahiert. Hiermit konnten Veränderungen in mRNA- und Proteinexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bzw. Western Blot nachgewiesen werden. Ergebnisse: Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit konnten zeigen, dass der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels hauptsächlich proteinvermittelt erfolgt. Eine signifikante Beteiligung lipophiler Diffusion, d.h. ein passiver Transport, kann weitgehend ausgeschlossen werden. Der aktive Transport wies eine bikarbonatabhängige und eine bikarbonatunabhängige Komponente auf. Der Einsatz von Hemmstoffen verschiedener Transportproteine ergab deutliche Hinweise darauf, dass der Monocarboxylattransporter (MCT) 1 eine Rolle beim bikarbonatgekoppelten Transport von Azetat bzw. allgemein unmetabolisierten SCFA spielt. Diese Hinweise wurden untersetzt durch die Beobachtung, dass MCT 1, aber auch der apikal bzw. intrazellulär lokalisierte MCT 4 durch langfristige Inkubation des Epithels mit Butyrat sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene signifikant erhöht exprimiert wurden, was als Anpassungsreaktion an eine Substratakkumulation interpretiert werden kann. Außerdem wurde auch die mRNA-Expression des Putativen Anionentransporters (PAT) 1 durch Inkubation mit Butyrat erhöht, was für eine Beteiligung auch dieses Transportproteins am SCFA-Transport über das Pansenepithel spricht. Allerdings ist im Gegensatz zu MCT 1 die Lokalisation des PAT 1 in der basolateralen Membran noch fraglich. Die Expressionssteigerung von Zielgenen des Nukleären Faktors ĸB und des Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptors α sowie des Hypoxie-induzierbaren Faktors selbst deuten weiterhin darauf hin, dass die Steigerung der Transportkapazitäten von MCT 1 und 4 und auch PAT 1 über diese Signalwege vermittelt wird. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals der Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels näher charakterisiert werden, sodass es nun möglich ist, zusammen mit den bereits vorliegenden Befunden für die apikale Membran ein komplettes Modell dafür zu erstellen. Auch wurden Erkenntnisse zu regulativen Einflüssen auf diesen Transport gewonnen, die es zukünftig ermöglichen könnten, die Resorption der SCFA aus dem Pansen nutritiv oder eventuell pharmakologisch zu beeinflussen.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für Wiederkäuer 3 2.2 Metabolismus von SCFA im Pansenepithel 4 2.2.1 Aufrechterhaltung des Konzentrationsgradienten vom Pansenlumen ins Epithel 4 2.2.2 Produktion von HCO3- aus CO2 durch die Carboanhydrase 5 2.2.3 Bereitstellung von Energie für die Epithelzellen 5 2.2.4 Bereitstellung von wasserlöslichen, glukosesparenden Energiesubstraten für die periphere Zirkulation 5 2.2.5 Verhinderung möglicher Schädigungen durch Butyrat 6 2.3 Transportmechanismen für kurzkettige Fettsäuren 7 2.3.1 Para- versus transzelluläre Resorption 7 2.3.2 Transzelluläre Resorption mittels lipophiler Diffusion 7 2.3.3 Proteinvermittelte SCFA-Permeation 9 2.3.4 Permeation von SCFA aus dem Epithel ins Blut 11 2.4 Beeinflussung der SCFA-Resorption auf Genexpressionsebene 17 2.4.1 Beeinflussung der Genexpression durch Butyrat 17 2.4.2 Beeinflussung der Genexpression durch Hypoxie 20 2.4.3 Mechanismen für die Regulation der Genexpression durch Butyrat (-Metaboliten) und Hypoxie 21 2.5 Fragestellungen dieser Arbeit 26 3 Ergebnisse 28 3.1 Publikation 1 28 3.2 Publikation 2 41 4 Diskussion 54 4.1 Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels 54 4.1.1 Transport mittels lipophiler Diffusion 57 4.1.2 SCFA werden bevorzugt über die basolaterale Membran transportiert 58 4.1.3 SCFA(-Metaboliten) werden bikarbonatabhängig über die basolaterale Membran transportiert 59 4.1.4 SCFA(-Metaboliten) werden durch einen Anionenaustauschmechanismus ins Blut ausgeschleust 61 4.1.5 Azetat wird durch einen pHMB- und CHC-sensitiven Mechanismus transportiert 63 4.2 Der Transport von SCFA über das Pansenepithel unterliegt regulativen Einflüssen 68 4.2.1 Einfluss von Butyrat(-Metaboliten) auf die Expression von potentiellen SCFA Transportern 68 4.2.2 Mechanismen für die Regulation der Expression durch Butyrat(-Metaboliten) 72 4.3 Theoretisches Modell des SCFA-Transports und dessen Regulation auf Genexpressionsebene auf Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit 74 5 Zusammenfassung 76 6 Summary 78 7 Literaturverzeichnis 80 Danksagung 98 / Introduction: The main energy source for ruminants are short chain fatty acids (SCFA). Considering the ever increasing energy requirements of cattle due to increasing milk yield and meat production, it is crucial to identify the mechanisms for the resorption of these energy sources as well as possibilities to influence these transport mechanisms. This knowledge could help support the animals’ energy uptake or even making it more efficient. Aim: Thus, the aim of the present study was to characterise mechanisms for the resorption of SCFA focusing on their transport from the epithelial cells into the blood. In particular, since – compared to the research findings on the uptake of SCFA from ruminal lumen into the cells – so far only very little was known regarding this side of the epithelium. In a second step, the study aimed to elucidate whether the mechanisms observed are subject to regulatory processes and which signalling pathways are involved. Materials and methods: To characterise the transport mechanisms involved, epithelial pieces from the ventral sac of ovine rumen were mounted in Ussing chambers. Using radioactively labelled acetate, butyrate and L-lactate, the transport of these substrates was investigated under different conditions and by applying different inhibitors for potential SCFA transport proteins. To characterise regulatory influences, epithelial pieces were incubated with butyrate for six and 24 hours, respectively. Subsequently, total RNA and protein were extracted to detect changes in mRNA and protein expression using quantitative real time PCR and western blot, respectively. Results: The present study could show that transport of SCFA across the basolateral membrane of rumen epithelium is mainly realised by protein-mediated mechanisms. A significant participation of lipophilic diffusion, i.e. a passive transport, can almost entirely be excluded. The active transport could be divided into a bicarbonate-dependent and a bicarbonate-independent part. The experiments with inhibitors of different transport proteins showed clear evidence of an involvement of monocarboxylate transporter (MCT) 1 in the bicarbonate-dependent transport of acetate and non-metabolised SCFA in general. This evidence was supported by the finding that the expression of MCT 1 but also of the apically and intracellularly localised MCT 4 was increased significantly on both mRNA- and protein-level after long-term incubation of the epithelium with butyrate. This can be interpreted as an adaptation to a substrate accumulation. Additionally, butyrate incubation led to an increased mRNA expression of putative anion transporter (PAT) 1, which makes an involvement of this transport protein in SCFA transport across ruminal epithelium likely as well. However, in contrast to MCT 1 the localisation of PAT 1 in the basolateral membrane is still questionable. The increased expression of target genes of nuclear factor ĸB and peroxisome-proliferator activated receptor α as well as of hypoxia inducible factor strongly point to an involvement of these pathways in the increased expression of MCT 1 and 4 as well as PAT 1. Conclusions: In summary, this study could characterise the transport of SCFA across the basolateral membrane of ruminal epithelium in detail for the first time. This enables us to draw a complete model of ruminal SCFA transport. Also, evidence for regulatory influence on this transport processes was found, perhaps making it possible to influence resorption of SCFA from rumen by nutritive or pharmacological means in the future.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für Wiederkäuer 3 2.2 Metabolismus von SCFA im Pansenepithel 4 2.2.1 Aufrechterhaltung des Konzentrationsgradienten vom Pansenlumen ins Epithel 4 2.2.2 Produktion von HCO3- aus CO2 durch die Carboanhydrase 5 2.2.3 Bereitstellung von Energie für die Epithelzellen 5 2.2.4 Bereitstellung von wasserlöslichen, glukosesparenden Energiesubstraten für die periphere Zirkulation 5 2.2.5 Verhinderung möglicher Schädigungen durch Butyrat 6 2.3 Transportmechanismen für kurzkettige Fettsäuren 7 2.3.1 Para- versus transzelluläre Resorption 7 2.3.2 Transzelluläre Resorption mittels lipophiler Diffusion 7 2.3.3 Proteinvermittelte SCFA-Permeation 9 2.3.4 Permeation von SCFA aus dem Epithel ins Blut 11 2.4 Beeinflussung der SCFA-Resorption auf Genexpressionsebene 17 2.4.1 Beeinflussung der Genexpression durch Butyrat 17 2.4.2 Beeinflussung der Genexpression durch Hypoxie 20 2.4.3 Mechanismen für die Regulation der Genexpression durch Butyrat (-Metaboliten) und Hypoxie 21 2.5 Fragestellungen dieser Arbeit 26 3 Ergebnisse 28 3.1 Publikation 1 28 3.2 Publikation 2 41 4 Diskussion 54 4.1 Transport von SCFA über die basolaterale Membran des Pansenepithels 54 4.1.1 Transport mittels lipophiler Diffusion 57 4.1.2 SCFA werden bevorzugt über die basolaterale Membran transportiert 58 4.1.3 SCFA(-Metaboliten) werden bikarbonatabhängig über die basolaterale Membran transportiert 59 4.1.4 SCFA(-Metaboliten) werden durch einen Anionenaustauschmechanismus ins Blut ausgeschleust 61 4.1.5 Azetat wird durch einen pHMB- und CHC-sensitiven Mechanismus transportiert 63 4.2 Der Transport von SCFA über das Pansenepithel unterliegt regulativen Einflüssen 68 4.2.1 Einfluss von Butyrat(-Metaboliten) auf die Expression von potentiellen SCFA Transportern 68 4.2.2 Mechanismen für die Regulation der Expression durch Butyrat(-Metaboliten) 72 4.3 Theoretisches Modell des SCFA-Transports und dessen Regulation auf Genexpressionsebene auf Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit 74 5 Zusammenfassung 76 6 Summary 78 7 Literaturverzeichnis 80 Danksagung 98

Einleitung: Ruminal werden Futterpflanzen zu kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) abgebaut. Diese bilden die Hauptenergiequelle für den Wiederkäuerorganismus. Da diese Fettsäuren jedoch auch maßgeblich die pH-Homöostase der Vormagenschleimhaut beeinflussen, muss das Pansenepithel in der Lage sein, Änderungen im Substrat- und Protonenangebot festzustellen und anschließend regulative Prozesse anzupassen, um Stoffwechselentgleisungen und so auch einer Pansenazidose vorzubeugen. In anderen Spezies erwiesen sich sogenannte „Freie Fettsäurerezeptoren“ (FFARs) als potenzielle Sensoren veränderter SCFA-Mengen im Darmlumen, die u. a. durch Modulation der intrazellulären Spiegel an zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) ihre Wirkung vermitteln. Ziele der Untersuchungen: Es sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob FFARs im Pansenepithel des Schafes vorkommen und durch SCFAs aktiviert sowie intrazelluläre Signalwege über cAMP moduliert werden können. Im Anschluss sollte erarbeitet werden, inwiefern der nachgewiesene Einfluss von Butyrat auf die epithelialen cAMP-Spiegel Auswirkungen auf die epitheliale pH-Modulation infolge einer veränderten Aktivität von Monocarboxylattransportern (MCTs) und Na+/H+-Austauschern (NHEs) hat. Tiere, Material und Methoden: Sämtliche Untersuchungen wurden an Geweben des Vormagens von Schafen (Ovis gmelini aries) durchgeführt. Mittels Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und immunhistochemischer Färbungen wurde das Vorliegen verschiedener FFARs in nativem Pansengewebe untersucht. Zur funktionellen Charakterisierung wurden Epithelstücke aus dem ventralen Pansensack in Ussing-Kammern inkubiert und anschließend die cAMP-Spiegel im Epithel mittels einer quantitativen, kompetitiven Analyse bestimmt. Dabei wurde der Einfluss von Forskolin (ein Stimulator der cAMP-synthetisierenden Adenylylzyklasen), von Butyrat sowie von Niacin (ein FFAR-Agonist) betrachtet. Mithilfe von radioaktiv markiertem Azetat wurde der Effekt variierender cAMP-Spiegel auf die Transportaktivität von MCTs unter Zuhilfenahme von zwei verschiedenen MCT-Hemmstoffen (Cyanohydroxyzimtsäure und p-Hydroxymercuribenzoesäure) in Ussing-Kammern evaluiert. Die Aktivität der NHEs wurde an kultivierten Pansenepithelzellen durch Messung des intrazellulären pH-Wertes mittels Spektrofluorometrie unter Einfluss des NHE-Inhibitors 5-N-Ethyl-N-Isopropyl Amilorid ermittelt. Auch hierbei wurden in den Zellen unterschiedliche cAMP-Spiegel durch Forskolin-Applikation induziert. Die Daten der verschiedenen Untersuchungen wurden an 5-8 Tieren je Versuchsansatz erhoben. Die Normalverteilung wurde mittels Kolmogorov–Smirnov-Test ermittelt. Ein Friedman-Test mit anschließendem Dunn-Test wurde für die Analyse der cAMP-Experimente genutzt. MCT und NHE Experimente wurden mithilfe einer einfachen, geblockten Varianzanalyse und anschließendem Tukey-Test ausgewertet. Ergebnisse: Die FFARs GPR109A und FFAR2 konnten an allen untersuchten Lokalisationen (Netzmagen, Pansenvorhof, dorsaler und ventraler Pansensack, Psalter) über RT-PCR bzw. im ventralen Pansensack auch über die immunhistochemischen Färbungen detektiert werden, wohingegen FFAR3 lediglich als mRNA im Vorhof nachweisbar war. Dies lässt die beiden Rezeptoren GPR109A und FFAR2 als mögliche Strukturen zur Detektion von SCFAs im Pansenepithel erscheinen. Die Analyse der intrazellulären cAMP-Spiegel in Epithelien aus dem ventralen Pansensack konnte einen hemmenden Einfluss von Butyrat auf diesen Botenstoff darlegen, was auf eine Beteiligung der genannten FFARs hindeutet. Die Applikation des GPR109A-Agonisten Niacin hatte jedoch keinen Effekt auf die cAMP-Spiegel, sodass eine Wirkungsvermittlung von Butyrat über diesen Rezeptor unwahrscheinlich scheint. Mit Blick auf die funktionellen Auswirkungen dieser cAMP-Modulation hatten variierende cAMP-Level im Kontrast zu Erkenntnissen aus Nicht-Wiederkäuerspezies keinen Einfluss auf die Transportaktivität des ruminalen MCT1 unter den gewählten in vitro-Versuchsbedingungen. Andererseits konnte die Regulation des intrazellulären pH-Wertes von kultivierten Pansenepithelzellen tendenziell durch erhöhte cAMP-Spiegel gehemmt werden, was auf einer Hemmung von NHEs durch den second messenger beruhen könnte. Schlussfolgerungen: Die Expression von GPR109A und FFAR2 lassen diese zwei FFARs als potenzielle Sensoren der intraruminalen bzw. intraepithelialen Nährstoffkonditionen erscheinen. Dabei deuten die vorliegenden Untersuchungen auf eine Aktivierung des FFAR2 durch Butyrat und dessen Metaboliten in den basalen Schichten des Pansenepithels hin. Infolge der Rezeptoraktivierung kommt es vermutlich zu einer Verminderung der intraepithelialen cAMP-Spiegel, welche wiederum einen (schwachen) Einfluss auf die Regulation des intrazellulären pH-Wertes mithilfe von NHEs zu haben scheinen. Entgegen unserer Ausgangshypothese scheinen aber die FFARs des ovinen Pansenepithels die pH-Homöostase des Epithels nur geringfügig zu beeinflussen. Ihre genaue physiologische Bedeutung – insbesondere des GPR109A – bleibt somit noch spekulativ.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für den Wiederkäuer 3 2.2 Transport kurzkettiger Fettsäuren über das Pansenepithel 3 2.2.1 Apikale Aufnahme in das Pansenepithel 4 2.2.2 Basolaterale Ausschleusung in den Blutstrom 6 2.3 Metabolisierung kurzkettiger Fettsäuren im Pansenepithel 8 2.4 pH-Homöostase 9 2.4.1 pH-Regulation des Pansenlumens 9 2.4.2 pH-Regulation des Pansenepithels 10 2.5 Anpassungsmechanismen des Pansenepithels 12 2.6 Rolle des Butyrats 15 2.7 Fettsäurerezeptoren 16 2.7.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 17 2.7.2 GPRs für SCFAs 17 2.7.2.1 FFAR2 17 2.7.2.2 FFAR3 18 2.7.2.3 GPR109A 19 2.7.3 FFARs im Wiederkäuerorganismus 20 2.8 Monocarboxylattransporter 22 2.8.1 Die Familie der MCTs 22 2.8.2 Regulation der MCTs 23 2.8.3 MCTs im Pansenepithel 24 2.9 Natrium-Protonen-Austauscher 26 2.9.1 Die Familie der NHEs 26 2.9.2 Regulation der NHEs 27 2.9.3 NHEs im Pansenepithel 28 2.10 Fragestellungen der vorliegenden Arbeit 30 3 Publikationen 32 3.1 Publikation 1 32 3.2 Publikation 2 41 3.2.1 Supporting Information 56 4 Diskussion 57 4.1 Nachweis von FFARs im Pansenepithel 57 4.1.1 Regulation intrazellulärer Signalwege durch FFARs 59 4.1.2 GPR109A als potenzieller Butyrat-Rezeptor im Pansenepithel 62 4.1.3 FFAR2 als potenzieller Rezeptor für Butyrat 63 4.2 Seitenabhängigkeit der Butyrat-Effekte 64 4.3 pH-Abhängigkeit der cAMP-Spiegel 66 4.4 Einfluss von cAMP auf die Aktivität der MCTs 68 4.5 Einfluss von cAMP auf die NHE-Aktivität 70 4.6 Schlussfolgerungen 73 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 8 Anhang 101 8.1 Im Rahmen dieser Dissertation gehaltene Präsentationen 101 Danksagung 103 / Introduction: Forage plants are ruminally degraded to short chain fatty acids (SCFAs). These serve as the main energy source for ruminants. As SCFAs also influence the pH-homeostasis of the ruminal mucosa, the epithelium must be able to detect changes of both substrate and proton accumulation and adapt transport processes accordingly, in order to prevent metabolic dysfunction and thus the risk of ruminal acidosis. Studies in non-ruminant species detected so-called ‘free fatty acid receptors’ (FFARs) as potential SCFA-sensors in the gut lumen. It has been shown that these receptors transduce their information by modulation of intracellular levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Aim: This study intended to investigate if FFARs are located in the ovine ruminal epithelium. It should further be evaluated if FFARs can be stimulated by SCFAs leading to a modulation of intracellular pathways via cAMP. Finally, the study aimed to elucidate the influence of low epithelial cAMP-levels after butyrate application on the regulation of pH-homeostasis in the ruminal epithelium by modulating the activity of transport proteins such as monocarboxylate transporters (MCTs) and Na+/H+ exchangers (NHEs). Animals, material, and methods: All experiments were conducted with ovine (Ovis aries) ruminal tissues. The expression of different FFARs was investigated in native tissues using a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical staining. For functional analysis, epithelial cAMP levels were determined by a quantitative and competitive assay after incubation of epithelia of the ruminal ventral sac in Ussing chambers. The influence of forskolin (a stimulator of the adenylyl cyclases), butyrate, as well as niacin (an FFAR agonist) was evaluated. Further, the effect of varying cAMP levels on transport activity of MCTs was characterised on Ussing chamber-mounted epithelia with radioactively labelled acetate and two MCT inhibitors (cyano-hydroxycinnamic acid and p-hydroxymercuribenzoic acid). Finally, the activity of NHEs was assessed in cultured ruminal epithelial cells. The intracellular pH was evaluated by spectrofluorometry while the cells were incubated with forskolin (to modify intracellular cAMP levels) or the NHE inhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride. The data for the different set-ups were acquired from 5-8 animals each. Kolmogorov–Smirnov test was used for testing normality. For cAMP level analyses, the Friedman test followed by Dunn's test was performed. MCT and NHE measurements were analysed using one-way randomized block analysis of variance followed by Tukey's test. Results: GPR109A and FFAR2 were detected in all ovine ruminal epithelia examined (reticulum, atrium ruminis, ruminal ventral and dorsal sac, omasum) by RT-PCR and in ruminal ventral sac also by immunohistochemical staining. FFAR3, however, was detected solely on mRNA level in tissues of the ovine atrium ruminis. Thus, the two immunohistochemically detected receptors may serve as potential sensors for SCFAs in the ruminal epithelium. The analysis of intraepithelial cAMP levels revealed an inhibiting influence of butyrate application on cAMP pointing to an activation of FFARs by this SCFA. Nonetheless, the incubation with the GPR109A agonist niacin did not show any effect on cAMP levels. This finding contradicts the theory of an activation of GPR109A by butyrate. Looking at functional consequences of varying cAMP levels, in contrast to studies on non-ruminant species ruminal MCT1 activity was not influenced by different cAMP levels, at least under the conditions chosen in this in vitro study. However, regulation of intracellular pH in cultured ruminal epithelial cells tended to decrease with augmented cAMP levels. This might be mediated by an inhibition of NHEs. Conclusions: The expression of GPR109A and FFAR2 points at a participation of these receptors in sensing intraruminal and intraepithelial energy status. The present data hint at an activation of FFAR2 by butyrate or its metabolites in the basal layers of the epithelium. Activation of the receptor leads to decreased cAMP levels. This in turn seems to slightly modify the regulation of intracellular pH via NHEs. Contradicting our initial hypothesis, ovine ruminal FFARs seem to play only a minor role in modulation of epithelial pH homeostasis. The main physiological role of ruminal FFARs – especially of GPR109A – remains to be clarified.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung kurzkettiger Fettsäuren für den Wiederkäuer 3 2.2 Transport kurzkettiger Fettsäuren über das Pansenepithel 3 2.2.1 Apikale Aufnahme in das Pansenepithel 4 2.2.2 Basolaterale Ausschleusung in den Blutstrom 6 2.3 Metabolisierung kurzkettiger Fettsäuren im Pansenepithel 8 2.4 pH-Homöostase 9 2.4.1 pH-Regulation des Pansenlumens 9 2.4.2 pH-Regulation des Pansenepithels 10 2.5 Anpassungsmechanismen des Pansenepithels 12 2.6 Rolle des Butyrats 15 2.7 Fettsäurerezeptoren 16 2.7.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 17 2.7.2 GPRs für SCFAs 17 2.7.2.1 FFAR2 17 2.7.2.2 FFAR3 18 2.7.2.3 GPR109A 19 2.7.3 FFARs im Wiederkäuerorganismus 20 2.8 Monocarboxylattransporter 22 2.8.1 Die Familie der MCTs 22 2.8.2 Regulation der MCTs 23 2.8.3 MCTs im Pansenepithel 24 2.9 Natrium-Protonen-Austauscher 26 2.9.1 Die Familie der NHEs 26 2.9.2 Regulation der NHEs 27 2.9.3 NHEs im Pansenepithel 28 2.10 Fragestellungen der vorliegenden Arbeit 30 3 Publikationen 32 3.1 Publikation 1 32 3.2 Publikation 2 41 3.2.1 Supporting Information 56 4 Diskussion 57 4.1 Nachweis von FFARs im Pansenepithel 57 4.1.1 Regulation intrazellulärer Signalwege durch FFARs 59 4.1.2 GPR109A als potenzieller Butyrat-Rezeptor im Pansenepithel 62 4.1.3 FFAR2 als potenzieller Rezeptor für Butyrat 63 4.2 Seitenabhängigkeit der Butyrat-Effekte 64 4.3 pH-Abhängigkeit der cAMP-Spiegel 66 4.4 Einfluss von cAMP auf die Aktivität der MCTs 68 4.5 Einfluss von cAMP auf die NHE-Aktivität 70 4.6 Schlussfolgerungen 73 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 8 Anhang 101 8.1 Im Rahmen dieser Dissertation gehaltene Präsentationen 101 Danksagung 103